瘢痕瘤组织中肿瘤抑制基因Rb、p53 PCR-SSCP分析
作者：姜笃银 徐明达 陈璧 胡大海
单位：姜笃银 徐明达 陈璧 胡大海(第四军医大学西京医院烧伤科，西安 710032)
关键词：瘢痕疙瘩；基因；视网膜母细胞瘤；p53基因；聚合酶链反应；多态单链构象现象
临床与实验病理学杂志990505摘要 目的：探讨瘢痕瘤的发生及其侵袭性生长失控的分子生物学基础。方法：以正常皮肤为对照，对增生性瘢痕和瘢痕瘤组织的DNA样本分别作Rb exon(14,27)和p53 exon (5～8) PCR-SSCP分析。结果：26.1%(6/23)的瘢痕瘤于Rb exon 27处有异常电泳带，p53 exon (5～8)及其它标本均未见异常。结论：瘢痕瘤的发生或其侵袭性生长失控可能与Rb肿瘤抑制基因突变或缺失有关。
分类号 R619.6；R730.2 文献标识码 A
, 百拇医药
文章编号 1001-7399(1999)05-0390-03
Study on tumor suppressor genes Rb and p53 in keloid tissue by PCR-SSCP analysis
Jiang Duyin, Xu Mingda, Chen Bi et al
(Dept of Burn Unit, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032)
ABSTRACT Purpose To clarify the molecular pathological basis of infiltrating growth and onset of keloid. Methods The tumor suppressor genes Rb exon (14,27) and p53 exon (5～8) were investigated in the specimens from normal skin, hypertrophic scar and keloid tissues using polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism analysis. Results The results demonstrated that mutation occurred in Rb exon 27 in 26.1% of keloid specimens without investigated genes mutation in the other tissue specimens. Conclusion The infiltrating growth and onset of keloid might be related to the mutation or loss of Rb tumor suppressor gene.
, 百拇医药
KEY WORDS keloid; genes, vetinoblastoma; genes, p53; polymerase chain reaction; polymorphism single-stranded comformational
瘢痕疙瘩又叫瘢痕瘤(keloid)，是有色人种较多见的一种创伤性皮肤病理反应。其发病机制不清，术后极易复发，是外科难以解决的问题之一〔1〕。1989年Orita等〔2〕首次报道单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)分析技术，现在聚合酶链反应(PCR)-SSCP分析技术已成为突变基因和DNA多态性的快速筛选和检测的重要手段。肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene, TSG)又称抑癌基因或抗癌基因，是正常细胞增殖的重要稳定因素。为此，笔者对人正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕瘤标本采用视网膜母细胞瘤易感基因(retinoblastoma susceptibility gene, Rb gene)和p53基因组外显子PCR-SSCP分析方法，以探讨瘢痕瘤的发生机制。
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1 材料和方法
1.1 组织标本 23例瘢痕瘤(K组)均来自我院门诊及住院手术治疗的患者，年龄2～45岁之间，男性10例，女性13例，病程1～7年，术前均未作化疗或放射性治疗。另外收集烧伤愈合3～24个月的17例增生性瘢痕(HS组)和正常皮肤(NS)标本，年龄、性别不限。标本用4%多聚甲醛缓冲液固定，瘢痕标本均经临床和病理确诊，无恶性变。
1.2 主要试剂和仪器 NP-40、溴化乙锭、Tag DNA聚合酶、去离子甲酰胺和TEMED(Promega Co)，琼脂糖(上海化学试剂厂)、三磷酸脱氧核苷(dATP、dGTP、dCTP、dTTP,4×dNTP)和蛋白酶K(Sigma Co)，丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺、RNasin、PGEM-3Zf (+) DNA-Hae Ⅲ(华美公司)，EDTA、过硫酸铵、氯仿等(西安化学试剂厂)；Gene Quant (Pharmacia Co)，480型基因扩增仪(PE Co， USA)、测序高压电泳仪(BIO-RAD Co, USA)，恒温循环仪(军科院)，稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)等。Rb和p53 PCR引物参照文献〔3，4〕分别由第四军医大学西京医院临床分子生物学研究室和北京医科大学分子病理学实验室合成，测序分析符合设计要求，引物序列见表1。
