人支气管上皮细胞恶性转化中凋亡敏感性及bcl-2的变化
作者：孙晗笑 童彤 吕永杰 郭素萍 程书钧
单位：孙晗笑(暨南大学医学院病理教研室，广东 广州 510632)；童彤 吕永杰 郭素萍 程书钧(中国医学科学院肿瘤研究所病因与癌变研究室， 北京 100021)
关键词：凋亡；恶性转化；支气管上皮细胞；基因
中国病理生理杂志000512
[摘 要] 目的: 揭示细胞凋亡敏感性在人癌细胞体外恶性转化动态过程中的变化。方法：用已获部分恶性的SV40T转染的人支气管上皮细胞系M为材料， 通过凋亡TDT原位标记、染色体FISH、RNA及蛋白检测等技术，研究同一株细胞恶性转化过程中凋亡及bcl-2、P53基因的变化。结果：恶性转化的M后代细胞较未转化的M前代细胞对顺铂诱发细胞凋亡现象不敏感；bcl-2基因的转录和表达在M后代细胞明显高于M前代细胞，而且在M细胞恶性转化进程中呈积累现象；P53蛋白在M前、后代细胞均表达。结论：bcl-2过表达使细胞对凋亡敏感性下降在人支气管上皮细胞恶性转化中起重要作用；P53蛋白的灭活不是此SV40T转染细胞恶性转化进程中bcl-2表达积累的主要原因。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R730.23 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0424-04
Alteration of apoptotic susceptibility and bcl-2 gene in malignant transformation of human bronchial epithelial cells
SUN Han-xiao
(1.Medical College of Jinan University, Guangzhou, 510632)
TONG Tong, LU Yong-jie, GUO Su-ping, CHENG Shu-jun
, 百拇医药
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021)
[Abstract] AIM: To demonstrate the susceptibility of cell apoptosis varies during the progress of cell malignant transformation from human being in vitro. METHODS: A SV40T-transfected human bronchial epithelial immortalized cell line (called M) was selected in this work, which has acquired some characteristics of malignant transformation at the later passage. The alterations of apoptosis and bcl-2, P53 genes between early and later passage of M cells were investigated by means of TDT labeling in situ, chromosome FISH, RNA and protein testing, etc. RESULTS: Incidence of apoptosis induced by cis-platin was significantly lower in later than in early passages of M. Levels of bcl-2 mRNA and protein in later passages were higher than early passages of M, and overexpression of bcl-2 was accumulated following the development of cellular malignancy. P53 protein level was as high in early as in later passages. CONCLUSION: Overexpression of bcl-2 decreases the cellular sensitivity to apoptotic inductors plays an important role during progress of carcinogenesis in human bronchial epithelial cancers. The inactivation of P53 protein in the SV40-T transfected M cell line may be one of reasons of bcl-2 overexpression, but not associated with the accumulation of bcl-2 expressed level during cell transformation.
