慢性门脉高压鼠胃微血管扩张与粘膜细胞动力学的关系
作者：武永忠 吴金生 赖大年 马庆久 何泽生 高德明
单位：
关键词：乙型肝炎/并发症；肝硬化/免疫学；肝/病理生理学；白细胞介素2/免疫学；受体，白细胞介素2/免疫学
华人消化杂志980908Relationship between ectasias in gastric microvascular system and cytokinetics in gastric mucous epithelial cell group in PHG-MH rats
WU Yong-Zhong, WU Jin-Sheng, LAI Da-Nian, MA Qing-Jiu, HE Ze-Sheng and GAO De-Ming
Department of General Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China
, http://www.100md.com
Subject headings hepatitis B/complication; liver cirrhosis/immunology; liver/physiopathology; interleukin-2/immunology; receptors, interleukin-2/immunology
Abstract
AIM To investigate the relationship between ectasias of the gastric microvascular system (GMS) and cytokinetics of the gastric mucous epithelial cell group (GMECG) during the development of portal hypertensive gastropathy and mucosal hemorrhage (PHG-MH) in rats.
, 百拇医药
METHODS PHG-MH was prepared by starvation in rats with liver cirrhosis and portal hypertention induced by abdominal injection of 30?g/?L thioacetamide. Morphological measurement and autoradiography were employed in PHG-MH rats in two stages to observe the changes of the morphology in GMS and of the labelling index (LI) in GMECG.
RESULTS ①The bleeding rate (91.2%) and severity (grade, 2.27±0.20) in PHG-MH rats were more significant than that in control group (P<0.01). With the development of portal hypertension, the bleeding rate and severity increased significantly both in PHG-MH-Ⅰ and in PHG-MH-Ⅱ rats (P<0.05 or P<0.01). ②DGMM and PSmVD were significantly increased both in PHG-MH (40.1?μm±3.0?μm, P<0.05; and 0.50±0.03，P<0.01) and in PHG-MH-Ⅱ rats (43.8?μm±4.20?μm, P<0.05; and 0.564±0.042, P<0.01), but were not in PHG-MH-Ⅰ rats (P>0.05). Furthmore, PSmVD in PHG-MH-Ⅱ rats was significantly larger than that in PHG-MH-Ⅰ rats (P<0.05). ③M-LI(11.7%±1.0%) and B-LI (10.6%±0.9%) were decreased obviously in PHG-MH rats (P<0.05，vs control). With the development of portal hypertension, M-LI, B-LI, Bs-LI and Bb-LI were all decreased significantly in PHG-MH-Ⅱ rats (P<0.05 or P<0.01), but were not in PHG-MH-Ⅰ rats, respectively. ④Submucosal thickness (SmT) in PHG-MH rats were increased markedly (P<0.01). ⑤There was a negative relation among LI, PSmVD, DGMM and SmT in PHG-MH.
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CONCLUSION One of the bleeding mechanisms for ectasias and congestion in GMS is the lower status of cytokinetics in GMECG. It occurred mainly in a relative later stage of portal hypertensive gastropathy.
主题词 乙型肝炎/并发症；肝硬化/免疫学；肝/病理生理学；白细胞介素2/免疫学；受体，白细胞介素2/免疫学
摘 要
目的 探讨慢性型门脉高压条件下胃微血管系统扩张瘀血与粘膜上皮细胞群体(GMECG)增殖动力学状态的关系.
方法 用30?g/?L硫代乙酰胺腹部sc法诱导大鼠慢性肝损害肝硬变及门脉高压，继用饥饿诱导法使大鼠发生门脉高压性胃粘膜出血(PHG-MH，n=34)，用形态测量法及微观放射自显影技术分期观察(注药45?d，PHT-MH-Ⅰ，n=14；注药65?d，PHT-MH-Ⅱ，n=20)模型鼠的胃粘膜微血管直径(DGMM)、粘膜下小静脉管径比(PSmVD)、粘膜下厚度(SmT)及粘膜上皮细胞群体标记指数(LI)的变化.