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表1 Rb、p53引物及PCR扩增条件和产物 引物名称及
外显子位置
核苷酸序列〔3,4〕
PCR扩增条件〔5〕
扩增片段长度(bp)
Rb exon 14
5' CTA AAA TAG CAG GCT CTT ATT TTT C 3'
Heat initiation; 35×
212
5' ATC TTG ATG CCT TGA CCT CCT GA 3'
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94℃,30s; 58℃,45s; 72℃,1 min
Rb exon 27
5' AAG GTC CTG AGC GCC ATC AGT TTG A 3'
Heat initiation;35×
218
5' GAG GTG TAC ACA GTG TCC ACC AAUG 3'
94℃,30 s;60℃,45 s;72℃,1 min
p53 exon 5
5' TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG A 3'
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Heat initiation; 35×
181
5' CGC TAT CTG AGC AGC GCT CAT G 3'
94℃,30 s;55℃,45 s;72℃,1 min
p53 exon 6
5' GAT TGC TCT TAG GTC TGG CCC CT 3'
Heat initiation; 35×
132
5' CAG ACC TCA GGC GGC TCA TAG G 3'
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94℃,30 s;60℃,45 s;72℃,1 min
p53 exon 7
5' CTA GGT TGG CTC TGA CTG TAC CA 3'
Heat initiation; 35×
119
5' TGA CCT GGA GTC TTC CAG TGG G 3'
94℃，30 s; 55℃, 45s; 72℃,1 min
p53 exon 8
5' GTA GTG GTA ATC TAC TGG GAC GGA 3'
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Heat initiation; 35×
143
5' CTC GCT TAG TGC TCC CTG TCC CTG GGG GC 3'
94℃，30 s; 55℃,45 s;72℃, 1 min
1.3 实验方法
1.3.1 DNA提取 分别收集10 μm组织切片5～10片(每次间隙用二甲苯、乙醇清洗刀片)，于1.5 ml EP管中，二甲苯脱蜡，乙醇、丙酮去二甲苯后，按经典方法抽提基因组DNA。DNA干燥后以20 μl 0.01 mol.L-1 TE溶解，测吸光度OD 260/280，检测DNA纯度和浓度，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的完整性。
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1.3.2 PCR 采用热启动PCR方法〔5〕。在0.5 ml EP管中加入以下试剂：10×PCR缓冲液2.5 μl，5 mmol.L-1 dNTP 1.0 μl, 5 μmol.L-1的引物各2.0 μl，模板DNA 200～1 000 ng，总体积为25 μl。加入液体石蜡油后，沸水浴7～10 min预变性，移至72℃，迅速加入Taq DNA聚合酶1.0 U，并保温5 min，进行首次延伸，随后进入PCR循环。各引物PCR循环条件见表1。进行35个循环，末次循环72℃延伸5 min。
PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳，以DNA标准品PGEM-3zf(+)DNA-Hae Ⅲ为参照，电压5 V/cm，电泳1.5 h，经溴化乙锭染色，253 nm紫外灯下观察结果。
1.3.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAG)垂直平板电泳 根据扩增产物分子量的大小采用内含5%甘油的8% PAG (aer∶bis=49∶1)，常规灌制125 mm×100 mm×1 mm垂直平板PAG，室温下聚合2 h，预电泳30 min后待用。根据琼脂糖凝胶电泳结果，将PCR产物用TE做适当稀释，与等体积碱变性缓冲液(0.5 mol.L-1 NaOH和10 mmol.L-1 EDTA)混匀，42℃ 10 min或37℃ 30 min进行碱变性，然后迅速上样进行电泳。电泳条件：10℃～20℃，0.5×TE，恒功率2 W(电流≤12 mA)，2 h。
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1.3.4 硝酸银染色 电泳后的PAG，用10%乙醇和0.5%冰乙酸混合液固定10 min，双蒸水洗2 min×2，加0.1%硝酸银染色液，摇床上15～30 min，双蒸水洗，显影液(1.5% NaOH和0.4%甲醛)1～5 min，10%冰乙酸终止显色。
