HE染色褪色后Feulgen染色法在鼻咽癌涂片细胞DNA分析中的应用
作者：陈茂怀 陈志强 李川军 梁小曼 罗锡源
单位：陈茂怀(广东省汕头大学医学院病理学教研室，汕头市 515031)；陈志强(香港中文大学医学院病理解剖及细胞学系)；李川军(香港中文大学医学院病理解剖及细胞学系)；梁小曼(香港中文大学医学院病理解剖及细胞学系)；罗锡源(中山医科大学附属肿瘤医院病理科，广州 510089)
关键词：鼻咽肿瘤；细胞诊断学；DNA；肿瘤
临床与实验病理学杂志990135
中国图书分类号 R739.63
文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)01-0091-02
DNA含量分析与恶性肿瘤的生物学行为、临床预后及治疗密切相关〔1，2〕。细胞学样本常因样本有限及缺乏组织结构，限制了细胞学样本DNA含量分析及其实用性研究。笔者采用鼻咽癌鼻咽部刷片，脱落癌细胞涂片样本，与直接Feulgen染色比较，探讨HE染色褪色后Feulgen染色，对癌细胞DNA含量测定的影响。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 病例及样本选择 从香港威尔斯亲王医院病理解剖及细胞学系1995～1996年40例鼻咽癌刷片涂片中选择10例富于癌细胞的涂片(每例2张)，鼻咽刷片同时作鼻咽组织活检，平均年龄58岁，男∶女为3∶2，鼻咽刷片涂片和活检组织作HE染色，细胞学诊断均为“鼻咽刷片见癌细胞”，组织学诊断为鼻咽癌。用钻石笔在HE染色的涂片玻片背面将癌细胞圈住，然后1%酸性乙醇将涂片褪色，做Feulgen染色(间接)，各例另一张涂片直接做Feulgen染色。
1.2 DNA染色 采用CAS定量DNA染色试剂盒(BD公司)。步骤简介如下：(1)将鼻咽细胞学涂片和CAS校正涂片(鼠肝细胞)经梯度乙醇水化；(2)在盐酸溶液(第一试剂)水解60 min；(3)在染色液(第二试剂)染色60 min；(4)在漂洗液(第三试剂)分别漂洗3次各30 s、5 min和10 min；(5)水洗，1%酸性乙醇5 min，脱水，透明，封片。
, 百拇医药
1.3 DNA含量测定 采用CAS 200细胞分析仪(BD公司，San Jose, USA) Quantitative DNA Analysis软件系统，测定鼻咽细胞学涂片和CAS校正涂片(鼠肝细胞)的DNA含量。在鼻咽细胞涂片上选择癌细胞进行测定，每例至少测定100个以上癌细胞，同时测定50个以上上皮细胞作为内对照确定二倍体峰位置，直接做Feulgen染色涂片则选择最异型细胞进行测定〔3〕。
1.4 DNA倍体 DI值0.90～1.10为DNA二倍体，DI值1.80～2.20为四倍体，DI值3.60～4.40为八倍体。其余统称为异倍体，DNA倍体峰需占20%以上癌细胞数〔4〕，两个样本间DI值差异大于0.1时，则判断为不同的癌细胞群体峰〔1〕。
2 结果
2.1 组织细胞学检查 按WHO分类，9例为未分化癌，1例为非角化鳞癌。涂片见癌细胞成团、成片或散在分布，细胞不小不一或较一致，胞核深染或呈空泡状，核仁肥大(图1，2)。
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图1癌细胞成团、成片或散在分布，细胞大小不一或较一致，胞核深染。HE×400
图2癌细胞形态、大小、分布同图1，胞核呈空泡状，核仁大。HE×400
2.2 鼻咽癌涂片DNA核型、DNA指数、变异系数
2.2.1 DNA核型(二倍体、四倍体和异倍体)符合率9/10(90%)，1例直接Feulgen染色为四倍体核型而涂片褪色后Feulgen染色为异倍体核型。
2.2.2 两者DNA指数(10例各有15个DI值)符合率12/15(80%)，呈直线正相关(r=0.97， P<0.001)。
2.2.3 G0/G1峰DNA指数的平均CV值在直接Feulgen染色组为5.3(3.1～10.7)，间接Feulgen染色组为6.2(4.2～11.1)，两者差异无显著性(P>0.05)。
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3 讨论