, 百拇医药
结果 ①PHG-MH鼠出血率(91.2%)及严重性分级(2.27±0.20级)均大于对照(P<0.01)，分期观察出血率(85.7%和95.0%)及严重性分级(1.79±0.03级和2.60±0.25级)均大于对照(P<0.05和P<0.01). ②PHG-MH鼠DGMM(40.1?μm±3.0?μm)、PSmVD(0.50±0.03)均大于对照(P<0.05和P<0.01). 分期观察PHG-MH-Ⅰ鼠DGMM和PSmVD未达显著水平；而PHG-MH-Ⅱ鼠DGMM(43.8?μm±4.20?μm)、严重性分级(2.60±0.25级)和PSmVD(0.57±0.04)均大于对照(P<0.05或P<0.01)，尤其PSmVD大于PHG-MH-Ⅰ鼠(P<0.05). ③PHG-MH鼠的平均LI(11.7%±1.0%)及有出血鼠LI(10.6%±0.9%)均低于对照(P<0.05). 分期观察PHG-MH-Ⅰ鼠LI均未达显著水平，而PHG-MH-Ⅱ鼠平均LI(8.9%±1.0%)，有出血鼠LI(8.9%±1.0%)，出血灶局部LI(7.3%±1.0%)及周围未出血粘膜LI(10.4%±1.1%)均低于对照水平(P<0.05或P<0.01), ④PHG-MH鼠SmT及分期观察值均大于对照水平(P<0.01). ⑤LI与PSmVD，DGMM及SmT间均有显著负相关关系.
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结论 胃微血管扩张瘀血可降低GMECG的增殖活性，并主要发生在病程相对晚期，是引起胃粘膜损害性出血的机制之一.0 引言
门脉高压时胃粘膜上皮细胞群体(GMECG)增殖活性受到明显抑制，并与胃粘膜损害性出血的发生有极为密切的关系[1]. 我们曾推测门脉高压时胃微血管系统的普遍扩张瘀血可能影响粘膜上皮细胞物质代谢水平，使GMECG增殖活性降低而引起粘膜出血的发生. 我们对慢性型门脉高压条件下胃微血管扩张瘀血与GMECG增殖活性状态的关系进行初步观察，以探讨胃微血管扩张瘀血引起胃粘膜损害性出血的机制.
1 材料和方法
1.1 材料 门脉高压性胃病变及粘膜出血(PHG-MH)模型复制[2] 用30?g/?L硫代乙酰胺(中国医药公司北京采供站)腹部sc诱导大鼠慢性肝损害肝硬变及门脉高压性胃病变，继用饥饿诱导法使门脉高压大鼠发生胃粘膜出血，分为PHG-MH-Ⅰ(注药45?d,n=14)和PHG-MH-Ⅱ(注药65?d，n=20)两组. 设模拟注射加饥饿诱导作为对照. 观察粘膜出血情况，计算出血率(%)并按0～4级分法记录出血严重程度(级). 玻璃水柱法测门静脉压力(PVP)，换算为kPa表示.
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1.2 方法 ①胃微血管形态测量 新鲜未固定腺胃粘膜1?cm×1?cm，仿立体显微镜观察胃粘膜方法原理，于低倍光镜下(5×10)行粘膜微血管形态观察及测量，以粘膜微血管构型最大分支的直径代表粘膜微血管直径(DGMM，μm)，每个标本取2～3个构型的最大分支直径的平均值. 另取腺胃全层组织0.5?cm×0.5?cm，常规组织切片及染色，光镜下观察粘膜组织学，测量并计算粘膜下小静脉管径比(短径/?长径，PSmVD). 同时测量粘膜下厚度(SmT,μm). ②体外组织培养3H-TdR单标记微观放射自显影切片制备[1]新鲜腺胃粘膜0.5?cm×0.5?cm置于RPMI-1640 (Sigma)培养液中，加入3H-TdR(比放射性66.6×1019Bq/?mol，中国原子能科学研究院)，使其终浓度为3.7×108Bq/?L，pH 7.2～7.4，37℃恒温水浴搅拌孵育60min后，PBS缓冲液漂洗3次，Carnoy液固定后常规浸蜡切片(4?μm～5?μm)，凉干后暗室红光下涂L-4液体核乳胶(中国原子能科学研究院)，室温下避光凉干，暗盒内4℃曝光2?wk后，行显影(D-196)和定影(酸性坚膜定影液)处理及常规HE染色. 光镜下阅片计数标记细胞数，并计算胃粘膜上皮细胞标记指数(LI=标记细胞/?增殖区细胞总数×100%). 每个标本均测平均LI(M-LI). 有出血鼠同时测出血鼠LI(B-LI)、出血灶局部LI(Bs-LI)和出血灶周围LI(Bb-LI). 各指标取5～8次测量平均值.
, 百拇医药
统计学处理 出血率(%)用χ2检验，其余指标均表达为±s，行student t检验. P<0.05为差异显著，P<0.01为非常显著，P>0.05为无差异. M-LI与DGMM，PSmVD及SmT间行相关分析.