1.3.5 结果分析 根据DNA单链条带(ssDNA)泳动变位情况，进行结果分析，与NS或HS组相比，凡发生泳动变位者即提示有基因突变〔2〕。本文选择PAG干燥保存后照相。
2 结果
2.1 PCR产物琼脂糖电泳 利用热启动PCR扩增Rb exon(14,27)和p53 exon(5～8)，可使目的DNA获得始终一致的特异性扩增产物。NS组、HS组和K组3组DNA样本经PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳结果一致，未见异常电泳带。
2.2 SSCP分析 PCR扩增产物经碱变性后，可使扩增的双链DNA(dsDNA)变性解开成ssDNA,HS组和NS组Rb exon(14,27)和p53 exon(5～8)PCR-SSCP分析结果，未见异常泳动条带。K组经PCR-SSCP分析，23例中有6例在Rb exon 27位置出现异常泳动条带，余引物未见异常。重复检测，结果一致。
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3 讨论
瘢痕是皮肤损伤后真皮层继发的、主要由纤维母细胞增生引起的胶原和基质沉积。与增生性瘢痕比较，瘢痕瘤主要病理表现为大量致密、漩涡状排列的、透明变性的胶原纤维束和分裂象较多的纤维母细胞。该病多继发于皮肤损害，其临床特征是在原损伤的部位瘢痕持续性向周边正常皮肤侵袭生长；手术后极易复发，病变呈瘤样增生，故有人又称之为愈合的人体皮肤创伤反应或良性皮肤肿瘤〔1，6〕；该病有家族遗传倾向，虽然有人曾提出常染色体显性遗传，但同一年龄组两性发生率相等。因缺乏充分的分子生物学基础的指导，至今没有一种方法能有效控制其较高的复发率或侵袭性生长〔1，7〕。因此，迫切需要对瘢痕瘤开展深入的研究，从基因水平探讨其发生、发展的机制。
本研究采用以PCR为基础的SSCP分析技术，检测了3组不同来源的皮肤组织中Rb exon(14,27)和p53 exon(5～8)的突变情况，结果发现，23例瘢痕瘤组织有6例有Rb exon 27位点发生了突变，突变率为26.1%(6/23)，其余均为阴性。我们认为瘢痕瘤实际基因突变的阳性率可能会更高，其理由：①仅Rb和p53的外显子就有38个，本研究中只选择了其中6个突变高发的外显子进行了检测；②影响PCR-SSCP分析的因素很多，不能排除假阴性的可能〔8〕；③临床上瘢痕瘤侵袭生长的速率相差十分悬殊，临床和病理诊断有其局限性，提示可能与有无基因突变相关。Rb蛋白的磷酸化为Rb基因调节细胞生长和分化的主要形式。在细胞周期G1期，Rb蛋白为去磷酸化状态，而在G2期、S、M期为磷酸化状态，细胞G1/S期Rb蛋白磷酸化调节Rb在细胞周期中的行为有关，非磷酸化的Rb蛋白对细胞增殖起负性调节作用〔9，10〕。因此，Rb蛋白可能是细胞对环境抑制信息(如皮肤损伤)做出反应的中间环节，其功能丧失(即Rb基因突变)可使细胞对外界的抑制信息失去反应能力，造成细胞无限制的生长和增殖，最后导致肿瘤形成〔2〕。这可能就是部分瘢痕瘤Rb基因突变后组织中纤维母细胞侵袭性生长失控的主要机理。
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临床上瘢痕瘤虽有局部浸润生长特点，但无深部组织或远位器官转移等恶性变报道，该现象可能与只表现Rb基因突变，而无p53基因突变有关。近年研究报道〔10〕显示，同是TSG APC基因突变可以早于腺瘤-腺癌序列过程的K-ras基因突变，如在家族性结肠腺瘤样息肉病患者中，轻～中度腺瘤APC基因的突变率极低(<2%)，而重度腺瘤及浸润性癌中突变率显著上升〔11〕。瘢痕瘤Rb基因突变是否也有类似APC基因在家族性结肠腺瘤样息肉病中的突变规律还有待研究。本研究中的6例发生于Rb exon 27突变的瘢痕瘤，与17例阴性的瘢痕瘤比较，临床上向周边正常皮肤侵袭性生长快速。提示部分瘢痕瘤的发生与Rb基因突变或丢失有关，且其侵袭性生长失控的特性可能还与Rb exon 27基因突变后组织中纤维母细胞高表达血管内皮细胞生长因子和碱性纤维母细胞生长因子及其受体等有关〔12〕。该研究结果为国内外首次发现，建议加强瘢痕疙瘩基因诊断和基因治疗研究。
作者简介：姜笃银，男，36岁，博士，讲师
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参考文献
1，孙家明. 瘢痕疙瘩研究和治疗进展. 国外医学创伤与外科基本问题分册，1994；15(1)：24～26
2，Oritx M, Iwahana H, Kanazawa H et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel eletrophoresis as single strand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci USA,1989;86(14):2766～2771
3，Hogg A. Detection of heterozygous mutations in the Rb1 gene in retinoblastoma patients using single-strand conformation polmorphism analysis and polymerase chain reaction sequencing. Oncogene,1992;7(7):1445～1451