鼻咽癌DNA含量分析已有较多报道，一般采用鼻咽癌活检组织材料，通过石蜡组织连续切片，分别进行HE和Feulgen染色，能较好确定癌细胞并选择性测定其DNA含量。而鼻咽癌细胞学涂片标本直接进行Feulgen染色后，不易从形态学上对所需细胞作选择性测定。本研究对细胞学涂片先作常规HE染色，确定癌细胞和其它细胞，并在涂片癌细胞位置标上记号后将HE褪色，重新进行Feulgen染色，选择性测定癌细胞DNA含量，以探索常规HE染色涂片褪色后作Feulgen染色和DNA检测的可靠性和可行性。作者选择10例富于癌细胞的鼻咽刷片涂片，比较直接Feulgen染色与HE染色褪色后Feulgen染色，对癌细胞DNA含量的影响。由于图象分析能同时观察组织细胞形态并选择性检测所需细胞，DNA非二倍体核型检出的敏感性较高，适用于少量细胞样本的DNA测定〔5，6〕。本研究细胞涂片采用图象分析检测癌细胞DNA含量，结果两者DNA二倍体、四倍体和异倍体符合率达90%，DNA指数符合率80%，呈直线正相关(r=0.97)；3例DI值不同病例，1例表现为不同DI值的异倍体峰，1例表现为不同DI值的四倍体峰，1例直接Feulgen染色为四倍体核型而涂片褪色后作Feulgen染色为异倍体核型，两种方法结果差异可能与肿瘤DNA核型异质性有关。两种方法间G0/G1峰DI值变异系数差异没有显著性，说明HE染色和HE染色的褪色处理均不会影响Feulgen染色，而且与直接Feulgen染色比较，HE染色褪色后Feulgen染色并不影响癌细胞DNA含量及其变异程度。后者先通过HE染色确定癌细胞，在进行图象分析时，能准确快速地选择测定癌细胞DNA含量。Sidoni等〔7〕的研究表明可采用常规巴氏染色的细胞学涂片褪色后作DNA分析，本研究结果支持上述方法，细胞学涂片常规HE染色褪色后作Feulgen染色，能较满意地进行DNA分析，适用于细胞学样本(包括微针穿刺样本)的回顾性研究和随访研究。
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*澳大利亚皇家病理学院教育或研究基金资助课题
作者简介：陈茂怀，男，36岁，医学硕士，副教授。研究方向：人鼻咽癌及癌前病变的形态定量学特征和分子病理学研究，以及食管癌的病理生物学研究
陈志强，男，55岁，医学博士，教授。研究方向：人宫颈癌脱落细胞学与人乳头状瘤病毒研究，鼻咽癌脱落细胞学的形态定量学和分子生物学研究
参考文献
1，Kaketani K, Saito T, Kuwahara A et al. DNA stemline heterogeneity in esophageal cancer accurately identified by flow cytometric analysis. Cancer, 1993;27(12):3564～3570
, 百拇医药
2，Saito A, Korenage D, Haraguchi M et al. Heterogeneity in gastric carcinoma with special reference to DNA content and mitotic activity? Histopathologic differentiation. J Surg Oncl, 1992;51:14～18
3，Greenebaum E, Yee HT, Liu J. DNA ploidy of ovarian and adnexal cyst fluid, a useful adjunct to cytology. Acta Cytol, 1994;38:201～208
4，Fallenius AG, Auer GU, Carstensen JM. Prognostic significance of DNA measurements in 409 consecutive breast cancer patients. Cancer, 1988;62:331～341
, http://www.100md.com
5，Clemo FAS, Crabtree MN, Walker E et al. Comparison of image analysis and flow cytometric measurements of DNA content of canine transitional cell carcinomas. Analyt Quant Cytol Histol, 1993;15:419～426
6，Lanigan D, Mclean PA, Curran B et al. Comparison of flow and static image cytometry in the determination of ploidy. J Clin Pathol, 1993;46:135～139
7，Sidoni A, Cavaliere A, Alunno P et al. DNA-ploidy studies on cytological preparations from breast cancers by image analysis: Comparison with Feulgen staining performed in destained papanicolaou slides. Commun Clin Cytometry, 1996;26(4):293～297
(图片见插页第13页)