2 结果
2.1 PHG-MH复制 PHG-MH鼠出血率(91.2%)，严重性分级(2.27±0.02级)及PVP(1.63?kPa±0.03?kPa)均大于对照组(P<0.01)，并随门脉高压病程而发展. PHG-MH-Ⅰ鼠有85.7%发生1.79±0.03级出血(P<0.05). PHG-MH-Ⅱ鼠有95%发生2.60±0.25级出血(P<0.01). PHG-MH鼠SmT(139.74?μm±5.90?μm)及分期观察SmT(104.6?μm±8.4?μm和155.4?μm±6.6?μm)均大于对照(P<0.01)，尤其PHG-MH-Ⅱ鼠的SmT大于PHG-MH-Ⅰ鼠(P<0.05). 符合门脉高压性胃病变及粘膜出血特征.
, 百拇医药
2.2 微血管测量 PHG-MH鼠的DGMM及PSmVD均大于对照. 随着门脉高压病程进展，PHG-MH-Ⅰ鼠DGMM和PSmVD未达显著水平；而PHG-MH-Ⅱ鼠DGMM及PSmVD均大于对照，尤其PSmVD大于PHG-MH-Ⅰ鼠(表1). 表明胃微血管系统有普遍扩张及瘀血并与门脉高压病期相关.
2.3 LI与PSmVD，DGMM及SmT的相关性 PHG-MH鼠的LI明显降低并随门脉高压病程进展而加重(表1). LI降低与PSmVD，DGMM及SmT间呈显著负相关关系(表2).
表1 胃微血管DGMM PSmVD及粘膜上皮细胞标记指数(LI%)变化
(
±s) 参数
n
, 百拇医药
对照
n
PHG-MH
n
PHG-MH-Ⅰ
n
PHG-MH-Ⅱ
DGMM(μm)
12
29.4±2.9
26
40.1±3.0a
10
, 百拇医药
34.1±3.6
16
43.8±4.2a
PSmVD
16
0.38±0.33
18
0.50±0.03b
9
0.44±3.58
16
0.56±0.04bc
, 百拇医药
M-LI(%)
13
14.7±0.6
17
11.7±1.0a
10
13.1±1.3
7
8.9±1.0b
B-LI(%)
4
12.6±0.8
, 百拇医药
14
10.6±0.9a
7
12.2±1.4
7
8.9±1.01a
Bs-LI(%)
4
10.8±0.9d
14
8.7±0.8d
7
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10.1±1.0
7
7.3±1.0a
Bb-LI(%)
4
14.4±1.0
14
12.8±0.8
7
14.5±1.8
7
10.4±1.1a
, 百拇医药
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组；cP<0.05，vs PHG-MH-Ⅰ；dP<0.05，vs Bb-LI.
表2 LI与SmT，PSmVD及DGMM的相关性 分组
n
SmT
PSmVD
DGMM
Control
9
-0.795b
-0.869b
, 百拇医药
-0.797b
PHG-MH
17
-0.909b
-0.879b
-0.678b
PHG-MH-Ⅰ
10
-0.844b
-0.940b
-0.598a
, 百拇医药
PHG-MH-Ⅱ
7
-0.934b
-0.678a
-0.913b
aP<0.05，bP<0.01.
3 讨论
GMECG是粘膜稳态防御系统形态和功能维持的主要承担者，其功能状态与粘膜防御系统功能及粘膜损害发生的关系，也一直受到基础及临床研究的关注. 增殖动力学状态是GMECG功能状态的重要表现形式之一，它的生理维持有赖于氧和营养物质的充足供应，并受到细胞周期相关基因及内外环境因素的复杂调控[3]. 病理条件下的增殖动力学状态与粘膜损害的关系也已在“冷束缚”应激性溃疡大鼠[4]、门脉高压性胃粘膜出血大鼠[1]以及药物诱导胃粘膜损害的研究中受到关注.
