c-myc反义核苷酸在治疗血液系统恶性肿瘤中的应用进展
作者：刘庭波
单位：刘庭波(福建医科大学 附属协和医院，福建省血液病研究所,福州 350001)
关键词：核苷酸类；原癌基因；蛋白质c-myc类；血液肿瘤,治疗；基因，myc
福建医科大学学报000139
中图分类号:R733.05;Q753 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)01-0083-03
反义核苷酸用于治疗恶性肿瘤是近十年来基因治疗的热点，反义核苷酸应用的基础在于反义核苷酸已从原来天然的形态经人工修饰加工，成为有实用价值的寡聚核苷酸，其中硫代磷酸寡核苷酸(PS-ODN)和甲基磷酸酯寡聚核苷酸(MP-ODN)是两种研究最多，并已开始用于临床的ODN。成为治疗血液系统恶性肿瘤方面颇有应用前景的手段。现就c-myc反义核苷酸在血液系统恶性肿瘤方面的应用作一综述。
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1 c-myc原癌基因与急性白血病、恶性淋巴瘤等的关系
已知在造血系统恶性肿瘤中，c-myc常异常激活，75%Burkitt型淋巴瘤伴有t(8;14)(q24;q32)易位，使8号染色体上的bHLH/leucine锌指转录因子c-myc与14号染色体上的免疫球蛋白重链恒定区(C)融合，还可出现多种易位，如t(2;8)(p12;q24)和t(8;22)(q24;q11)，后二种Ig轻链基因易位到c-myc基因的下游。在这些易位中，c-myc基因编码区域读框未变，但由于c-myc基因与Ig基因并置，导致c-myc高表达。c-myc与bcl-2基因重排与非霍奇金淋巴瘤有关，多数患者并不出现二者合并，仅有少数出现在肿瘤进展期中，滤泡小裂细胞转变成小无裂细胞出现，后者恶性度明显高于前者[1]。MLVI-4位点重排位于20 kb c-myc的3'端，可在16%的多发性骨髓瘤中检出，同时发现在这个位点激活c-myc和另二个基因,而用限制性酶检测出发生在c-myc第1外显子的突变常发生在Burkitt淋巴瘤而未发现于多发性骨髓瘤[2]，c-myc基因的表达产物Myc蛋白与Myc有关蛋白抗原在急淋白血病中表达[3]，各种有关Myc蛋白在患者白血病细胞这些蛋白包括115,60和40 kD，可能与细胞活化的机理有关，也许这些蛋白质在细胞的增殖、转移中发挥作用。110和40 kD Myc相关蛋白在缓解期标和新鲜正常人外周血也可检测到。近2年来,有关c-myc基因,c-Myc蛋白与凋亡关系的研究十分热门，Hyunsuk发现了经c-myc诱导的葡萄糖相关的凋亡途径，这种凋亡被认为可被Bcl-2表达所阻断，而与野生型p53活性无关[4]。
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2 c-myc反义核苷酸在治疗血液系统恶性肿瘤的应用近况
c-myc基因作为与多种恶性肿瘤相关的基因而被广泛研究,也是较早进行反义核苷酸研究的靶基因之一。较早报道见于1989年Wickstrom等将c-myc反义DNA导入HL60细胞使其分化增加而HL60细胞克隆形成减少。同时发现c-myc反义核苷酸抑制c-myc表达，足以使粒系向终末期转化[5]。Holy等学者也有类似的报道[6]。HL60最早被认为是急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株[7]，但1991年Lanotte[8]建立了真正的FAB-M3型细胞株，即NB4细胞，现认为HL60无APL的典型染色体改变，为AML-M2型白血病细胞，但仍具有被多种诱导剂诱导分化的特性。HL60的c-myc表达增高，因而是用于c-myc反义核苷酸治疗急性白血病的良好的细胞模型。