收稿日期：1998-02-06, 百拇医药
单位：陈茂怀(广东省汕头大学医学院病理学教研室，汕头市 515031)；陈志强(香港中文大学医学院病理解剖及细胞学系)；李川军(香港中文大学医学院病理解剖及细胞学系)；梁小曼(香港中文大学医学院病理解剖及细胞学系)；罗锡源(中山医科大学附属肿瘤医院病理科，广州 510089)
关键词：鼻咽肿瘤；细胞诊断学；DNA；肿瘤
临床与实验病理学杂志990135
中国图书分类号 R739.63
文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)01-0091-02
DNA含量分析与恶性肿瘤的生物学行为、临床预后及治疗密切相关〔1，2〕。细胞学样本常因样本有限及缺乏组织结构，限制了细胞学样本DNA含量分析及其实用性研究。笔者采用鼻咽癌鼻咽部刷片，脱落癌细胞涂片样本，与直接Feulgen染色比较，探讨HE染色褪色后Feulgen染色，对癌细胞DNA含量测定的影响。
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1 材料和方法
1.1 病例及样本选择 从香港威尔斯亲王医院病理解剖及细胞学系1995～1996年40例鼻咽癌刷片涂片中选择10例富于癌细胞的涂片(每例2张)，鼻咽刷片同时作鼻咽组织活检，平均年龄58岁，男∶女为3∶2，鼻咽刷片涂片和活检组织作HE染色，细胞学诊断均为“鼻咽刷片见癌细胞”，组织学诊断为鼻咽癌。用钻石笔在HE染色的涂片玻片背面将癌细胞圈住，然后1%酸性乙醇将涂片褪色，做Feulgen染色(间接)，各例另一张涂片直接做Feulgen染色。
1.2 DNA染色 采用CAS定量DNA染色试剂盒(BD公司)。步骤简介如下：(1)将鼻咽细胞学涂片和CAS校正涂片(鼠肝细胞)经梯度乙醇水化；(2)在盐酸溶液(第一试剂)水解60 min；(3)在染色液(第二试剂)染色60 min；(4)在漂洗液(第三试剂)分别漂洗3次各30 s、5 min和10 min；(5)水洗，1%酸性乙醇5 min，脱水，透明，封片。
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1.3 DNA含量测定 采用CAS 200细胞分析仪(BD公司，San Jose, USA) Quantitative DNA Analysis软件系统，测定鼻咽细胞学涂片和CAS校正涂片(鼠肝细胞)的DNA含量。在鼻咽细胞涂片上选择癌细胞进行测定，每例至少测定100个以上癌细胞，同时测定50个以上上皮细胞作为内对照确定二倍体峰位置，直接做Feulgen染色涂片则选择最异型细胞进行测定〔3〕。
1.4 DNA倍体 DI值0.90～1.10为DNA二倍体，DI值1.80～2.20为四倍体，DI值3.60～4.40为八倍体。其余统称为异倍体，DNA倍体峰需占20%以上癌细胞数〔4〕，两个样本间DI值差异大于0.1时，则判断为不同的癌细胞群体峰〔1〕。
2 结果
2.1 组织细胞学检查 按WHO分类，9例为未分化癌，1例为非角化鳞癌。涂片见癌细胞成团、成片或散在分布，细胞不小不一或较一致，胞核深染或呈空泡状，核仁肥大(图1，2)。
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图1癌细胞成团、成片或散在分布，细胞大小不一或较一致，胞核深染。HE×400
图2癌细胞形态、大小、分布同图1，胞核呈空泡状，核仁大。HE×400
2.2 鼻咽癌涂片DNA核型、DNA指数、变异系数
2.2.1 DNA核型(二倍体、四倍体和异倍体)符合率9/10(90%)，1例直接Feulgen染色为四倍体核型而涂片褪色后Feulgen染色为异倍体核型。
2.2.2 两者DNA指数(10例各有15个DI值)符合率12/15(80%)，呈直线正相关(r=0.97， P<0.001)。
2.2.3 G0/G1峰DNA指数的平均CV值在直接Feulgen染色组为5.3(3.1～10.7)，间接Feulgen染色组为6.2(4.2～11.1)，两者差异无显著性(P>0.05)。
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3 讨论