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我们曾推测门脉高压条件下胃微血管扩张瘀血可能降低GMECG的增殖活性而引起胃粘膜损害性出血[1]，本研究结果进一步证实了这一推测. 我们发现PHG-MH鼠91.2%发生2.27±0.20级出血，其胃微血管的扩张瘀血及GMECG增殖活性的降低均与对照有显著性差异，分期观察则发现PHG-MH-Ⅰ和PHG-MH-Ⅱ鼠的出血率、严重性分级和粘膜下厚度的增加均与对照有显著差异，与此同时胃微血管扩张瘀血和GMECG增殖活性降低，尤其出血灶局部和周围未出血粘膜更明显，主要发生在PHG-MH-Ⅱ鼠. 提示胃微血管扩张瘀血对GMECG增殖活性状态的影响，主要发生在病程的相对晚期. 相关分析结果则表明，DGMM，PSmVD及SmT均与LI呈显著负相关，这种关系也见于对照鼠，但相互间密切程度在PHG-MH鼠的不同病期有所变化，可能提示PHG-MH-Ⅰ鼠LI降低主要与“粘膜下窃流”有关，而在PHG-MH-Ⅱ鼠则同时与门脉高压持续发展所致粘膜微血管瘀血有关. 也进一步提示胃微血管自身可变化性对PHG-MH的发生发展有一定影响，其机制可能是随病程进展尤其粘膜下动-静脉短路开放的逐渐增多，使粘膜有效血流量减少和氧弥散距离增加逐渐加重，而降低GMECG的物质代谢水平及增殖活性. 微血管的扩张瘀血还可能通过其他途径影响粘膜稳态防御系统功能及粘膜损害出血的发生过程，已有研究证实门脉高压时有胃壁结合粘液量、胃粘膜内源性前列腺素含量及氨基乙糖含量的明显减少并与粘膜出血的发生密切相关[5，6]. 结合本研究结果，胃微血管普遍扩张瘀血及其基础上的GMECG物质代谢障碍、将可能使GMECG增殖活性降低以及粘液类物质和胃内源性保护物质的合成减少，严重削弱粘膜稳态防御系统形态和功能的多个环节，而导致粘膜损害及出血的发生.
, 百拇医药
至于GMECG增殖动力学状态改变如何影响粘膜稳态防御系统的功能，目前尚无满意解释， 其可能机制包括：①与上皮细胞合成内源性保护物质以及产生和分泌粘液类物质的功能状态相关联，因细胞物质代谢水平降低是它们的共同基础. ②与上皮细胞的“成熟”状态或老化状态相关联，而影响上皮细胞的间隙连接(GJ)结构及功能. 如有作者应用免疫荧光技术和冰冻断裂蚀刻显微技术观察了大鼠胃粘膜表面上皮细胞的GJ在细胞成熟过程中的变化[7]，发现未成熟细胞的GJ明显少于并小于成熟细胞，认为GJ提供了细胞代谢及物质(粘液、HCO3-盐等)分泌的细胞间直接交换途径，有利于粘膜稳态防御系统形态和功能的维持，GJ结构及功能改变将影响粘膜稳态及粘膜损害的发生. 另有研究则表明肝硬变门脉高压时有胃粘膜屏障结构的破坏和粘液屏障的崩溃. ③我们以往的研究也表明[1]门脉高压时的GMECG增殖活性降低使得抗御损害发生及损害发生后的修复反应都受到影响，是门脉高压时易发生粘膜损害性出血及损害性病变慢性化倾向的重要原因.
, 百拇医药
总之，慢性型门脉高压时胃粘膜稳态防御系统的形态和功能在多个环节上均严重受损，是粘膜损害易感性增加的主要原因，而胃微血管系统扩张瘀血及其基础上的粘膜上皮物质代谢障碍是多环节损害的共同基础，增殖动力学低下状态是其表现之一，并与粘膜出血的发生密切相关[8].
4 参考文献
1 武永忠，何泽生，吴金生，马庆久. 门脉高压性胃粘膜损害出血的细胞动力学. 第四军医大学学报，1997；18(3)：266-269
2 武永忠，何泽生，吴金生，马庆久. 门脉高压大鼠胃粘膜出血性损害模型制备. 第四军医大学学报，1997；18(1)：41
3 B.艾伯茨主编. 细胞分子生物学. 北京：科学出版社，1990：598～620
4 武永忠，何泽生，吴金生，赖大年，马庆久，高德明. 饥饿对门脉高压性胃粘膜出血的影响. 华人消化杂志，1998；6(9)：747-748
, http://www.100md.com
5 顾晋，才文彦，严仲瑜. 应激性溃疡的胃粘膜细胞动力学实验研究. 中华医学杂志，1991；71(11)：630-633
6 王效民，申耀宗，刘志发. 门脉高压大鼠胃粘膜损害的发生机制及其与断流术的关系. 中华外科杂志，1990；28(8)：521-523
7 Arakawa T, Satoh H, Fukuda T, Nakamura H, Kobayashi K. Edogenous prostaglandin E2 in gastric mucosa of patient hypertension. Gastroenterology, 1987;93(1):135-140
8 Takashi K, Fusao U, Kiyoshi K. Development of gap junctions between gastric surface mucosal cells during cell maturation in rats. Gastroenterology, 1992;102(8):1930-1935
9 吴金生，武永忠，马庆久，何泽生，赖大年，高德明. 胃微血管扩张瘀血对门脉高压性胃病变及粘膜出血的影响. 华人消化杂志，1998；6(9)：749-751, 百拇医药
单位：
关键词：乙型肝炎/并发症；肝硬化/免疫学；肝/病理生理学；白细胞介素2/免疫学；受体，白细胞介素2/免疫学
华人消化杂志980908Relationship between ectasias in gastric microvascular system and cytokinetics in gastric mucous epithelial cell group in PHG-MH rats
WU Yong-Zhong, WU Jin-Sheng, LAI Da-Nian, MA Qing-Jiu, HE Ze-Sheng and GAO De-Ming
Department of General Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China
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Subject headings hepatitis B/complication; liver cirrhosis/immunology; liver/physiopathology; interleukin-2/immunology; receptors, interleukin-2/immunology
Abstract
AIM To investigate the relationship between ectasias of the gastric microvascular system (GMS) and cytokinetics of the gastric mucous epithelial cell group (GMECG) during the development of portal hypertensive gastropathy and mucosal hemorrhage (PHG-MH) in rats.