, http://www.100md.com
[MeSH] Apoptosis; Carcinogenesis; Bronchial epithelium; Gene
在成熟组织中，如果使细胞增生的因素占优势，或者细胞死亡的过程受抑制均可能导致肿瘤的发生。为了揭示癌发生过程的早期基因改变与恶性转化的关系，本室建立了SV40T抗原转染的人支气管上皮细胞永生化细胞系。此细胞系50多代时细胞已获得部分恶性特征，主要表现于染色体数目从二倍体变为三倍体或四倍体、c-myc基因从8号染色体易位于14号染色体IgH重链基因处[1]、对生长因子不依赖、血清抗性增强，并可在软琼脂上生长，在裸鼠体内表现为重度异型增生的鳞状上皮癌前病变状态。本文用此细胞系为材料，研究恶性转化过程中凋亡及其相关基因bcl-2及P53的表达改变, 探讨细胞凋亡与癌发生的关系。
材 料 和 方 法
SV40T转染的人支气管上皮细胞,简称M细胞，采用MCDB151无血清培养，36℃，5%CO2，细胞呈单层贴壁生长，3～5 d传代1次。顺铂(cis-platin)用无菌三蒸水配制， 在细胞传代后24 h加入，培养不同时间后收集细胞。
, 百拇医药
一、电镜标本制作按常规进行。
二、末端脱氧核苷转移酶(TDT)原位标记试验 按本室方法进行[2]。
三、cDNA探针制作
Bcl-2 cDNA重组质粒，4.3 kb，BamHI插入片段，由美国SR Chagantizeng赠送。质粒提取按《分子克隆》所述方法进行[3]。按试剂盒(GIBCO 公司)说明书要求标记生物素并检测标记效率，储存于-20℃备用。
四、染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)
制备染色体滴片。RNA酶处理，加含bcl-2 cDNA探针的70% 去离子甲酰胺/2×SSC液杂交过夜。杂交后洗片，封闭，加FITC-卵白素及生物素-抗卵白素抗体，PI复染，镜下观察。设未加探针为阴性对照。重复实验3次。
, 百拇医药
五、细胞mRNA 原位杂交
涂片用左旋咪唑，蛋白酶K处理。预杂交2 h，加入探针杂交16 h。 杂交后洗片，封闭，链霉亲和素-碱性磷酸酶作用10 min，NBT/BCIP底物显色，镜下观察。
mRNA 酶处理为阴性对照。加药及未加药的前、后代M 细胞均涂在同张玻片的不同圈内，以对比结果。重复实验5次。
六、 Northern 杂交
细胞总RNA用异硫氰酸胍法提取, 常规转膜，杂交过程按发光核酸检测盒(GIBCO公司)要求进行。重复实验多次, 结果一致。
七、蛋白检测试验
识别人野生、突变型P53单抗(Santa Cruz)用于P53蛋白的检测。P53的Western印迹按试剂盒(Amersham公司)说明书进行，P53细胞免疫组化按ABC试剂盒(Vector公司)要求常规进行。
, http://www.100md.com
Bcl-2单抗(Santa Cruz 公司)的免疫组化参照LeBrun等[4]方法，细胞涂片经左旋咪唑，加单抗、二抗，BSA封闭,然后用链霉亲和素- 碱性磷酸酶，NBT/BCIP系统显色。
蛋白检测均设未加抗体为阴性对照。重复实验5次, 结果一致。免疫组化结果判断同TDT实验。
结 果
一、M前、后代细胞对顺铂的敏感性
M73代细胞比M16代细胞体积增大，核浆比大，分裂快。加顺铂后24 h，TDT原位标记及电镜下均有细胞凋亡(图1、2)。
Fig 1 A apoptotic cell of M73 cells under electron microscope with treatment of 50 μmol/L cisplatin for 48 h (EM ×7000)
, http://www.100md.com
图1 M73细胞在50 μmol/L顺铂作用48 h时，电镜下可见凋亡细胞
油镜下计数500个细胞TDT标记阳性细胞的凋亡率(表1)。表明M16代细胞对顺铂的敏感性高于M73代细胞，两者差别有显著性。
表1 M16和M73细胞加顺铂24 h时TDT染色的凋亡细胞数的变化
Tab 1 Change of the number of apoptotic cells in M16 and M73
cells with the treatment of cis-platin for 24 h in
, http://www.100md.com TDT labeling (
±s, n=5) Con.of cisplatin
M16 cells
M73 cells
25 μmol
27.4±1.0
5.8±0.3*
50μmol
49.4±1.2
8.8±0.6*
, http://www.100md.com
*P<0.01, vs M16 cells
Fig 2 Positive apoptotic cells in TDT in situ labeling were seen in M16 cells with the treatment of 25 μmol/L cisplatin for 24 h(arrows show,× 400)
图2 M16代细胞在顺铂作用24 h,可见TDT标记阳性的凋亡细胞(箭头所示)
二、Bcl-2基因在M细胞的染色体定位
