骨髓内皮细胞无血清条件培养液对CFU-E和BFU-E生成的影响
作者：黄艳红 李卫民 蒋德昭 王绮如
单位：黄艳红(血液生理研究室 长沙 410078)；李卫民(血液生理研究室 长沙 410078)；蒋德昭(血液生理研究室 长沙 410078)；王绮如(血液生理研究室 长沙 410078)
关键词：骨髓细胞；内皮细胞；细胞学技术；造血细胞；细胞；培养的；小鼠
湖南医科大学学报000238 [摘要] 利用本室建立的小鼠骨髓内皮细胞株作传 代培养， 收集其无血清条件培养液，离心超滤，观察分子量(MW)>10000组分及分子量<10000组分 对红系生成的影响。结果表明：分子量>10000组分对CFU-E和BFU-E有明显刺激作用， 且在2%～6%(V/V，下同)范围内集落产率随浓度增加而增加；而分子量<10000组分对CFU- E，BFU-E有明显抑制作用，且在10%～40%范围内集落产率随浓度增加而降低。
, 百拇医药
[中图分类号] R331.22 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0201-02
Effects of serum-free murine bone marrow endothelial cell
conditioned medium on the growth of CFU-E and BFU-E
HUANG Yan-hong, LI Wei-min, JIANG De-zhao, WANG Qi-ru
Research Laboratory of Blood Physiology, Hunan Medical University(Changsh a 410078)
[Abstract] Serum-free murine bone marrow endothelial cell con ditioned medium(mBMEC-cm) was collected. The mBMEC-cm was ultrafiltered in Cen triprep. The concentrated retentive substance of mBMEC-cm(MW>10000) and filtr ate of mBMEC-cm(MW<10000) were obtained. The effects of mBMEC-cm on the growth of CFU-E and BFU-E were investigated. The results showed: ① The retentive sub st ance of mBMEC-cm significantly enhanced the growth of CFU-E and BFU-E. The ef fects of mBMEC-cm(2%～6%, V/V) on the growth of CFU-E and BFU-E were dose-de pendent. ② The filtrate of mBMEC-cm markedly inhibited the growth of CFU-E an d BFU-E. The effects of the filtrate of mBMEC-cm on the growth of CFU-E and B FU-E were also dose-dependent. The mechanism of regulation will be studied fur ther.
, 百拇医药
[Key words] bone marrow cells; endothelium; hematopo ietic stem cells; cells,cultured; cytological techniques; mice
骨髓内皮细胞是骨髓造血微环境的重要组成部分 ，对造血 干/祖细胞的生长发育有重要调节作用[1，2]。近二十年来，人们对内皮细胞参 与造血调控的认识大多来源于非骨髓来源的内皮细胞[3]。近年来，有关骨髓内皮 细胞对造血干细胞及粒/巨噬系祖细胞的调节已有报道，但骨髓内皮细胞对红系祖细胞生成 的影响尚未见报道。作者研究了小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液(mBMEC-cm)经离心超 滤后的不同组分对红系集落生成的影响，旨在进一步阐明骨髓内皮细胞对造血调控的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 细胞来源 小鼠骨髓内皮细胞由本室新建[4]；小鼠粒单系白血 病细胞株(WEHI-3 cell line)由中国军事医学科学院吴祖泽教授赠送。
1.1.2 动物 Balb/c小鼠，2月龄。
1.1.3 试剂与仪器 DMEM培养粉、IMDM培养粉、谷氨酰胺、甲基纤维素均 系Sigma产品；新生牛血清(NBS)系杭州四季青生物工程研究所产品；马血清系军事医学科学 院产品；重组人促红细胞生成素(rhEPO)为Genzyme产品；2-巯基乙醇为西德Merck产品；爆 式集落刺激因子(BPA)及WEHI-3细胞条件培养液由本室制备；离心超滤浓缩器(centriprep concentrator)产自Amico公司，centriprep-10型，截留分子量为10000。
1.2 方法
1.2.1 小鼠骨髓内皮细胞株传代培养 小鼠骨髓内皮细胞培养于10% NBS的DMEM培 养液及20% WEHI-3条件培养液中，置37℃，5% CO2，饱和湿度条件下进行传代培养。每 周1～2次全量换液。
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1.2.2 小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液的收集与超滤 小鼠骨髓内皮 细胞株传代培养过程中，在细胞贴壁生长状态良好，细胞亚融合贴壁形成时，吸出培养液， 用预温37℃的PBS洗培养瓶3次；然后每cm2细胞层加入约0.1ml DMEM培养液，不加血清 ，置37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养48h；取出培养液，离心，吸上清液，用0.45 μm孔径的混合醋酸纤维膜过滤，用centriprep-10型离心超滤浓缩器超滤。将小鼠骨髓 内皮细胞无血清条件培养液分为分子量>10000组分和<10000组分。>10000组分者再加 DMEM培养液稀释，分别用原超滤浓缩器超滤。如此反复，使分子量>10000成分被浓缩5倍 ，残留的小分子物质被稀释约500倍。分别过滤除菌，分装，4℃保存备用。