, 百拇医药
METHODS PHG-MH was prepared by starvation in rats with liver cirrhosis and portal hypertention induced by abdominal injection of 30?g/?L thioacetamide. Morphological measurement and autoradiography were employed in PHG-MH rats in two stages to observe the changes of the morphology in GMS and of the labelling index (LI) in GMECG.
RESULTS ①The bleeding rate (91.2%) and severity (grade, 2.27±0.20) in PHG-MH rats were more significant than that in control group (P<0.01). With the development of portal hypertension, the bleeding rate and severity increased significantly both in PHG-MH-Ⅰ and in PHG-MH-Ⅱ rats (P<0.05 or P<0.01). ②DGMM and PSmVD were significantly increased both in PHG-MH (40.1?μm±3.0?μm, P<0.05; and 0.50±0.03，P<0.01) and in PHG-MH-Ⅱ rats (43.8?μm±4.20?μm, P<0.05; and 0.564±0.042, P<0.01), but were not in PHG-MH-Ⅰ rats (P>0.05). Furthmore, PSmVD in PHG-MH-Ⅱ rats was significantly larger than that in PHG-MH-Ⅰ rats (P<0.05). ③M-LI(11.7%±1.0%) and B-LI (10.6%±0.9%) were decreased obviously in PHG-MH rats (P<0.05，vs control). With the development of portal hypertension, M-LI, B-LI, Bs-LI and Bb-LI were all decreased significantly in PHG-MH-Ⅱ rats (P<0.05 or P<0.01), but were not in PHG-MH-Ⅰ rats, respectively. ④Submucosal thickness (SmT) in PHG-MH rats were increased markedly (P<0.01). ⑤There was a negative relation among LI, PSmVD, DGMM and SmT in PHG-MH.
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CONCLUSION One of the bleeding mechanisms for ectasias and congestion in GMS is the lower status of cytokinetics in GMECG. It occurred mainly in a relative later stage of portal hypertensive gastropathy.
主题词 乙型肝炎/并发症；肝硬化/免疫学；肝/病理生理学；白细胞介素2/免疫学；受体，白细胞介素2/免疫学
摘 要
目的 探讨慢性型门脉高压条件下胃微血管系统扩张瘀血与粘膜上皮细胞群体(GMECG)增殖动力学状态的关系.
方法 用30?g/?L硫代乙酰胺腹部sc法诱导大鼠慢性肝损害肝硬变及门脉高压，继用饥饿诱导法使大鼠发生门脉高压性胃粘膜出血(PHG-MH，n=34)，用形态测量法及微观放射自显影技术分期观察(注药45?d，PHT-MH-Ⅰ，n=14；注药65?d，PHT-MH-Ⅱ，n=20)模型鼠的胃粘膜微血管直径(DGMM)、粘膜下小静脉管径比(PSmVD)、粘膜下厚度(SmT)及粘膜上皮细胞群体标记指数(LI)的变化.