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4，Buchman VL, Masayuki O, Naohiro T et al. Afrequent alteration of p53 gene in carcioma in adenoma. Cancer Res,1994;54(17):4789～4804
5，Elich HA. Recent advances in the polymerase chain reaction. Science,1991;252(8):1642～1648
6，Rusell SB, Trupin KM, Susan RE et al. Reduced growth-factor requirement of keloid-derived fibroblasts may a ccount for tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA,1988;85(2):587～591
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7，贾赤宇，付小兵，李培进. 瘢痕和溃疡的形成与控制. 见：付小兵，王德文主编. 创伤修复基础. 北京：人民军医出版社，1997：202～216
8，Hayashi K. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutant, 1993;2(5):338～348，9，Cooper JA, Whyte P. Rb and the cell cycle:enterance or exit? Cell,1989;58(6):1009～1011
10，Whyte P, Horowitz KJ, Friend JM et al. Association between oncogene and an antioncogene:the adenovirus E1A proteins bind to the retinoblastoma gene product. Nature,1988;334(10):124～127
11，Powell SM, Zilz N, Yasmin BB et al. APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature,1992;358(2):235～240
12，姜笃银，徐明达，陈 璧等. 瘢痕疙瘩组织血管生成因子及其受体表达的意义. 第四军医大学学报，1998；19(4)：470～471
收稿日期：1998-09-16
修回日期：1998-12-23, http://www.100md.com
单位：姜笃银 徐明达 陈璧 胡大海(第四军医大学西京医院烧伤科，西安 710032)
关键词：瘢痕疙瘩；基因；视网膜母细胞瘤；p53基因；聚合酶链反应；多态单链构象现象
临床与实验病理学杂志990505摘要 目的：探讨瘢痕瘤的发生及其侵袭性生长失控的分子生物学基础。方法：以正常皮肤为对照，对增生性瘢痕和瘢痕瘤组织的DNA样本分别作Rb exon(14,27)和p53 exon (5～8) PCR-SSCP分析。结果：26.1%(6/23)的瘢痕瘤于Rb exon 27处有异常电泳带，p53 exon (5～8)及其它标本均未见异常。结论：瘢痕瘤的发生或其侵袭性生长失控可能与Rb肿瘤抑制基因突变或缺失有关。
分类号 R619.6；R730.2 文献标识码 A
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文章编号 1001-7399(1999)05-0390-03
Study on tumor suppressor genes Rb and p53 in keloid tissue by PCR-SSCP analysis
Jiang Duyin, Xu Mingda, Chen Bi et al
(Dept of Burn Unit, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032)
ABSTRACT Purpose To clarify the molecular pathological basis of infiltrating growth and onset of keloid. Methods The tumor suppressor genes Rb exon (14,27) and p53 exon (5～8) were investigated in the specimens from normal skin, hypertrophic scar and keloid tissues using polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism analysis. Results The results demonstrated that mutation occurred in Rb exon 27 in 26.1% of keloid specimens without investigated genes mutation in the other tissue specimens. Conclusion The infiltrating growth and onset of keloid might be related to the mutation or loss of Rb tumor suppressor gene.