1.2.3 小鼠骨髓细胞悬液的制备 颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取出股 骨，用培养液冲出骨髓，制成单细胞悬液计数备用。
1.2.4 CFU-E和BFU-E培养 CFU-E及BFU-E培养体系为：30%马血清，0 .8%(W/V)甲基纤维素，rhEPO 2U.ml-1，10% BPA，0.045%谷氨酰胺，10-5 mol.ml-1 2-巯基乙醇，细胞终浓度5×104个.ml-1。实验组加入小 鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液，用不同浓度作量效关系测定。各组培养体系为2ml， 每组接种3皿，每皿接种0.5ml，置37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养。第3d显微 镜下计数CFU-E数，第7d计数BFU-E数。
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1.2.5 统计学处理 每组实验重复3次以上。结果以
±s表示 。微机Sigmaplot for window软件分析并作图。两组间均数比较用t检验。
2 结 果
将小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液分子量>10000组分的浓缩保留液(加6%)及分子量<1 0000组分(加30%)的超滤液，分别加入小鼠CFU-E和BFU-E培养体系。结果显示：与对照 组相比，分子量>10000组分能显著刺激CFU-E，BFU-E生长；而分子量<10000组分使CF U-E，BFU-E产率降低(图1A，图1B)。加入不同浓度(2%～8%)分子量>10000组分及不同浓 度(10%～40%)分子量<10000组分的内皮细胞无血清条件培养液作量效关系测定。结果显示 ：与对照组比较分子量>10000组分在2%～6%范围内CFU-E和BFU-E集落产率随浓度增加而 增加，但当加入浓度高达8%时，CFU-E，BFU-E集落产率回降；而分子量<10000组分CFU -E，BFU-E集落产率随浓度增加而减少(图2A，图2B)。
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图1 小鼠骨髓内皮细胞条件培养液对红系 祖细胞集落生成的影响
A：CFU-E，B：BFU-E 与对照组比较：①P<0.05,②P<0.01
Fig.1 Effects of m BMEC-cm on the growth of CFU-E(A) and BFU-E(B)
Compared with control: ①P<0.01,②P<0.01
图2 小鼠骨髓内皮细胞条件培养液的浓度与红 系集落生成数之间的量效关系
括号内数字为分子量<10000组分浓度 A：CFU-E，B：BFU-E
, 百拇医药
●:>10000组分，▲：<10000组分 与对照组比较：①P<0.05,②P<0.01
Fig.2 Dose-response curves of mBMEC-cm on the growth of CFU-E(A) and BFU-E(B)
Numbers in parentheses are concentration values of MW<10000 component of BMEC -cm. ●: >10000 component,. ▲: <10000 component. Compared with control: ①P<0.05, ②P<0.01
3 讨 论
骨髓内皮细胞是骨髓造血微环境的重要组成部分，能分泌多种造血细胞生长因子、抑制因子 及粘附因子，对造血干/祖细胞的生长发育有重要调控作用。mRNA检测表明，骨髓内皮细胞 表达IL-1，IL-6，SCF和TGF-β[5]。分子量>10000组分的内皮细胞条件培养 液对红系祖细胞集落生成的刺激作用可能与这一组分中含有IL-1，IL-6，SCF等刺激因子 有关；而加入分子量>10000组分的浓度高达8%时，对CFU-E和BFU-E的刺激作用减弱可能 与TGF-β浓度增加有关。分子量<10000组分中对CFU-E和BFU-E生成起抑制作用 的物质正在进一步研究，其作用机制有待进一步探索。
, 百拇医药
参考文献：
[1] 余敏，汪保和，王绮如.造血微环境的结构.见：徐有恒，王绮 如主编.造血生理学和造血细胞检测技术[M].长沙：湖南科学技术出版社，1997：154-15 8.
[2] Allen TD, Dexter TM. The essential cells of the hematopoietic macroenviro ment[J]. Exp Hematol, 1984,12:517-521.
[3] Yamaguchi H, Ishh E, Saito S, et al. Umbilical vein endothelial cells are an important source of c-kit and stem cell factor which regulate the proliferation of hemop oietic progenitor cells[J]. Br J Hematol, 1996,94(4):606-611.
[4] Wang QR, Yan Y, Wang BH, et al. Long-term culture of murine bone mor row derived endothelial cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol, 1998,34:443-446.