染色体荧光原位杂交显示，bcl-2基因仍位于18号染色体(图3)，在M前、后代细胞均无bcl-2基因的扩增、缺失等改变。
, http://www.100md.com
Fig 3 Chromosome FISH showed bcl-2 normally located in chromosome 8 of M cells, the figure from the part of chromosomes of a triploid M50 cell(×500 )
图3 染色体荧光原位杂交显示bcl-2仍正常位于8号染色体,图为一个三倍体的M50代细胞的部分染色体
三、bcl-2在M前后代细胞的mRNA转录水平的改变
细胞mRNA原位杂交结果显示，从M18代到M62代细胞,bcl-2基因的mRNA水平明显升高。
bcl-2在M前后代细胞的Northern杂交显示，M79代细胞bcl-2 mRNA水平均高于M35代及M15代细胞，M35代细胞表达水平亦高于M15代，显示bcl-2 mRNA的转录渐增强(图4)。
, 百拇医药
Fig 4Variable levels of bcl-2 mRNA in different passage of M cells showed by Northern Blot (A). Figure B was β-action bands in A-membrane as internal control
图4 Northern 杂交显示在不同代数M细胞的bcl-2 基因mRNA水平的变化(A),B图为同一膜的β-action内对照
四、P53蛋白的Western Blot结果
在各阶段M细胞均可检测到较高的P53蛋白水平，其表达量无明显变化(图5)。此结果说明P53受SV40T转染的影响，因SV40T与P53结合，而使P53降解减少。
, 百拇医药
Fig 5 In Western Blotting, the levels of P53 protein in different passage of M cells weren't varied significantly
图5 Western 印迹显示,在不同代数M细胞的P53蛋白水平没有明显的变化
五、Bcl-2及P53蛋白的免疫组化染色
镜下计数500个细胞中+++和++染色细胞的阳性率。Bcl-2蛋白在M后代细胞的表达量高于M前代细胞。而P53蛋白在M前、后代细胞无明显差异(表2)。
表2 Bcl-2、P53在M前后代细胞的免疫组化阳性率
Tab 2 Positive percentage of bcl-2 and P53 protein
, http://www.100md.com
immunocytochemistry in early or later M
passage cells (±s, n=5 ) Protein
M18 cells
M79 cells
Bcl-2
21.6±0.9
67.0±5.1*
P53
35.0±2.2
, 百拇医药
46.0±1.0#
* P< 0.01, # P>0.05, vs M18 cells讨 论
一、凋亡敏感性下降是恶性转化的早期事件
我们的结果表明在M细胞恶性转化过程中，bcl-2表达增强可能导致细胞对凋亡敏感性下降，凋亡敏感性下降在细胞癌变中起重要作用。顺铂引起细胞的DNA损伤，前代M细胞的DNA受损伤后，大多以凋亡方式死亡；而对后代的M 细胞，由于bcl-2 基因过表达，使已有DNA损伤的细胞仍可继续生长分裂，也即bcl-2的高表达抑制了DNA损伤细胞的凋亡，对于细胞群体来说，则表现为细胞凋亡敏感性下降或细胞凋亡阈值升高。
P53可在转录水平直接或间接地下调bcl-2的表达，P53功能的丧失可引起bcl-2的过表达[5，6]。在M细胞，由于SV40T与P53结合，使P53功能丧失并在细胞内聚集[7]，引起bcl-2表达升高。此为M细胞在恶性转化过程中对凋亡因素敏感性变化的原因。
, 百拇医药
M细胞恶性转化是一个凋亡、增生失去平衡的过程。由于SV40T 的转染，M细胞获得了增殖加快及凋亡途经受抑制的分子基础 。以前研究已证实，c-myc易位激活使细胞获得快速增殖特性[1]，本研究证实了bcl-2高表达使M细胞对凋亡因素不敏感，此为M 细胞获得恶性的分子基础。
二、在M细胞恶性转化过程中，bcl-2基因过表达随恶性程度的获得而渐增强，即在恶变过程中成积累现象。因P53蛋白在M前后代细胞无明显变化，bcl-2过表达的积累非P53失活所致，说明尚有其他因素参与恶性变的进程，也可能与c-myc基因的易位激活有关。
三、本研究亦显示，顺铂化疗药的敏感性与细胞中bcl-2过表达程度有关，bcl-2表达越高，则对顺铂越不敏感；bcl-2表达相对正常的细胞对顺铂越敏感。因此，bcl-2表达水平对顺铂的效果有直接影响。
[基金项目] 国家自然科学基金资助(No.39470768)
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] 吕永杰，程书钧，徐丽华,等. 应用荧光原位杂交方法发现肺癌中c-myc易位[J]. 中华医学杂志, 1995，75：214～216.