鼻咽癌DNA含量分析已有较多报道，一般采用鼻咽癌活检组织材料，通过石蜡组织连续切片，分别进行HE和Feulgen染色，能较好确定癌细胞并选择性测定其DNA含量。而鼻咽癌细胞学涂片标本直接进行Feulgen染色后，不易从形态学上对所需细胞作选择性测定。本研究对细胞学涂片先作常规HE染色，确定癌细胞和其它细胞，并在涂片癌细胞位置标上记号后将HE褪色，重新进行Feulgen染色，选择性测定癌细胞DNA含量，以探索常规HE染色涂片褪色后作Feulgen染色和DNA检测的可靠性和可行性。作者选择10例富于癌细胞的鼻咽刷片涂片，比较直接Feulgen染色与HE染色褪色后Feulgen染色，对癌细胞DNA含量的影响。由于图象分析能同时观察组织细胞形态并选择性检测所需细胞，DNA非二倍体核型检出的敏感性较高，适用于少量细胞样本的DNA测定〔5，6〕。本研究细胞涂片采用图象分析检测癌细胞DNA含量，结果两者DNA二倍体、四倍体和异倍体符合率达90%，DNA指数符合率80%，呈直线正相关(r=0.97)；3例DI值不同病例，1例表现为不同DI值的异倍体峰，1例表现为不同DI值的四倍体峰，1例直接Feulgen染色为四倍体核型而涂片褪色后作Feulgen染色为异倍体核型，两种方法结果差异可能与肿瘤DNA核型异质性有关。两种方法间G0/G1峰DI值变异系数差异没有显著性，说明HE染色和HE染色的褪色处理均不会影响Feulgen染色，而且与直接Feulgen染色比较，HE染色褪色后Feulgen染色并不影响癌细胞DNA含量及其变异程度。后者先通过HE染色确定癌细胞，在进行图象分析时，能准确快速地选择测定癌细胞DNA含量。Sidoni等〔7〕的研究表明可采用常规巴氏染色的细胞学涂片褪色后作DNA分析，本研究结果支持上述方法，细胞学涂片常规HE染色褪色后作Feulgen染色，能较满意地进行DNA分析，适用于细胞学样本(包括微针穿刺样本)的回顾性研究和随访研究。
, http://www.100md.com
*澳大利亚皇家病理学院教育或研究基金资助课题
作者简介：陈茂怀，男，36岁，医学硕士，副教授。研究方向：人鼻咽癌及癌前病变的形态定量学特征和分子病理学研究，以及食管癌的病理生物学研究
陈志强，男，55岁，医学博士，教授。研究方向：人宫颈癌脱落细胞学与人乳头状瘤病毒研究，鼻咽癌脱落细胞学的形态定量学和分子生物学研究
参考文献
1，Kaketani K, Saito T, Kuwahara A et al. DNA stemline heterogeneity in esophageal cancer accurately identified by flow cytometric analysis. Cancer, 1993;27(12):3564～3570
, 百拇医药
2，Saito A, Korenage D, Haraguchi M et al. Heterogeneity in gastric carcinoma with special reference to DNA content and mitotic activity? Histopathologic differentiation. J Surg Oncl, 1992;51:14～18
3，Greenebaum E, Yee HT, Liu J. DNA ploidy of ovarian and adnexal cyst fluid, a useful adjunct to cytology. Acta Cytol, 1994;38:201～208
4，Fallenius AG, Auer GU, Carstensen JM. Prognostic significance of DNA measurements in 409 consecutive breast cancer patients. Cancer, 1988;62:331～341
, http://www.100md.com
5，Clemo FAS, Crabtree MN, Walker E et al. Comparison of image analysis and flow cytometric measurements of DNA content of canine transitional cell carcinomas. Analyt Quant Cytol Histol, 1993;15:419～426
6，Lanigan D, Mclean PA, Curran B et al. Comparison of flow and static image cytometry in the determination of ploidy. J Clin Pathol, 1993;46:135～139
7，Sidoni A, Cavaliere A, Alunno P et al. DNA-ploidy studies on cytological preparations from breast cancers by image analysis: Comparison with Feulgen staining performed in destained papanicolaou slides. Commun Clin Cytometry, 1996;26(4):293～297
(图片见插页第13页)
收稿日期：1998-02-06, 百拇医药