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KEY WORDS keloid; genes, vetinoblastoma; genes, p53; polymerase chain reaction; polymorphism single-stranded comformational
瘢痕疙瘩又叫瘢痕瘤(keloid)，是有色人种较多见的一种创伤性皮肤病理反应。其发病机制不清，术后极易复发，是外科难以解决的问题之一〔1〕。1989年Orita等〔2〕首次报道单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)分析技术，现在聚合酶链反应(PCR)-SSCP分析技术已成为突变基因和DNA多态性的快速筛选和检测的重要手段。肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene, TSG)又称抑癌基因或抗癌基因，是正常细胞增殖的重要稳定因素。为此，笔者对人正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕瘤标本采用视网膜母细胞瘤易感基因(retinoblastoma susceptibility gene, Rb gene)和p53基因组外显子PCR-SSCP分析方法，以探讨瘢痕瘤的发生机制。
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1 材料和方法
1.1 组织标本 23例瘢痕瘤(K组)均来自我院门诊及住院手术治疗的患者，年龄2～45岁之间，男性10例，女性13例，病程1～7年，术前均未作化疗或放射性治疗。另外收集烧伤愈合3～24个月的17例增生性瘢痕(HS组)和正常皮肤(NS)标本，年龄、性别不限。标本用4%多聚甲醛缓冲液固定，瘢痕标本均经临床和病理确诊，无恶性变。
1.2 主要试剂和仪器 NP-40、溴化乙锭、Tag DNA聚合酶、去离子甲酰胺和TEMED(Promega Co)，琼脂糖(上海化学试剂厂)、三磷酸脱氧核苷(dATP、dGTP、dCTP、dTTP,4×dNTP)和蛋白酶K(Sigma Co)，丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺、RNasin、PGEM-3Zf (+) DNA-Hae Ⅲ(华美公司)，EDTA、过硫酸铵、氯仿等(西安化学试剂厂)；Gene Quant (Pharmacia Co)，480型基因扩增仪(PE Co， USA)、测序高压电泳仪(BIO-RAD Co, USA)，恒温循环仪(军科院)，稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)等。Rb和p53 PCR引物参照文献〔3，4〕分别由第四军医大学西京医院临床分子生物学研究室和北京医科大学分子病理学实验室合成，测序分析符合设计要求，引物序列见表1。
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表1 Rb、p53引物及PCR扩增条件和产物 引物名称及
外显子位置
核苷酸序列〔3,4〕
PCR扩增条件〔5〕
扩增片段长度(bp)
Rb exon 14
5' CTA AAA TAG CAG GCT CTT ATT TTT C 3'
Heat initiation; 35×
212
5' ATC TTG ATG CCT TGA CCT CCT GA 3'
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94℃,30s; 58℃,45s; 72℃,1 min
Rb exon 27
5' AAG GTC CTG AGC GCC ATC AGT TTG A 3'
Heat initiation;35×
218
5' GAG GTG TAC ACA GTG TCC ACC AAUG 3'
94℃,30 s;60℃,45 s;72℃,1 min
p53 exon 5
5' TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG A 3'
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Heat initiation; 35×
181
5' CGC TAT CTG AGC AGC GCT CAT G 3'
94℃,30 s;55℃,45 s;72℃,1 min
p53 exon 6
5' GAT TGC TCT TAG GTC TGG CCC CT 3'
Heat initiation; 35×
132
5' CAG ACC TCA GGC GGC TCA TAG G 3'
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94℃,30 s;60℃,45 s;72℃,1 min
p53 exon 7
5' CTA GGT TGG CTC TGA CTG TAC CA 3'
Heat initiation; 35×
119
5' TGA CCT GGA GTC TTC CAG TGG G 3'
94℃，30 s; 55℃, 45s; 72℃,1 min
p53 exon 8
5' GTA GTG GTA ATC TAC TGG GAC GGA 3'