[5] Almeida-Porada G and Ascenaao JL. Isolation, characterization, and biolo gic feature of bone marrow endothelial cells[J]. J Lab Clin Med, 1996,128:399- 407., 百拇医药
单位：黄艳红(血液生理研究室 长沙 410078)；李卫民(血液生理研究室 长沙 410078)；蒋德昭(血液生理研究室 长沙 410078)；王绮如(血液生理研究室 长沙 410078)
关键词：骨髓细胞；内皮细胞；细胞学技术；造血细胞；细胞；培养的；小鼠
湖南医科大学学报000238 [摘要] 利用本室建立的小鼠骨髓内皮细胞株作传 代培养， 收集其无血清条件培养液，离心超滤，观察分子量(MW)>10000组分及分子量<10000组分 对红系生成的影响。结果表明：分子量>10000组分对CFU-E和BFU-E有明显刺激作用， 且在2%～6%(V/V，下同)范围内集落产率随浓度增加而增加；而分子量<10000组分对CFU- E，BFU-E有明显抑制作用，且在10%～40%范围内集落产率随浓度增加而降低。
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[中图分类号] R331.22 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0201-02
Effects of serum-free murine bone marrow endothelial cell
conditioned medium on the growth of CFU-E and BFU-E
HUANG Yan-hong, LI Wei-min, JIANG De-zhao, WANG Qi-ru
Research Laboratory of Blood Physiology, Hunan Medical University(Changsh a 410078)
[Abstract] Serum-free murine bone marrow endothelial cell con ditioned medium(mBMEC-cm) was collected. The mBMEC-cm was ultrafiltered in Cen triprep. The concentrated retentive substance of mBMEC-cm(MW>10000) and filtr ate of mBMEC-cm(MW<10000) were obtained. The effects of mBMEC-cm on the growth of CFU-E and BFU-E were investigated. The results showed: ① The retentive sub st ance of mBMEC-cm significantly enhanced the growth of CFU-E and BFU-E. The ef fects of mBMEC-cm(2%～6%, V/V) on the growth of CFU-E and BFU-E were dose-de pendent. ② The filtrate of mBMEC-cm markedly inhibited the growth of CFU-E an d BFU-E. The effects of the filtrate of mBMEC-cm on the growth of CFU-E and B FU-E were also dose-dependent. The mechanism of regulation will be studied fur ther.
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[Key words] bone marrow cells; endothelium; hematopo ietic stem cells; cells,cultured; cytological techniques; mice
骨髓内皮细胞是骨髓造血微环境的重要组成部分 ，对造血 干/祖细胞的生长发育有重要调节作用[1，2]。近二十年来，人们对内皮细胞参 与造血调控的认识大多来源于非骨髓来源的内皮细胞[3]。近年来，有关骨髓内皮 细胞对造血干细胞及粒/巨噬系祖细胞的调节已有报道，但骨髓内皮细胞对红系祖细胞生成 的影响尚未见报道。作者研究了小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液(mBMEC-cm)经离心超 滤后的不同组分对红系集落生成的影响，旨在进一步阐明骨髓内皮细胞对造血调控的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 细胞来源 小鼠骨髓内皮细胞由本室新建[4]；小鼠粒单系白血 病细胞株(WEHI-3 cell line)由中国军事医学科学院吴祖泽教授赠送。
1.1.2 动物 Balb/c小鼠，2月龄。
1.1.3 试剂与仪器 DMEM培养粉、IMDM培养粉、谷氨酰胺、甲基纤维素均 系Sigma产品；新生牛血清(NBS)系杭州四季青生物工程研究所产品；马血清系军事医学科学 院产品；重组人促红细胞生成素(rhEPO)为Genzyme产品；2-巯基乙醇为西德Merck产品；爆 式集落刺激因子(BPA)及WEHI-3细胞条件培养液由本室制备；离心超滤浓缩器(centriprep concentrator)产自Amico公司，centriprep-10型，截留分子量为10000。
1.2 方法
1.2.1 小鼠骨髓内皮细胞株传代培养 小鼠骨髓内皮细胞培养于10% NBS的DMEM培 养液及20% WEHI-3条件培养液中，置37℃，5% CO2，饱和湿度条件下进行传代培养。每 周1～2次全量换液。
, http://www.100md.com
1.2.2 小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液的收集与超滤 小鼠骨髓内皮 细胞株传代培养过程中，在细胞贴壁生长状态良好，细胞亚融合贴壁形成时，吸出培养液， 用预温37℃的PBS洗培养瓶3次；然后每cm2细胞层加入约0.1ml DMEM培养液，不加血清 ，置37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养48h；取出培养液，离心，吸上清液，用0.45 μm孔径的混合醋酸纤维膜过滤，用centriprep-10型离心超滤浓缩器超滤。将小鼠骨髓 内皮细胞无血清条件培养液分为分子量>10000组分和<10000组分。>10000组分者再加 DMEM培养液稀释，分别用原超滤浓缩器超滤。如此反复，使分子量>10000成分被浓缩5倍 ，残留的小分子物质被稀释约500倍。分别过滤除菌，分装，4℃保存备用。