[2] 孙晗笑,童彤,郭素萍,等. 顺铂引起人支气管上皮和肺癌细胞凋亡及bcl-2 和TGFβ1基因表达的改变[J]. 卫生毒理学杂志, 1998,12(4):235～237.
[3] Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T著. 金冬雁等译. 分子克隆实验指南[M].第2版.北京: 科学出版社, 1992.
[4] LeBrun DP, Cowledd PA, Sassiki Y, et al. Follicular lymphomas of the gastrointestinal tract. Pathologic features in 31 cases and bcl-2 oncogenic protein expression[J]. Am J Pathol, 1992,140:1327～1335.
, 百拇医药
[5] Haldar S, Veilckens K, Bittner S,et al. Down-regulation of bcl-2 by P53 in breast cancer cells[J]. Cancer Res, 1994,54:2095～2097.
[6] Miyashita T, Tardy S, Sordat B,et al. Tumor suppressor P53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo[J]. Oncogene, 1994,9:1799～1805.
[7] Kao C, Lukeis R，Ricoardi VM，et al. Role of SV40T antigen binding to pRb and P53 in multi-step transformation in vitro of human uroepithelial cells[J]. Carcinogenesis, 1993,14:2297～2302.
[收稿日期] 1999-03-24 [修回日期] 1999-07-30
, 百拇医药
单位：孙晗笑(暨南大学医学院病理教研室，广东 广州 510632)；童彤 吕永杰 郭素萍 程书钧(中国医学科学院肿瘤研究所病因与癌变研究室， 北京 100021)
关键词：凋亡；恶性转化；支气管上皮细胞；基因
中国病理生理杂志000512
[摘 要] 目的: 揭示细胞凋亡敏感性在人癌细胞体外恶性转化动态过程中的变化。方法：用已获部分恶性的SV40T转染的人支气管上皮细胞系M为材料， 通过凋亡TDT原位标记、染色体FISH、RNA及蛋白检测等技术，研究同一株细胞恶性转化过程中凋亡及bcl-2、P53基因的变化。结果：恶性转化的M后代细胞较未转化的M前代细胞对顺铂诱发细胞凋亡现象不敏感；bcl-2基因的转录和表达在M后代细胞明显高于M前代细胞，而且在M细胞恶性转化进程中呈积累现象；P53蛋白在M前、后代细胞均表达。结论：bcl-2过表达使细胞对凋亡敏感性下降在人支气管上皮细胞恶性转化中起重要作用；P53蛋白的灭活不是此SV40T转染细胞恶性转化进程中bcl-2表达积累的主要原因。
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[中图分类号] R730.23 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0424-04
Alteration of apoptotic susceptibility and bcl-2 gene in malignant transformation of human bronchial epithelial cells
SUN Han-xiao
(1.Medical College of Jinan University, Guangzhou, 510632)
TONG Tong, LU Yong-jie, GUO Su-ping, CHENG Shu-jun
, 百拇医药
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021)
[Abstract] AIM: To demonstrate the susceptibility of cell apoptosis varies during the progress of cell malignant transformation from human being in vitro. METHODS: A SV40T-transfected human bronchial epithelial immortalized cell line (called M) was selected in this work, which has acquired some characteristics of malignant transformation at the later passage. The alterations of apoptosis and bcl-2, P53 genes between early and later passage of M cells were investigated by means of TDT labeling in situ, chromosome FISH, RNA and protein testing, etc. RESULTS: Incidence of apoptosis induced by cis-platin was significantly lower in later than in early passages of M. Levels of bcl-2 mRNA and protein in later passages were higher than early passages of M, and overexpression of bcl-2 was accumulated following the development of cellular malignancy. P53 protein level was as high in early as in later passages. CONCLUSION: Overexpression of bcl-2 decreases the cellular sensitivity to apoptotic inductors plays an important role during progress of carcinogenesis in human bronchial epithelial cancers. The inactivation of P53 protein in the SV40-T transfected M cell line may be one of reasons of bcl-2 overexpression, but not associated with the accumulation of bcl-2 expressed level during cell transformation.