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Heat initiation; 35×
143
5' CTC GCT TAG TGC TCC CTG TCC CTG GGG GC 3'
94℃，30 s; 55℃,45 s;72℃, 1 min
1.3 实验方法
1.3.1 DNA提取 分别收集10 μm组织切片5～10片(每次间隙用二甲苯、乙醇清洗刀片)，于1.5 ml EP管中，二甲苯脱蜡，乙醇、丙酮去二甲苯后，按经典方法抽提基因组DNA。DNA干燥后以20 μl 0.01 mol.L-1 TE溶解，测吸光度OD 260/280，检测DNA纯度和浓度，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的完整性。
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1.3.2 PCR 采用热启动PCR方法〔5〕。在0.5 ml EP管中加入以下试剂：10×PCR缓冲液2.5 μl，5 mmol.L-1 dNTP 1.0 μl, 5 μmol.L-1的引物各2.0 μl，模板DNA 200～1 000 ng，总体积为25 μl。加入液体石蜡油后，沸水浴7～10 min预变性，移至72℃，迅速加入Taq DNA聚合酶1.0 U，并保温5 min，进行首次延伸，随后进入PCR循环。各引物PCR循环条件见表1。进行35个循环，末次循环72℃延伸5 min。
PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳，以DNA标准品PGEM-3zf(+)DNA-Hae Ⅲ为参照，电压5 V/cm，电泳1.5 h，经溴化乙锭染色，253 nm紫外灯下观察结果。
1.3.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAG)垂直平板电泳 根据扩增产物分子量的大小采用内含5%甘油的8% PAG (aer∶bis=49∶1)，常规灌制125 mm×100 mm×1 mm垂直平板PAG，室温下聚合2 h，预电泳30 min后待用。根据琼脂糖凝胶电泳结果，将PCR产物用TE做适当稀释，与等体积碱变性缓冲液(0.5 mol.L-1 NaOH和10 mmol.L-1 EDTA)混匀，42℃ 10 min或37℃ 30 min进行碱变性，然后迅速上样进行电泳。电泳条件：10℃～20℃，0.5×TE，恒功率2 W(电流≤12 mA)，2 h。
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1.3.4 硝酸银染色 电泳后的PAG，用10%乙醇和0.5%冰乙酸混合液固定10 min，双蒸水洗2 min×2，加0.1%硝酸银染色液，摇床上15～30 min，双蒸水洗，显影液(1.5% NaOH和0.4%甲醛)1～5 min，10%冰乙酸终止显色。
1.3.5 结果分析 根据DNA单链条带(ssDNA)泳动变位情况，进行结果分析，与NS或HS组相比，凡发生泳动变位者即提示有基因突变〔2〕。本文选择PAG干燥保存后照相。
2 结果
2.1 PCR产物琼脂糖电泳 利用热启动PCR扩增Rb exon(14,27)和p53 exon(5～8)，可使目的DNA获得始终一致的特异性扩增产物。NS组、HS组和K组3组DNA样本经PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳结果一致，未见异常电泳带。
2.2 SSCP分析 PCR扩增产物经碱变性后，可使扩增的双链DNA(dsDNA)变性解开成ssDNA,HS组和NS组Rb exon(14,27)和p53 exon(5～8)PCR-SSCP分析结果，未见异常泳动条带。K组经PCR-SSCP分析，23例中有6例在Rb exon 27位置出现异常泳动条带，余引物未见异常。重复检测，结果一致。
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3 讨论
瘢痕是皮肤损伤后真皮层继发的、主要由纤维母细胞增生引起的胶原和基质沉积。与增生性瘢痕比较，瘢痕瘤主要病理表现为大量致密、漩涡状排列的、透明变性的胶原纤维束和分裂象较多的纤维母细胞。该病多继发于皮肤损害，其临床特征是在原损伤的部位瘢痕持续性向周边正常皮肤侵袭生长；手术后极易复发，病变呈瘤样增生，故有人又称之为愈合的人体皮肤创伤反应或良性皮肤肿瘤〔1，6〕；该病有家族遗传倾向，虽然有人曾提出常染色体显性遗传，但同一年龄组两性发生率相等。因缺乏充分的分子生物学基础的指导，至今没有一种方法能有效控制其较高的复发率或侵袭性生长〔1，7〕。因此，迫切需要对瘢痕瘤开展深入的研究，从基因水平探讨其发生、发展的机制。
本研究采用以PCR为基础的SSCP分析技术，检测了3组不同来源的皮肤组织中Rb exon(14,27)和p53 exon(5～8)的突变情况，结果发现，23例瘢痕瘤组织有6例有Rb exon 27位点发生了突变，突变率为26.1%(6/23)，其余均为阴性。我们认为瘢痕瘤实际基因突变的阳性率可能会更高，其理由：①仅Rb和p53的外显子就有38个，本研究中只选择了其中6个突变高发的外显子进行了检测；②影响PCR-SSCP分析的因素很多，不能排除假阴性的可能〔8〕；③临床上瘢痕瘤侵袭生长的速率相差十分悬殊，临床和病理诊断有其局限性，提示可能与有无基因突变相关。Rb蛋白的磷酸化为Rb基因调节细胞生长和分化的主要形式。在细胞周期G1期，Rb蛋白为去磷酸化状态，而在G2期、S、M期为磷酸化状态，细胞G1/S期Rb蛋白磷酸化调节Rb在细胞周期中的行为有关，非磷酸化的Rb蛋白对细胞增殖起负性调节作用〔9，10〕。因此，Rb蛋白可能是细胞对环境抑制信息(如皮肤损伤)做出反应的中间环节，其功能丧失(即Rb基因突变)可使细胞对外界的抑制信息失去反应能力，造成细胞无限制的生长和增殖，最后导致肿瘤形成〔2〕。这可能就是部分瘢痕瘤Rb基因突变后组织中纤维母细胞侵袭性生长失控的主要机理。