, 百拇医药
结果 ①PHG-MH鼠出血率(91.2%)及严重性分级(2.27±0.20级)均大于对照(P<0.01)，分期观察出血率(85.7%和95.0%)及严重性分级(1.79±0.03级和2.60±0.25级)均大于对照(P<0.05和P<0.01). ②PHG-MH鼠DGMM(40.1?μm±3.0?μm)、PSmVD(0.50±0.03)均大于对照(P<0.05和P<0.01). 分期观察PHG-MH-Ⅰ鼠DGMM和PSmVD未达显著水平；而PHG-MH-Ⅱ鼠DGMM(43.8?μm±4.20?μm)、严重性分级(2.60±0.25级)和PSmVD(0.57±0.04)均大于对照(P<0.05或P<0.01)，尤其PSmVD大于PHG-MH-Ⅰ鼠(P<0.05). ③PHG-MH鼠的平均LI(11.7%±1.0%)及有出血鼠LI(10.6%±0.9%)均低于对照(P<0.05). 分期观察PHG-MH-Ⅰ鼠LI均未达显著水平，而PHG-MH-Ⅱ鼠平均LI(8.9%±1.0%)，有出血鼠LI(8.9%±1.0%)，出血灶局部LI(7.3%±1.0%)及周围未出血粘膜LI(10.4%±1.1%)均低于对照水平(P<0.05或P<0.01), ④PHG-MH鼠SmT及分期观察值均大于对照水平(P<0.01). ⑤LI与PSmVD，DGMM及SmT间均有显著负相关关系.
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结论 胃微血管扩张瘀血可降低GMECG的增殖活性，并主要发生在病程相对晚期，是引起胃粘膜损害性出血的机制之一.0 引言
门脉高压时胃粘膜上皮细胞群体(GMECG)增殖活性受到明显抑制，并与胃粘膜损害性出血的发生有极为密切的关系[1]. 我们曾推测门脉高压时胃微血管系统的普遍扩张瘀血可能影响粘膜上皮细胞物质代谢水平，使GMECG增殖活性降低而引起粘膜出血的发生. 我们对慢性型门脉高压条件下胃微血管扩张瘀血与GMECG增殖活性状态的关系进行初步观察，以探讨胃微血管扩张瘀血引起胃粘膜损害性出血的机制.
1 材料和方法
1.1 材料 门脉高压性胃病变及粘膜出血(PHG-MH)模型复制[2] 用30?g/?L硫代乙酰胺(中国医药公司北京采供站)腹部sc诱导大鼠慢性肝损害肝硬变及门脉高压性胃病变，继用饥饿诱导法使门脉高压大鼠发生胃粘膜出血，分为PHG-MH-Ⅰ(注药45?d,n=14)和PHG-MH-Ⅱ(注药65?d，n=20)两组. 设模拟注射加饥饿诱导作为对照. 观察粘膜出血情况，计算出血率(%)并按0～4级分法记录出血严重程度(级). 玻璃水柱法测门静脉压力(PVP)，换算为kPa表示.
, http://www.100md.com
1.2 方法 ①胃微血管形态测量 新鲜未固定腺胃粘膜1?cm×1?cm，仿立体显微镜观察胃粘膜方法原理，于低倍光镜下(5×10)行粘膜微血管形态观察及测量，以粘膜微血管构型最大分支的直径代表粘膜微血管直径(DGMM，μm)，每个标本取2～3个构型的最大分支直径的平均值. 另取腺胃全层组织0.5?cm×0.5?cm，常规组织切片及染色，光镜下观察粘膜组织学，测量并计算粘膜下小静脉管径比(短径/?长径，PSmVD). 同时测量粘膜下厚度(SmT,μm). ②体外组织培养3H-TdR单标记微观放射自显影切片制备[1]新鲜腺胃粘膜0.5?cm×0.5?cm置于RPMI-1640 (Sigma)培养液中，加入3H-TdR(比放射性66.6×1019Bq/?mol，中国原子能科学研究院)，使其终浓度为3.7×108Bq/?L，pH 7.2～7.4，37℃恒温水浴搅拌孵育60min后，PBS缓冲液漂洗3次，Carnoy液固定后常规浸蜡切片(4?μm～5?μm)，凉干后暗室红光下涂L-4液体核乳胶(中国原子能科学研究院)，室温下避光凉干，暗盒内4℃曝光2?wk后，行显影(D-196)和定影(酸性坚膜定影液)处理及常规HE染色. 光镜下阅片计数标记细胞数，并计算胃粘膜上皮细胞标记指数(LI=标记细胞/?增殖区细胞总数×100%). 每个标本均测平均LI(M-LI). 有出血鼠同时测出血鼠LI(B-LI)、出血灶局部LI(Bs-LI)和出血灶周围LI(Bb-LI). 各指标取5～8次测量平均值.
, 百拇医药
统计学处理 出血率(%)用χ2检验，其余指标均表达为±s，行student t检验. P<0.05为差异显著，P<0.01为非常显著，P>0.05为无差异. M-LI与DGMM，PSmVD及SmT间行相关分析.