c-myc反义核苷酸还可用于恶性淋巴瘤的治疗，包括Burkitt淋巴瘤细胞株。其反义核苷酸的序列与应用于白血病治疗的稍有不同，用于ST486、JD38等细胞株，可抑制其生长、增殖及蛋白质的合成[9,10]。Mcmanawy等发现:用与Burkitt淋巴瘤株中c-myc第一内含子的21个碱基的(第二外显子AVG起始密码子上游10个碱基)互补的反义寡核苷酸片段。对成熟的c-myc mRNA中含有第一c-myc内含子残留序列的Burkitt淋巴瘤细胞株和表达正常c-myc mRNA的Burkitt淋巴瘤细胞株中的细胞增殖和c-myc蛋白表达的关系进行研究，结果发现c-myc基因断裂点发生在第一内含子的Burkitt淋巴瘤细胞株ST486，反义寡核苷酸与其成熟mRNA中含有的未被剪切掉的内含子残留序列结合形成双链。抑制了异常mRNA的翻译,使ST486，JD38细胞的生长抑率,抑制率分别为76%和111%。同样浓度的反义寡核苷酸对正常细胞和不含异常内含子序列的Burkitt淋巴瘤细胞KK124的增殖无抑制作用。
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在凋亡(apoptosis)机制对恶性肿瘤发生发展的影响得到医学研究者认可后，反义核苷酸能否引起肿瘤细胞的凋亡又是一个研究热点。Evans和Kimura等对c-myc反义核苷酸治疗白血病的凋亡机制也进行了研究[11,12],发现用反义核苷酸能持续抑制c-myc的表达,能诱导HL60细胞凋亡,而一旦撤去这种抑制,却能诱导更多的HL60细胞进入凋亡。国内1996年李尹雄合成c-myc反义RNA转染HL60细胞,使细胞生长特性有明显改变,蛋白质、DNA、RNA生物合成明显抑制[13]，冯永清等研究发现c-myc反义寡核苷酸对HL60细胞集落形成明显抑制[14]。Kanamaru应用反义核苷酸及与脂质体的复合物治疗人单核细胞白血病细胞U937,发现经Phosphorothioate修饰的反义核苷酸(S-Oligo)明显抑制U937的生长。而未经过Phosphorothioate的修饰(P-Oligo)和部分修饰的反义寡核苷酸均无此作用,同时证明,放射标记的S-Oligo比另二种反义核苷酸易于吸收,用共聚焦显微镜观察吸收后的核苷酸,分布在细胞的表面和胞浆，不在胞核。用阳离子脂质体混合后的P-Oligo和S-Oligo均主要在核内聚集。用脂质体结合反义核苷酸，使核苷酸的剂量大大减少[15]。这是在反义核苷酸的药代动力学方面研究的最新报道。
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由于反义核苷酸的应用,使癌基因与恶性肿瘤关系的研究更加深入。秦亚溱等[16]发现在慢性粒细胞性白血病(CML) c-Myc蛋白表达量若明显升高,则说明患者进入加速期或急变期，同时Bcl-2阳性率亦明显高于慢性，但另一Fas蛋白阳性率仍很低，与慢性期及正常骨髓相似，因而认为Bcl-2与c-Myc蛋白协同作用，不仅增殖活力提高，凋亡过程亦进一步受阻，发生恶变。c-Myc表达量反映细胞增殖状况，c-myc反义核苷酸能抑制细胞进入S期,而对G0期到G1期的进程无作用[17]。
3 反义核苷酸的临床应用前景