1.2.3 小鼠骨髓细胞悬液的制备 颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取出股 骨，用培养液冲出骨髓，制成单细胞悬液计数备用。
1.2.4 CFU-E和BFU-E培养 CFU-E及BFU-E培养体系为：30%马血清，0 .8%(W/V)甲基纤维素，rhEPO 2U.ml-1，10% BPA，0.045%谷氨酰胺，10-5 mol.ml-1 2-巯基乙醇，细胞终浓度5×104个.ml-1。实验组加入小 鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液，用不同浓度作量效关系测定。各组培养体系为2ml， 每组接种3皿，每皿接种0.5ml，置37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养。第3d显微 镜下计数CFU-E数，第7d计数BFU-E数。
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1.2.5 统计学处理 每组实验重复3次以上。结果以
±s表示 。微机Sigmaplot for window软件分析并作图。两组间均数比较用t检验。2 结 果
将小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液分子量>10000组分的浓缩保留液(加6%)及分子量<1 0000组分(加30%)的超滤液，分别加入小鼠CFU-E和BFU-E培养体系。结果显示：与对照 组相比，分子量>10000组分能显著刺激CFU-E，BFU-E生长；而分子量<10000组分使CF U-E，BFU-E产率降低(图1A，图1B)。加入不同浓度(2%～8%)分子量>10000组分及不同浓 度(10%～40%)分子量<10000组分的内皮细胞无血清条件培养液作量效关系测定。结果显示 ：与对照组比较分子量>10000组分在2%～6%范围内CFU-E和BFU-E集落产率随浓度增加而 增加，但当加入浓度高达8%时，CFU-E，BFU-E集落产率回降；而分子量<10000组分CFU -E，BFU-E集落产率随浓度增加而减少(图2A，图2B)。
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图1 小鼠骨髓内皮细胞条件培养液对红系 祖细胞集落生成的影响
A：CFU-E，B：BFU-E 与对照组比较：①P<0.05,②P<0.01
Fig.1 Effects of m BMEC-cm on the growth of CFU-E(A) and BFU-E(B)
Compared with control: ①P<0.01,②P<0.01
图2 小鼠骨髓内皮细胞条件培养液的浓度与红 系集落生成数之间的量效关系
括号内数字为分子量<10000组分浓度 A：CFU-E，B：BFU-E
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●:>10000组分，▲：<10000组分 与对照组比较：①P<0.05,②P<0.01
Fig.2 Dose-response curves of mBMEC-cm on the growth of CFU-E(A) and BFU-E(B)
Numbers in parentheses are concentration values of MW<10000 component of BMEC -cm. ●: >10000 component,. ▲: <10000 component. Compared with control: ①P<0.05, ②P<0.01
3 讨 论
骨髓内皮细胞是骨髓造血微环境的重要组成部分，能分泌多种造血细胞生长因子、抑制因子 及粘附因子，对造血干/祖细胞的生长发育有重要调控作用。mRNA检测表明，骨髓内皮细胞 表达IL-1，IL-6，SCF和TGF-β[5]。分子量>10000组分的内皮细胞条件培养 液对红系祖细胞集落生成的刺激作用可能与这一组分中含有IL-1，IL-6，SCF等刺激因子 有关；而加入分子量>10000组分的浓度高达8%时，对CFU-E和BFU-E的刺激作用减弱可能 与TGF-β浓度增加有关。分子量<10000组分中对CFU-E和BFU-E生成起抑制作用 的物质正在进一步研究，其作用机制有待进一步探索。
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参考文献：
[1] 余敏，汪保和，王绮如.造血微环境的结构.见：徐有恒，王绮 如主编.造血生理学和造血细胞检测技术[M].长沙：湖南科学技术出版社，1997：154-15 8.
[2] Allen TD, Dexter TM. The essential cells of the hematopoietic macroenviro ment[J]. Exp Hematol, 1984,12:517-521.
[3] Yamaguchi H, Ishh E, Saito S, et al. Umbilical vein endothelial cells are an important source of c-kit and stem cell factor which regulate the proliferation of hemop oietic progenitor cells[J]. Br J Hematol, 1996,94(4):606-611.
[4] Wang QR, Yan Y, Wang BH, et al. Long-term culture of murine bone mor row derived endothelial cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol, 1998,34:443-446.
[5] Almeida-Porada G and Ascenaao JL. Isolation, characterization, and biolo gic feature of bone marrow endothelial cells[J]. J Lab Clin Med, 1996,128:399- 407., 百拇医药