骨髓内皮细胞无血清条件培养液对WEHI-3细胞生长的影响
作者：王承龙 汪保和
单位：王承龙(作者现在湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉科研究室工作)；汪保和(湖南医科大学血液生理研究室 长沙 410078)
关键词：骨髓基质细胞；骨髓内皮细胞；造血调节；小鼠骨髓内皮细胞系
中国现代医学杂志000631 该实验收集小鼠骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)预留部分原液外，其作用阻遏分子量为10000daltons(10KD)和3000daltons(3KD)的超滤膜眼滤，获得分子量>10DK、3～10KD、<3KD的超滤液，分别检测不同组分超滤液及原液对小鼠白血病细胞系(WEHI-3)细胞集落生长的影响，发现小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液中分子量>10KD和<3KD组分对小鼠粒单系白血病细胞系(WEHI-3)集落生长有明显的抑制作用，而mBMEC-CM原液和3～10KD两组的集落数与对照组差别无统计学意义。以上结果表示：小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液中可能存在多种分子量大小不同的造血生长因子，对粒单系白血病细胞系(WEHI-3)细胞的生长起调控作用。
, 百拇医药
分类号 R-332
为了深入研究内皮细胞对造血的调节作用及其机制，我们采用收集小鼠骨髓内皮细胞无血清培养上清，通过超滤，分成不同分子量组分，检测各组分对白血病细胞系(WEHI-3)集落生成的影响。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
小鼠骨髓内皮细胞株(本室建立)，按常规液体培养方法传代培养，新生小牛血清由杭州四季青生物工程研究所购进，马血清由北京军事科学院购进，DMEM培养粉、琼脂粉由美国Sigma公司生产。
1.2 方法
1.2.1 小鼠骨髓内皮细胞株的传代培养 采用液体培养方法，将含有20%的小牛血清，40%WEHI-3条件培养液的DMEM培养体系5ml，种入50ml螺口培养瓶中，37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养3～5d后，每周半量或全量换液两次。
, 百拇医药
1.2.2 WEHI-3细胞集落检测 取对数生长期的WEHI-3细胞按每毫升培养体系接种500，1?000，2?000及3?000个细胞，20%小牛血清，0.3%琼脂做细胞种植率与集落生成数之间的线性关系。
1.2.3 mBMEC-CM制备 以液体培养对数生长期的内皮细胞融合层细胞，用PBS轻洗3遍，每瓶换入DMEM液2.5ml，不加血清，培养3d后，收集上清液离心，去沉淀细胞后除菌过滤分装，将收集的mBMEC-CM预留部分原液外，其余用分子量10KD、3KD的滤膜离心超滤成分>10KD、3～10KD、<3KD 3种不同分子量组分，-20℃保存备用。
1.2.4 mBMEC-CM各组分对WEHI-3集落生长的影响 采用琼脂半固体培养方法，集落培养体系每毫升含10%小牛血清、10马血清、0.3%琼脂、1×103个WEHI-3细胞及30%各组分超滤液作WEHI-3集落生成率检测，对照组加入等量的DMEM培养液，培养7d，显微镜下计数≥40个WEHI-3组成的WEHI-3集落数。
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1.3 统计处理
实验结果(
±s)表示，两组间比较用t检验。
2 结果
2.1 种入的WEHI-3细胞数与WEHI-3集落生长数之间的线性关系
表1 种入的WEHI-3细胞数与WEHI-3集落
生长数之间的线性关系 (±s) 种入的WEHI-3细胞数(个/皿)
WEHI-3集落数
500个/ml/皿
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16.33±2.00
1?000个/ml/皿
41.00±6.56
2?000个/ml/皿
81.67±8.50
13000个/ml/皿
151.32±11.50
按每毫升培养体系种入500，1?000，2?000及3?000个WEHI-3细胞数，培养7d后所生成的WEHI-3集落数随种入的WEHI-3细胞数的增加而增多，两者之间呈高度相关性(r=0.933)，见表1。
2.2 不同分子量组分的mBMEC-CM对WEHI-3细胞集落生长的影响
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在每毫升培养体系中含WEHI-3细胞1×103个，10%小牛血清、10%马血清、0.3%琼脂、实验组加mBMEC-CM原液及其超滤液组分，对照组加入等量DMEM培养液，培养结果见表2。与对照组比较>10KD和<3KD组分两组的WEHI-3细胞集落数明显减少(P<0.01)，而mBMEC-CM原液如3～10KD组分的两组WEHI-3集落与对照组比较无明显差异(P>0.05)，见表2。表2 不同分子量组分的mBMEC-CM对
WEHI-3细胞集落生长的影响 组 别
WEHI-3集落数(1?000个/皿±s)
对照组
168.78±9.46
>10KD组
100.43±18.06*
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<3KD组
137.34±6.75*
3～10KD组
154.32±10.37
mBMEC-CM原液组
162.12±10.79
注：*与对照组比较P<0.013 讨论