反义核苷酸诞生十余年来，已经取得了很大进展,在许多领域得到广泛应用，尤其是经过修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸(PS-ODN)，如作为抗病毒剂，已报道在体外细胞培养中用PS-ODN有效地抑制RSA、HIV、HBV等病毒的复制，如最有效的是直接靶向HBV Spl启动子的帽端转录部位，多聚腺苷化信号部位和基因S的起始区的PS-ODN。作为抗癌剂应用也取得极大的成功。c-myc癌基因也是其中一个重要的靶基因。为了使反义核苷酸的作用效果加强，Wickstrom等应用甲基磷酸抗c-myc DNA作用于转基因小鼠淋巴细胞的EU-c-myc，结果发现其c-myc抗原表达下调[18]，Williams等应用脂质体包裹c-myc硫代寡脱氧核苷酸应用于Burkitt淋巴瘤只需0.18 μmol PS-ODN就可使ST486细胞生长抑制50%，可使Daudi细胞生长抑制68%[19]，近年来对PS-ODN的研究进一步深入，尤其是在细胞内的代谢、毒性、稳定性等问题，有的研究者合成三链的PS-ODN作用于互补的RNA，形成稳定的RNA-DNA复合物，使之能持续稳定地发挥作用。末端修饰的寡核苷酸，如补骨脂素衍生物可增强寡核苷酸的作用，这种作用可能是由于嵌合剂增强了寡核苷酸-mRNA双螺旋的稳定性[20]。Krieg等报告，可以用5'-胆固醇基修饰PS-ODN，使反义寡核苷酸与细胞的联结增强及其效率增高[21]。Citro等[22]将互补c-myc的反义核苷酸用多聚赖氨酸连接叶酸形成叶酸-多聚赖氨酸-反义核苷酸复合物，与未修饰的反义核苷酸相比对肿瘤的抑制率明显提高。国内学者杨庆源等[23]合成了能针对c-myc基因第二外显子部分序列设计核酶能对靶基因mRNA切割。国内栾荣华[24]已有将针对大鼠c-myc癌基因mRNA的锤头状核酶切割c-myc癌基因mRNA的报道。核酶的特点具有高效性、特异性，但由于其制备复杂，目前仍处于实验阶段，也可能将来成为PS-ODN治疗血液等恶性肿瘤的必要补充。反义技术的应用可能是肿瘤治疗的一个新途径，同时也可以将反义技术与现在临床应用的卓有成效的化疗和免疫调节治疗相配伍，取长补短,达到对恶性肿瘤治疗的最佳效果。Kim[25]等研究发现，互补c-myc的反义核苷酸对鼠GOT细胞作用后c-myc mRNA和c-Myc蛋白均明显下降，而IL-2Rα表达未受影响，也未影响T细胞由G期的激活，此研究说明反义核苷酸对免疫系统的功能无影响。不仅如此，把二者结合可以发挥更有效的协同作用。又如Bcl-2反义核苷酸运用成功地减少了人类前B-细胞白血病细胞株和t(14:18)淋巴瘤的Bcl-2表达，恢复化疗药物诱导的白血病细胞凋亡[26]。与此相似，c-myc反义核苷酸与化疗药物配伍后也发现对肿瘤细胞抑制率增强。在反义核苷酸之间相互配伍，也具有良好的治疗潜能。如Skorski等[27]体外培养细胞单用或同时使用BCR/ABL或/和c-myc硫代磷酸反义核苷酸处理CML急变的原始细胞，结果显示同时使用BCR/ABL和c-myc反义核苷酸引起的基因表达下调，抗CML细胞增殖作用明显强于各自单独应用。同时，对正常骨髓克隆的形成无影响。动物实验证实,将BCR/ABL反义核苷酸或c-myc反义核苷酸或两种反义核苷酸处理过的CML原始细胞注入SCID小鼠，经流式细胞仪、RT-PCR技术等检测鼠组织细胞悬液的白血病细胞，发现两种反义核苷酸同时处理的小鼠疾病进程延缓，生存期长，提示针对多个有协同作用的癌基因的多种反义核苷酸同时应用可具有互相加强各个效应的作用。Richard[28]等人利用Merpholino修饰的反义核苷酸作用于人慢粒细胞株KYO1细胞，发现对c-Myc蛋白无明显作用，但经RT-PCR及测序分析，对mRNA的作用有如下方面:抑制c-myc前mRNA的连接；导致c-myc前mRNA的错配；抑制已连接的正常c-myc mRNA的转录。目前对反义核苷酸的作用机制有了更进一步的认识。
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总之，反义核苷酸(包括c-myc反义核苷酸)治疗血液系统恶性肿瘤的研究是一个有广阔前景的方向，随着基础研究的不断深入，反义核苷酸能为治愈血液系恶性肿瘤发挥重要作用。
(吕联煌 审校)
作者简介:刘庭波，女，1968年5月生，主治医师,医学博士.