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[MeSH] Apoptosis; Carcinogenesis; Bronchial epithelium; Gene
在成熟组织中，如果使细胞增生的因素占优势，或者细胞死亡的过程受抑制均可能导致肿瘤的发生。为了揭示癌发生过程的早期基因改变与恶性转化的关系，本室建立了SV40T抗原转染的人支气管上皮细胞永生化细胞系。此细胞系50多代时细胞已获得部分恶性特征，主要表现于染色体数目从二倍体变为三倍体或四倍体、c-myc基因从8号染色体易位于14号染色体IgH重链基因处[1]、对生长因子不依赖、血清抗性增强，并可在软琼脂上生长，在裸鼠体内表现为重度异型增生的鳞状上皮癌前病变状态。本文用此细胞系为材料，研究恶性转化过程中凋亡及其相关基因bcl-2及P53的表达改变, 探讨细胞凋亡与癌发生的关系。
材 料 和 方 法
SV40T转染的人支气管上皮细胞,简称M细胞，采用MCDB151无血清培养，36℃，5%CO2，细胞呈单层贴壁生长，3～5 d传代1次。顺铂(cis-platin)用无菌三蒸水配制， 在细胞传代后24 h加入，培养不同时间后收集细胞。
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一、电镜标本制作按常规进行。
二、末端脱氧核苷转移酶(TDT)原位标记试验 按本室方法进行[2]。
三、cDNA探针制作
Bcl-2 cDNA重组质粒，4.3 kb，BamHI插入片段，由美国SR Chagantizeng赠送。质粒提取按《分子克隆》所述方法进行[3]。按试剂盒(GIBCO 公司)说明书要求标记生物素并检测标记效率，储存于-20℃备用。
四、染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)
制备染色体滴片。RNA酶处理，加含bcl-2 cDNA探针的70% 去离子甲酰胺/2×SSC液杂交过夜。杂交后洗片，封闭，加FITC-卵白素及生物素-抗卵白素抗体，PI复染，镜下观察。设未加探针为阴性对照。重复实验3次。
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五、细胞mRNA 原位杂交
涂片用左旋咪唑，蛋白酶K处理。预杂交2 h，加入探针杂交16 h。 杂交后洗片，封闭，链霉亲和素-碱性磷酸酶作用10 min，NBT/BCIP底物显色，镜下观察。
mRNA 酶处理为阴性对照。加药及未加药的前、后代M 细胞均涂在同张玻片的不同圈内，以对比结果。重复实验5次。
六、 Northern 杂交
细胞总RNA用异硫氰酸胍法提取, 常规转膜，杂交过程按发光核酸检测盒(GIBCO公司)要求进行。重复实验多次, 结果一致。
七、蛋白检测试验
识别人野生、突变型P53单抗(Santa Cruz)用于P53蛋白的检测。P53的Western印迹按试剂盒(Amersham公司)说明书进行，P53细胞免疫组化按ABC试剂盒(Vector公司)要求常规进行。
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Bcl-2单抗(Santa Cruz 公司)的免疫组化参照LeBrun等[4]方法，细胞涂片经左旋咪唑，加单抗、二抗，BSA封闭,然后用链霉亲和素- 碱性磷酸酶，NBT/BCIP系统显色。
蛋白检测均设未加抗体为阴性对照。重复实验5次, 结果一致。免疫组化结果判断同TDT实验。
结 果
一、M前、后代细胞对顺铂的敏感性
M73代细胞比M16代细胞体积增大，核浆比大，分裂快。加顺铂后24 h，TDT原位标记及电镜下均有细胞凋亡(图1、2)。
Fig 1 A apoptotic cell of M73 cells under electron microscope with treatment of 50 μmol/L cisplatin for 48 h (EM ×7000)
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图1 M73细胞在50 μmol/L顺铂作用48 h时，电镜下可见凋亡细胞
油镜下计数500个细胞TDT标记阳性细胞的凋亡率(表1)。表明M16代细胞对顺铂的敏感性高于M73代细胞，两者差别有显著性。
表1 M16和M73细胞加顺铂24 h时TDT染色的凋亡细胞数的变化