大量研究表明，骨髓造血微环境中包括内皮细胞在内的基质细胞通过产生细胞生长因子调控造血干/祖细胞的增殖和分化，这是骨髓基质细胞调控造血的一种重要方式[1]，在体外培养条件下，骨髓基质细胞可分泌产生多种造血调控生长因子进入培养上清，检测各类基质细胞培养上清对造血调控的活性，最终发现和提取其中的活性因子，是研究造血基质细胞造血调控功能的重要手段之一[2]。
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本研究应用超滤技术将小鼠骨髓内皮细胞无血清培养上清，分成不同分子量组分，分别检测这些组分对小鼠粒单系白血病细胞集落生成的影响，结果显示，mBMEC-CM原液和3～10KD组分对WEHI-3集落生长未见明显的抑制和促进作用，而>10KD组分和<3KD组分的mBMEC-CM对WEHI-3细胞集落的生长表现出明显的抑制作用，说明内皮细胞可通过分泌细胞抑制因子进入培养上清，这些分子包括大分子和小分子物质。
根据Almeida-Dorada G等报道[3]，骨髓内皮细胞表达TGF-βmRNA，TGF-β分子量为25?000Dalton，>10KD组分的骨髓内皮细胞条件培养液对WEHI-3的抑制作用可能与TGF-β有关。已报道的细胞增殖的小分子抑制物有MIP-1D，PGE等[4]，但骨髓内皮细胞分泌何种小分子抑制物有待进一步研究。
参考文献
1，胡维明.造血基质细胞与造血因子.中国实验血液学杂志，1993；1(2)：97～98
, http://www.100md.com
2，Eaves CJ,Cashman JD,Kay RJ,et al.Mechanisms that regulate the cell cycle status of very primitive himatopoietic cells in Long-tem human marrow cultures produced by stroman cells with in the adherent layer.Blood,1991:78～110
3，Almeida-Dorada G,Aseensao TL.Isolation Characterization and bilogic features of bone marrow endothelial cells.J Lab Clin Med,1996:128～339
4，Roy V,Verfaillie CM.Soluble factor(s) produces by bone marrow stroma inhibit in vitro proliferation and differention of fetal liver BFU-E by inducing apoptosis.J Clin Invest,1997;100:912～920, http://www.100md.com
单位：王承龙(作者现在湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉科研究室工作)；汪保和(湖南医科大学血液生理研究室 长沙 410078)
关键词：骨髓基质细胞；骨髓内皮细胞；造血调节；小鼠骨髓内皮细胞系
中国现代医学杂志000631 该实验收集小鼠骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)预留部分原液外，其作用阻遏分子量为10000daltons(10KD)和3000daltons(3KD)的超滤膜眼滤，获得分子量>10DK、3～10KD、<3KD的超滤液，分别检测不同组分超滤液及原液对小鼠白血病细胞系(WEHI-3)细胞集落生长的影响，发现小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液中分子量>10KD和<3KD组分对小鼠粒单系白血病细胞系(WEHI-3)集落生长有明显的抑制作用，而mBMEC-CM原液和3～10KD两组的集落数与对照组差别无统计学意义。以上结果表示：小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液中可能存在多种分子量大小不同的造血生长因子，对粒单系白血病细胞系(WEHI-3)细胞的生长起调控作用。
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分类号 R-332
为了深入研究内皮细胞对造血的调节作用及其机制，我们采用收集小鼠骨髓内皮细胞无血清培养上清，通过超滤，分成不同分子量组分，检测各组分对白血病细胞系(WEHI-3)集落生成的影响。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
小鼠骨髓内皮细胞株(本室建立)，按常规液体培养方法传代培养，新生小牛血清由杭州四季青生物工程研究所购进，马血清由北京军事科学院购进，DMEM培养粉、琼脂粉由美国Sigma公司生产。
1.2 方法
1.2.1 小鼠骨髓内皮细胞株的传代培养 采用液体培养方法，将含有20%的小牛血清，40%WEHI-3条件培养液的DMEM培养体系5ml，种入50ml螺口培养瓶中，37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养3～5d后，每周半量或全量换液两次。
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1.2.2 WEHI-3细胞集落检测 取对数生长期的WEHI-3细胞按每毫升培养体系接种500，1?000，2?000及3?000个细胞，20%小牛血清，0.3%琼脂做细胞种植率与集落生成数之间的线性关系。