参考文献:
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收稿日期:1999-10-12, http://www.100md.com
单位：刘庭波(福建医科大学 附属协和医院，福建省血液病研究所,福州 350001)
关键词：核苷酸类；原癌基因；蛋白质c-myc类；血液肿瘤,治疗；基因，myc
福建医科大学学报000139
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2 c-myc反义核苷酸在治疗血液系统恶性肿瘤的应用近况
c-myc基因作为与多种恶性肿瘤相关的基因而被广泛研究,也是较早进行反义核苷酸研究的靶基因之一。较早报道见于1989年Wickstrom等将c-myc反义DNA导入HL60细胞使其分化增加而HL60细胞克隆形成减少。同时发现c-myc反义核苷酸抑制c-myc表达，足以使粒系向终末期转化[5]。Holy等学者也有类似的报道[6]。HL60最早被认为是急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株[7]，但1991年Lanotte[8]建立了真正的FAB-M3型细胞株，即NB4细胞，现认为HL60无APL的典型染色体改变，为AML-M2型白血病细胞，但仍具有被多种诱导剂诱导分化的特性。HL60的c-myc表达增高，因而是用于c-myc反义核苷酸治疗急性白血病的良好的细胞模型。c-myc反义核苷酸还可用于恶性淋巴瘤的治疗，包括Burkitt淋巴瘤细胞株。其反义核苷酸的序列与应用于白血病治疗的稍有不同，用于ST486、JD38等细胞株，可抑制其生长、增殖及蛋白质的合成[9,10]。Mcmanawy等发现:用与Burkitt淋巴瘤株中c-myc第一内含子的21个碱基的(第二外显子AVG起始密码子上游10个碱基)互补的反义寡核苷酸片段。对成熟的c-myc mRNA中含有第一c-myc内含子残留序列的Burkitt淋巴瘤细胞株和表达正常c-myc mRNA的Burkitt淋巴瘤细胞株中的细胞增殖和c-myc蛋白表达的关系进行研究，结果发现c-myc基因断裂点发生在第一内含子的Burkitt淋巴瘤细胞株ST486，反义寡核苷酸与其成熟mRNA中含有的未被剪切掉的内含子残留序列结合形成双链。抑制了异常mRNA的翻译,使ST486，JD38细胞的生长抑率,抑制率分别为76%和111%。同样浓度的反义寡核苷酸对正常细胞和不含异常内含子序列的Burkitt淋巴瘤细胞KK124的增殖无抑制作用。
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在凋亡(apoptosis)机制对恶性肿瘤发生发展的影响得到医学研究者认可后，反义核苷酸能否引起肿瘤细胞的凋亡又是一个研究热点。Evans和Kimura等对c-myc反义核苷酸治疗白血病的凋亡机制也进行了研究[11,12],发现用反义核苷酸能持续抑制c-myc的表达,能诱导HL60细胞凋亡,而一旦撤去这种抑制,却能诱导更多的HL60细胞进入凋亡。国内1996年李尹雄合成c-myc反义RNA转染HL60细胞,使细胞生长特性有明显改变,蛋白质、DNA、RNA生物合成明显抑制[13]，冯永清等研究发现c-myc反义寡核苷酸对HL60细胞集落形成明显抑制[14]。Kanamaru应用反义核苷酸及与脂质体的复合物治疗人单核细胞白血病细胞U937,发现经Phosphorothioate修饰的反义核苷酸(S-Oligo)明显抑制U937的生长。而未经过Phosphorothioate的修饰(P-Oligo)和部分修饰的反义寡核苷酸均无此作用,同时证明,放射标记的S-Oligo比另二种反义核苷酸易于吸收,用共聚焦显微镜观察吸收后的核苷酸,分布在细胞的表面和胞浆，不在胞核。用阳离子脂质体混合后的P-Oligo和S-Oligo均主要在核内聚集。用脂质体结合反义核苷酸，使核苷酸的剂量大大减少[15]。这是在反义核苷酸的药代动力学方面研究的最新报道。
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由于反义核苷酸的应用,使癌基因与恶性肿瘤关系的研究更加深入。秦亚溱等[16]发现在慢性粒细胞性白血病(CML) c-Myc蛋白表达量若明显升高,则说明患者进入加速期或急变期，同时Bcl-2阳性率亦明显高于慢性，但另一Fas蛋白阳性率仍很低，与慢性期及正常骨髓相似，因而认为Bcl-2与c-Myc蛋白协同作用，不仅增殖活力提高，凋亡过程亦进一步受阻，发生恶变。c-Myc表达量反映细胞增殖状况，c-myc反义核苷酸能抑制细胞进入S期,而对G0期到G1期的进程无作用[17]。