Tab 1 Change of the number of apoptotic cells in M16 and M73
cells with the treatment of cis-platin for 24 h in
, http://www.100md.com TDT labeling (
±s, n=5) Con.of cisplatinM16 cells
M73 cells
25 μmol
27.4±1.0
5.8±0.3*
50μmol
49.4±1.2
8.8±0.6*
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*P<0.01, vs M16 cells
Fig 2 Positive apoptotic cells in TDT in situ labeling were seen in M16 cells with the treatment of 25 μmol/L cisplatin for 24 h(arrows show,× 400)
图2 M16代细胞在顺铂作用24 h,可见TDT标记阳性的凋亡细胞(箭头所示)
二、Bcl-2基因在M细胞的染色体定位
染色体荧光原位杂交显示，bcl-2基因仍位于18号染色体(图3)，在M前、后代细胞均无bcl-2基因的扩增、缺失等改变。
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Fig 3 Chromosome FISH showed bcl-2 normally located in chromosome 8 of M cells, the figure from the part of chromosomes of a triploid M50 cell(×500 )
图3 染色体荧光原位杂交显示bcl-2仍正常位于8号染色体,图为一个三倍体的M50代细胞的部分染色体
三、bcl-2在M前后代细胞的mRNA转录水平的改变
细胞mRNA原位杂交结果显示，从M18代到M62代细胞,bcl-2基因的mRNA水平明显升高。
bcl-2在M前后代细胞的Northern杂交显示，M79代细胞bcl-2 mRNA水平均高于M35代及M15代细胞，M35代细胞表达水平亦高于M15代，显示bcl-2 mRNA的转录渐增强(图4)。
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Fig 4Variable levels of bcl-2 mRNA in different passage of M cells showed by Northern Blot (A). Figure B was β-action bands in A-membrane as internal control
图4 Northern 杂交显示在不同代数M细胞的bcl-2 基因mRNA水平的变化(A),B图为同一膜的β-action内对照
四、P53蛋白的Western Blot结果
在各阶段M细胞均可检测到较高的P53蛋白水平，其表达量无明显变化(图5)。此结果说明P53受SV40T转染的影响，因SV40T与P53结合，而使P53降解减少。
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Fig 5 In Western Blotting, the levels of P53 protein in different passage of M cells weren't varied significantly
图5 Western 印迹显示,在不同代数M细胞的P53蛋白水平没有明显的变化
五、Bcl-2及P53蛋白的免疫组化染色
镜下计数500个细胞中+++和++染色细胞的阳性率。Bcl-2蛋白在M后代细胞的表达量高于M前代细胞。而P53蛋白在M前、后代细胞无明显差异(表2)。
表2 Bcl-2、P53在M前后代细胞的免疫组化阳性率
Tab 2 Positive percentage of bcl-2 and P53 protein
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immunocytochemistry in early or later M
passage cells (
±s, n=5 ) ProteinM18 cells
M79 cells
Bcl-2
21.6±0.9
67.0±5.1*
P53
35.0±2.2
, 百拇医药