1.2.3 mBMEC-CM制备 以液体培养对数生长期的内皮细胞融合层细胞，用PBS轻洗3遍，每瓶换入DMEM液2.5ml，不加血清，培养3d后，收集上清液离心，去沉淀细胞后除菌过滤分装，将收集的mBMEC-CM预留部分原液外，其余用分子量10KD、3KD的滤膜离心超滤成分>10KD、3～10KD、<3KD 3种不同分子量组分，-20℃保存备用。
1.2.4 mBMEC-CM各组分对WEHI-3集落生长的影响 采用琼脂半固体培养方法，集落培养体系每毫升含10%小牛血清、10马血清、0.3%琼脂、1×103个WEHI-3细胞及30%各组分超滤液作WEHI-3集落生成率检测，对照组加入等量的DMEM培养液，培养7d，显微镜下计数≥40个WEHI-3组成的WEHI-3集落数。
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1.3 统计处理
实验结果(
±s)表示，两组间比较用t检验。2 结果
2.1 种入的WEHI-3细胞数与WEHI-3集落生长数之间的线性关系
表1 种入的WEHI-3细胞数与WEHI-3集落
生长数之间的线性关系 (
±s) 种入的WEHI-3细胞数(个/皿)WEHI-3集落数
500个/ml/皿
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16.33±2.00
1?000个/ml/皿
41.00±6.56
2?000个/ml/皿
81.67±8.50
13000个/ml/皿
151.32±11.50
按每毫升培养体系种入500，1?000，2?000及3?000个WEHI-3细胞数，培养7d后所生成的WEHI-3集落数随种入的WEHI-3细胞数的增加而增多，两者之间呈高度相关性(r=0.933)，见表1。
2.2 不同分子量组分的mBMEC-CM对WEHI-3细胞集落生长的影响
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在每毫升培养体系中含WEHI-3细胞1×103个，10%小牛血清、10%马血清、0.3%琼脂、实验组加mBMEC-CM原液及其超滤液组分，对照组加入等量DMEM培养液，培养结果见表2。与对照组比较>10KD和<3KD组分两组的WEHI-3细胞集落数明显减少(P<0.01)，而mBMEC-CM原液如3～10KD组分的两组WEHI-3集落与对照组比较无明显差异(P>0.05)，见表2。表2 不同分子量组分的mBMEC-CM对
WEHI-3细胞集落生长的影响 组 别
WEHI-3集落数(1?000个/皿±s)
对照组
168.78±9.46
>10KD组
100.43±18.06*
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<3KD组
137.34±6.75*
3～10KD组
154.32±10.37
mBMEC-CM原液组
162.12±10.79
注：*与对照组比较P<0.013 讨论
大量研究表明，骨髓造血微环境中包括内皮细胞在内的基质细胞通过产生细胞生长因子调控造血干/祖细胞的增殖和分化，这是骨髓基质细胞调控造血的一种重要方式[1]，在体外培养条件下，骨髓基质细胞可分泌产生多种造血调控生长因子进入培养上清，检测各类基质细胞培养上清对造血调控的活性，最终发现和提取其中的活性因子，是研究造血基质细胞造血调控功能的重要手段之一[2]。
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本研究应用超滤技术将小鼠骨髓内皮细胞无血清培养上清，分成不同分子量组分，分别检测这些组分对小鼠粒单系白血病细胞集落生成的影响，结果显示，mBMEC-CM原液和3～10KD组分对WEHI-3集落生长未见明显的抑制和促进作用，而>10KD组分和<3KD组分的mBMEC-CM对WEHI-3细胞集落的生长表现出明显的抑制作用，说明内皮细胞可通过分泌细胞抑制因子进入培养上清，这些分子包括大分子和小分子物质。
根据Almeida-Dorada G等报道[3]，骨髓内皮细胞表达TGF-βmRNA，TGF-β分子量为25?000Dalton，>10KD组分的骨髓内皮细胞条件培养液对WEHI-3的抑制作用可能与TGF-β有关。已报道的细胞增殖的小分子抑制物有MIP-1D，PGE等[4]，但骨髓内皮细胞分泌何种小分子抑制物有待进一步研究。
参考文献
1，胡维明.造血基质细胞与造血因子.中国实验血液学杂志，1993；1(2)：97～98
, http://www.100md.com
2，Eaves CJ,Cashman JD,Kay RJ,et al.Mechanisms that regulate the cell cycle status of very primitive himatopoietic cells in Long-tem human marrow cultures produced by stroman cells with in the adherent layer.Blood,1991:78～110
3，Almeida-Dorada G,Aseensao TL.Isolation Characterization and bilogic features of bone marrow endothelial cells.J Lab Clin Med,1996:128～339
4，Roy V,Verfaillie CM.Soluble factor(s) produces by bone marrow stroma inhibit in vitro proliferation and differention of fetal liver BFU-E by inducing apoptosis.J Clin Invest,1997;100:912～920, http://www.100md.com