3 反义核苷酸的临床应用前景
反义核苷酸诞生十余年来，已经取得了很大进展,在许多领域得到广泛应用，尤其是经过修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸(PS-ODN)，如作为抗病毒剂，已报道在体外细胞培养中用PS-ODN有效地抑制RSA、HIV、HBV等病毒的复制，如最有效的是直接靶向HBV Spl启动子的帽端转录部位，多聚腺苷化信号部位和基因S的起始区的PS-ODN。作为抗癌剂应用也取得极大的成功。c-myc癌基因也是其中一个重要的靶基因。为了使反义核苷酸的作用效果加强，Wickstrom等应用甲基磷酸抗c-myc DNA作用于转基因小鼠淋巴细胞的EU-c-myc，结果发现其c-myc抗原表达下调[18]，Williams等应用脂质体包裹c-myc硫代寡脱氧核苷酸应用于Burkitt淋巴瘤只需0.18 μmol PS-ODN就可使ST486细胞生长抑制50%，可使Daudi细胞生长抑制68%[19]，近年来对PS-ODN的研究进一步深入，尤其是在细胞内的代谢、毒性、稳定性等问题，有的研究者合成三链的PS-ODN作用于互补的RNA，形成稳定的RNA-DNA复合物，使之能持续稳定地发挥作用。末端修饰的寡核苷酸，如补骨脂素衍生物可增强寡核苷酸的作用，这种作用可能是由于嵌合剂增强了寡核苷酸-mRNA双螺旋的稳定性[20]。Krieg等报告，可以用5'-胆固醇基修饰PS-ODN，使反义寡核苷酸与细胞的联结增强及其效率增高[21]。Citro等[22]将互补c-myc的反义核苷酸用多聚赖氨酸连接叶酸形成叶酸-多聚赖氨酸-反义核苷酸复合物，与未修饰的反义核苷酸相比对肿瘤的抑制率明显提高。国内学者杨庆源等[23]合成了能针对c-myc基因第二外显子部分序列设计核酶能对靶基因mRNA切割。国内栾荣华[24]已有将针对大鼠c-myc癌基因mRNA的锤头状核酶切割c-myc癌基因mRNA的报道。核酶的特点具有高效性、特异性，但由于其制备复杂，目前仍处于实验阶段，也可能将来成为PS-ODN治疗血液等恶性肿瘤的必要补充。反义技术的应用可能是肿瘤治疗的一个新途径，同时也可以将反义技术与现在临床应用的卓有成效的化疗和免疫调节治疗相配伍，取长补短,达到对恶性肿瘤治疗的最佳效果。Kim[25]等研究发现，互补c-myc的反义核苷酸对鼠GOT细胞作用后c-myc mRNA和c-Myc蛋白均明显下降，而IL-2Rα表达未受影响，也未影响T细胞由G期的激活，此研究说明反义核苷酸对免疫系统的功能无影响。不仅如此，把二者结合可以发挥更有效的协同作用。又如Bcl-2反义核苷酸运用成功地减少了人类前B-细胞白血病细胞株和t(14:18)淋巴瘤的Bcl-2表达，恢复化疗药物诱导的白血病细胞凋亡[26]。与此相似，c-myc反义核苷酸与化疗药物配伍后也发现对肿瘤细胞抑制率增强。在反义核苷酸之间相互配伍，也具有良好的治疗潜能。如Skorski等[27]体外培养细胞单用或同时使用BCR/ABL或/和c-myc硫代磷酸反义核苷酸处理CML急变的原始细胞，结果显示同时使用BCR/ABL和c-myc反义核苷酸引起的基因表达下调，抗CML细胞增殖作用明显强于各自单独应用。同时，对正常骨髓克隆的形成无影响。动物实验证实,将BCR/ABL反义核苷酸或c-myc反义核苷酸或两种反义核苷酸处理过的CML原始细胞注入SCID小鼠，经流式细胞仪、RT-PCR技术等检测鼠组织细胞悬液的白血病细胞，发现两种反义核苷酸同时处理的小鼠疾病进程延缓，生存期长，提示针对多个有协同作用的癌基因的多种反义核苷酸同时应用可具有互相加强各个效应的作用。Richard[28]等人利用Merpholino修饰的反义核苷酸作用于人慢粒细胞株KYO1细胞，发现对c-Myc蛋白无明显作用，但经RT-PCR及测序分析，对mRNA的作用有如下方面:抑制c-myc前mRNA的连接；导致c-myc前mRNA的错配；抑制已连接的正常c-myc mRNA的转录。目前对反义核苷酸的作用机制有了更进一步的认识。
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总之，反义核苷酸(包括c-myc反义核苷酸)治疗血液系统恶性肿瘤的研究是一个有广阔前景的方向，随着基础研究的不断深入，反义核苷酸能为治愈血液系恶性肿瘤发挥重要作用。
(吕联煌 审校)
作者简介:刘庭波，女，1968年5月生，主治医师,医学博士.
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收稿日期:1999-10-12, http://www.100md.com