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临床上瘢痕瘤虽有局部浸润生长特点，但无深部组织或远位器官转移等恶性变报道，该现象可能与只表现Rb基因突变，而无p53基因突变有关。近年研究报道〔10〕显示，同是TSG APC基因突变可以早于腺瘤-腺癌序列过程的K-ras基因突变，如在家族性结肠腺瘤样息肉病患者中，轻～中度腺瘤APC基因的突变率极低(<2%)，而重度腺瘤及浸润性癌中突变率显著上升〔11〕。瘢痕瘤Rb基因突变是否也有类似APC基因在家族性结肠腺瘤样息肉病中的突变规律还有待研究。本研究中的6例发生于Rb exon 27突变的瘢痕瘤，与17例阴性的瘢痕瘤比较，临床上向周边正常皮肤侵袭性生长快速。提示部分瘢痕瘤的发生与Rb基因突变或丢失有关，且其侵袭性生长失控的特性可能还与Rb exon 27基因突变后组织中纤维母细胞高表达血管内皮细胞生长因子和碱性纤维母细胞生长因子及其受体等有关〔12〕。该研究结果为国内外首次发现，建议加强瘢痕疙瘩基因诊断和基因治疗研究。
作者简介：姜笃银，男，36岁，博士，讲师
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参考文献
1，孙家明. 瘢痕疙瘩研究和治疗进展. 国外医学创伤与外科基本问题分册，1994；15(1)：24～26
2，Oritx M, Iwahana H, Kanazawa H et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel eletrophoresis as single strand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci USA,1989;86(14):2766～2771
3，Hogg A. Detection of heterozygous mutations in the Rb1 gene in retinoblastoma patients using single-strand conformation polmorphism analysis and polymerase chain reaction sequencing. Oncogene,1992;7(7):1445～1451
, http://www.100md.com
4，Buchman VL, Masayuki O, Naohiro T et al. Afrequent alteration of p53 gene in carcioma in adenoma. Cancer Res,1994;54(17):4789～4804
5，Elich HA. Recent advances in the polymerase chain reaction. Science,1991;252(8):1642～1648
6，Rusell SB, Trupin KM, Susan RE et al. Reduced growth-factor requirement of keloid-derived fibroblasts may a ccount for tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA,1988;85(2):587～591
, 百拇医药
7，贾赤宇，付小兵，李培进. 瘢痕和溃疡的形成与控制. 见：付小兵，王德文主编. 创伤修复基础. 北京：人民军医出版社，1997：202～216
8，Hayashi K. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutant, 1993;2(5):338～348，9，Cooper JA, Whyte P. Rb and the cell cycle:enterance or exit? Cell,1989;58(6):1009～1011
10，Whyte P, Horowitz KJ, Friend JM et al. Association between oncogene and an antioncogene:the adenovirus E1A proteins bind to the retinoblastoma gene product. Nature,1988;334(10):124～127
11，Powell SM, Zilz N, Yasmin BB et al. APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature,1992;358(2):235～240
12，姜笃银，徐明达，陈 璧等. 瘢痕疙瘩组织血管生成因子及其受体表达的意义. 第四军医大学学报，1998；19(4)：470～471
收稿日期：1998-09-16
修回日期：1998-12-23, http://www.100md.com