2 结果
2.1 PHG-MH复制 PHG-MH鼠出血率(91.2%)，严重性分级(2.27±0.02级)及PVP(1.63?kPa±0.03?kPa)均大于对照组(P<0.01)，并随门脉高压病程而发展. PHG-MH-Ⅰ鼠有85.7%发生1.79±0.03级出血(P<0.05). PHG-MH-Ⅱ鼠有95%发生2.60±0.25级出血(P<0.01). PHG-MH鼠SmT(139.74?μm±5.90?μm)及分期观察SmT(104.6?μm±8.4?μm和155.4?μm±6.6?μm)均大于对照(P<0.01)，尤其PHG-MH-Ⅱ鼠的SmT大于PHG-MH-Ⅰ鼠(P<0.05). 符合门脉高压性胃病变及粘膜出血特征.
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2.2 微血管测量 PHG-MH鼠的DGMM及PSmVD均大于对照. 随着门脉高压病程进展，PHG-MH-Ⅰ鼠DGMM和PSmVD未达显著水平；而PHG-MH-Ⅱ鼠DGMM及PSmVD均大于对照，尤其PSmVD大于PHG-MH-Ⅰ鼠(表1). 表明胃微血管系统有普遍扩张及瘀血并与门脉高压病期相关.
2.3 LI与PSmVD，DGMM及SmT的相关性 PHG-MH鼠的LI明显降低并随门脉高压病程进展而加重(表1). LI降低与PSmVD，DGMM及SmT间呈显著负相关关系(表2).
表1 胃微血管DGMM PSmVD及粘膜上皮细胞标记指数(LI%)变化
(
±s) 参数n
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对照
n
PHG-MH
n
PHG-MH-Ⅰ
n
PHG-MH-Ⅱ
DGMM(μm)
12
29.4±2.9
26
40.1±3.0a
10
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34.1±3.6
16
43.8±4.2a
PSmVD
16
0.38±0.33
18
0.50±0.03b
9
0.44±3.58
16
0.56±0.04bc
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M-LI(%)
13
14.7±0.6
17
11.7±1.0a
10
13.1±1.3
7
8.9±1.0b
B-LI(%)
4
12.6±0.8
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14
10.6±0.9a
7
12.2±1.4
7
8.9±1.01a
Bs-LI(%)
4
10.8±0.9d
14
8.7±0.8d
7
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10.1±1.0
7
7.3±1.0a
Bb-LI(%)
4
14.4±1.0
14
12.8±0.8
7
14.5±1.8
7
10.4±1.1a
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aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组；cP<0.05，vs PHG-MH-Ⅰ；dP<0.05，vs Bb-LI.
表2 LI与SmT，PSmVD及DGMM的相关性 分组
n
SmT
PSmVD
DGMM
Control
9
-0.795b
-0.869b
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-0.797b
PHG-MH
17
-0.909b
-0.879b
-0.678b
PHG-MH-Ⅰ
10
-0.844b
-0.940b
-0.598a
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PHG-MH-Ⅱ
7
-0.934b
-0.678a
-0.913b
aP<0.05，bP<0.01.
3 讨论
GMECG是粘膜稳态防御系统形态和功能维持的主要承担者，其功能状态与粘膜防御系统功能及粘膜损害发生的关系，也一直受到基础及临床研究的关注. 增殖动力学状态是GMECG功能状态的重要表现形式之一，它的生理维持有赖于氧和营养物质的充足供应，并受到细胞周期相关基因及内外环境因素的复杂调控[3]. 病理条件下的增殖动力学状态与粘膜损害的关系也已在“冷束缚”应激性溃疡大鼠[4]、门脉高压性胃粘膜出血大鼠[1]以及药物诱导胃粘膜损害的研究中受到关注.