46.0±1.0#
* P< 0.01, # P>0.05, vs M18 cells讨 论
一、凋亡敏感性下降是恶性转化的早期事件
我们的结果表明在M细胞恶性转化过程中，bcl-2表达增强可能导致细胞对凋亡敏感性下降，凋亡敏感性下降在细胞癌变中起重要作用。顺铂引起细胞的DNA损伤，前代M细胞的DNA受损伤后，大多以凋亡方式死亡；而对后代的M 细胞，由于bcl-2 基因过表达，使已有DNA损伤的细胞仍可继续生长分裂，也即bcl-2的高表达抑制了DNA损伤细胞的凋亡，对于细胞群体来说，则表现为细胞凋亡敏感性下降或细胞凋亡阈值升高。
P53可在转录水平直接或间接地下调bcl-2的表达，P53功能的丧失可引起bcl-2的过表达[5，6]。在M细胞，由于SV40T与P53结合，使P53功能丧失并在细胞内聚集[7]，引起bcl-2表达升高。此为M细胞在恶性转化过程中对凋亡因素敏感性变化的原因。
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M细胞恶性转化是一个凋亡、增生失去平衡的过程。由于SV40T 的转染，M细胞获得了增殖加快及凋亡途经受抑制的分子基础 。以前研究已证实，c-myc易位激活使细胞获得快速增殖特性[1]，本研究证实了bcl-2高表达使M细胞对凋亡因素不敏感，此为M 细胞获得恶性的分子基础。
二、在M细胞恶性转化过程中，bcl-2基因过表达随恶性程度的获得而渐增强，即在恶变过程中成积累现象。因P53蛋白在M前后代细胞无明显变化，bcl-2过表达的积累非P53失活所致，说明尚有其他因素参与恶性变的进程，也可能与c-myc基因的易位激活有关。
三、本研究亦显示，顺铂化疗药的敏感性与细胞中bcl-2过表达程度有关，bcl-2表达越高，则对顺铂越不敏感；bcl-2表达相对正常的细胞对顺铂越敏感。因此，bcl-2表达水平对顺铂的效果有直接影响。
[基金项目] 国家自然科学基金资助(No.39470768)
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[参 考 文 献]
[1] 吕永杰，程书钧，徐丽华,等. 应用荧光原位杂交方法发现肺癌中c-myc易位[J]. 中华医学杂志, 1995，75：214～216.
[2] 孙晗笑,童彤,郭素萍,等. 顺铂引起人支气管上皮和肺癌细胞凋亡及bcl-2 和TGFβ1基因表达的改变[J]. 卫生毒理学杂志, 1998,12(4):235～237.
[3] Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T著. 金冬雁等译. 分子克隆实验指南[M].第2版.北京: 科学出版社, 1992.
[4] LeBrun DP, Cowledd PA, Sassiki Y, et al. Follicular lymphomas of the gastrointestinal tract. Pathologic features in 31 cases and bcl-2 oncogenic protein expression[J]. Am J Pathol, 1992,140:1327～1335.
, 百拇医药
[5] Haldar S, Veilckens K, Bittner S,et al. Down-regulation of bcl-2 by P53 in breast cancer cells[J]. Cancer Res, 1994,54:2095～2097.
[6] Miyashita T, Tardy S, Sordat B,et al. Tumor suppressor P53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo[J]. Oncogene, 1994,9:1799～1805.
[7] Kao C, Lukeis R，Ricoardi VM，et al. Role of SV40T antigen binding to pRb and P53 in multi-step transformation in vitro of human uroepithelial cells[J]. Carcinogenesis, 1993,14:2297～2302.
[收稿日期] 1999-03-24 [修回日期] 1999-07-30
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