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我们曾推测门脉高压条件下胃微血管扩张瘀血可能降低GMECG的增殖活性而引起胃粘膜损害性出血[1]，本研究结果进一步证实了这一推测. 我们发现PHG-MH鼠91.2%发生2.27±0.20级出血，其胃微血管的扩张瘀血及GMECG增殖活性的降低均与对照有显著性差异，分期观察则发现PHG-MH-Ⅰ和PHG-MH-Ⅱ鼠的出血率、严重性分级和粘膜下厚度的增加均与对照有显著差异，与此同时胃微血管扩张瘀血和GMECG增殖活性降低，尤其出血灶局部和周围未出血粘膜更明显，主要发生在PHG-MH-Ⅱ鼠. 提示胃微血管扩张瘀血对GMECG增殖活性状态的影响，主要发生在病程的相对晚期. 相关分析结果则表明，DGMM，PSmVD及SmT均与LI呈显著负相关，这种关系也见于对照鼠，但相互间密切程度在PHG-MH鼠的不同病期有所变化，可能提示PHG-MH-Ⅰ鼠LI降低主要与“粘膜下窃流”有关，而在PHG-MH-Ⅱ鼠则同时与门脉高压持续发展所致粘膜微血管瘀血有关. 也进一步提示胃微血管自身可变化性对PHG-MH的发生发展有一定影响，其机制可能是随病程进展尤其粘膜下动-静脉短路开放的逐渐增多，使粘膜有效血流量减少和氧弥散距离增加逐渐加重，而降低GMECG的物质代谢水平及增殖活性. 微血管的扩张瘀血还可能通过其他途径影响粘膜稳态防御系统功能及粘膜损害出血的发生过程，已有研究证实门脉高压时有胃壁结合粘液量、胃粘膜内源性前列腺素含量及氨基乙糖含量的明显减少并与粘膜出血的发生密切相关[5，6]. 结合本研究结果，胃微血管普遍扩张瘀血及其基础上的GMECG物质代谢障碍、将可能使GMECG增殖活性降低以及粘液类物质和胃内源性保护物质的合成减少，严重削弱粘膜稳态防御系统形态和功能的多个环节，而导致粘膜损害及出血的发生.
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至于GMECG增殖动力学状态改变如何影响粘膜稳态防御系统的功能，目前尚无满意解释， 其可能机制包括：①与上皮细胞合成内源性保护物质以及产生和分泌粘液类物质的功能状态相关联，因细胞物质代谢水平降低是它们的共同基础. ②与上皮细胞的“成熟”状态或老化状态相关联，而影响上皮细胞的间隙连接(GJ)结构及功能. 如有作者应用免疫荧光技术和冰冻断裂蚀刻显微技术观察了大鼠胃粘膜表面上皮细胞的GJ在细胞成熟过程中的变化[7]，发现未成熟细胞的GJ明显少于并小于成熟细胞，认为GJ提供了细胞代谢及物质(粘液、HCO3-盐等)分泌的细胞间直接交换途径，有利于粘膜稳态防御系统形态和功能的维持，GJ结构及功能改变将影响粘膜稳态及粘膜损害的发生. 另有研究则表明肝硬变门脉高压时有胃粘膜屏障结构的破坏和粘液屏障的崩溃. ③我们以往的研究也表明[1]门脉高压时的GMECG增殖活性降低使得抗御损害发生及损害发生后的修复反应都受到影响，是门脉高压时易发生粘膜损害性出血及损害性病变慢性化倾向的重要原因.
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总之，慢性型门脉高压时胃粘膜稳态防御系统的形态和功能在多个环节上均严重受损，是粘膜损害易感性增加的主要原因，而胃微血管系统扩张瘀血及其基础上的粘膜上皮物质代谢障碍是多环节损害的共同基础，增殖动力学低下状态是其表现之一，并与粘膜出血的发生密切相关[8].
4 参考文献
1 武永忠，何泽生，吴金生，马庆久. 门脉高压性胃粘膜损害出血的细胞动力学. 第四军医大学学报，1997；18(3)：266-269
2 武永忠，何泽生，吴金生，马庆久. 门脉高压大鼠胃粘膜出血性损害模型制备. 第四军医大学学报，1997；18(1)：41
3 B.艾伯茨主编. 细胞分子生物学. 北京：科学出版社，1990：598～620
4 武永忠，何泽生，吴金生，赖大年，马庆久，高德明. 饥饿对门脉高压性胃粘膜出血的影响. 华人消化杂志，1998；6(9)：747-748
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5 顾晋，才文彦，严仲瑜. 应激性溃疡的胃粘膜细胞动力学实验研究. 中华医学杂志，1991；71(11)：630-633
6 王效民，申耀宗，刘志发. 门脉高压大鼠胃粘膜损害的发生机制及其与断流术的关系. 中华外科杂志，1990；28(8)：521-523
7 Arakawa T, Satoh H, Fukuda T, Nakamura H, Kobayashi K. Edogenous prostaglandin E2 in gastric mucosa of patient hypertension. Gastroenterology, 1987;93(1):135-140
8 Takashi K, Fusao U, Kiyoshi K. Development of gap junctions between gastric surface mucosal cells during cell maturation in rats. Gastroenterology, 1992;102(8):1930-1935
9 吴金生，武永忠，马庆久，何泽生，赖大年，高德明. 胃微血管扩张瘀血对门脉高压性胃病变及粘膜出血的影响. 华人消化杂志，1998；6(9)：749-751, 百拇医药