神经生长因子及抑制因子对鸡胚背根神经节轴突生长的影响
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南京医科大学学报 2000年第2期第20卷 论著
作者：都爱莲 丁新生 沈霞 邓晓萱 程虹 姚娟
单位：都爱莲 丁新生 邓晓萱 程虹 姚娟(南京医科大学第一附属医院神经内科，南京 210029)；沈霞(徐州医学院附属医院，徐州 221002)
关键词：背根神经节；细胞；培养的；神经生长因子；神经生长抑制因子
南京医科大学学报000201
摘 要 目的 研究神经生长因子(NGF)和神经生长抑制因子(NGI)对鸡胚背根神经节(DRG)轴突生长的影响。方法 分离培养鸡胚DRG，加入NGF、NGI并观察它们对轴突生长的影响。结果 DRG轴突在含NGF的培养液中迅速生长，加入NGI后这种生长被抑制。结论 NGF可促进DRG轴突的生长，而NGI抑制它的生长。
中图号 R741.02
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The Effect of Neuron Growth Factors and Neuron Growth Inhibitors on the Growth of Chick Embryonic Dorsal Root Ganglion Axon
Du Ailian Ding Xinsheng Shen Xia
(Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To evaluate the effect of neuron growth factors (NGF) and neuron growth inhibitors (NGI) on the growth of chick embryonic dorsal root ganglion (DRG) axon. Methods Chick embryonic DRG was departed and cultured. NGF and NGI were added in the culture respectively and their effect was noted. Results The axon of DRG grew rapidly in culture of NGF-supplementing and their growth was inhibited when NGI was added. Conclusion NGF may activate the growth of DRG axon while NGI may inhibit it.
, 百拇医药
Key words dorsal root ganglion; tumor cells, cultured; neuron growth factors; neuron growth inhibitors
在神经系统发育过程中，神经纤维的正常投射受到其生长环境中起营养作用的信号因子如神经生长因子(neuron growth factors, NGF)和抑制性信号因子如神经生长抑制因子(neuron growth inhibitors, NGI)的共同调控[1]。长期以来，国内外学者对神经营养因子做了大量的研究，建立了较为成熟的细胞模型。NGI自问世以来，一直是国外研究的热点，国内尚缺乏有关的报道。我们在美国同道的协助下，建立了E7鸡胚背根神经节(DRG)的体外培养方法。验证了NGF的神经营养作用，成功地检测了成年鸡脑源性的NGI——Collapsin-1对轴突生长冠的抑制活性。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 鸡胚DRG的取材和分离
无菌条件下取E7鸡胚，置于盛有Hank液的平皿中，解剖显微镜下，用显微剪沿腹中线剖开，清除体腔内脏器，完全暴露脊柱和沿脊柱两侧排列的DRG。在DRG的上方切开脊柱，将脊髓尾侧端向头侧端掀起，清除脊髓组织。用镊子夹DRG外周侧神经纤维根部摘取DRG，立即置于4℃ DMEM/F-12培养液中(培养液中加有NaHCO3和青、链霉素)。用显微尖镊子仔细剥去DRG外膜和背根神经残根。将DRG剪成1/2或1/4的小块。加入胰蛋白酶使终浓度为0.125%，4℃下消化30 min，10%马血清终止消化。
1.2 神经节细胞的培养
预先将硝酸清洗过、UV射线灭菌处理过的[2]盖片浸入40 μg/ml的Laminin溶液中，37℃下Hank液中温育30 min[3]。将剪下的DRG小块置于包被好的盖片上。连同盖片一起放入含有F-12标准培养液的12孔无菌培养板中，每孔放一块神经节。其中两个孔不加NGF作为对照，其余各孔均加入20 ng/ml 7S NGF。置37℃、5% CO2培养箱中培养16～24 h。
, 百拇医药
F-12标准培养液中含有200 μg/ml牛垂体提取物(F-12中透析过夜)、14 mmol/L NaHCO3、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的链霉素、6 g/L的葡萄糖、5 μg/ml胰岛素、5 μg/ml转铁蛋白、5 ng/ml硒酸、100 μmol/L腐胺、20 nmol/L孕酮。
1.3 观察前处理
在将培养物转移到显微镜上之前，用含有14 mmol/L NaCl和20 mmol/L Hepes (pH 7.4)的CO2非依赖性培养液替换原来的NaHCO3培养液。取用F-12平衡过的矿物油(Sigma)0.5～1.0 ml浮在培养液上面以防观察过程中培养液的蒸发。将培养板置于37℃微育器中(O-PMI-2)，倒置显微镜下观察。
2 结果
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2.1 生长冠形态和活动的观察
相差显微镜下，感觉神经元呈球形、椭圆形或不规则形，立体感和折光性好。在加有NGF的孔中，神经元有长的轴突和短的树突向四周生长。轴突生长的尖端——生长冠上有伸展的板状伪足和10余个丝状伪足。连续观察7 min，可观察到丝状伪足伸展、收缩，然后伸长，在培养液中自由地摆动。板状伪足的形状也随时间的变化而变化。在生长冠以50～70 μm/h速度的生长过程中，板状伪足有的伸展，有的回缩。在不加NGF的对照孔中，神经元形态较小，突起较少，短时间内看不到明显的生长现象。
2.2 Collapsin-1抑制活性的观察
加入Collapsin-1的1 min内，就可看到板状伪足伸展停止，生长冠的生长也随之停止，丝状伪足也停止摆动。继之，丝状伪足和板状伪足开始回缩。在以后的10～70 min内，丝状伪足不断地变短、减少，板状伪足也缩回形成浓缩的残球。
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3 讨论
周围神经节的体外培养具有胞体大、成分单一、可保持结构和功能上的某些特征等特点。我们在培养液中加入了葡萄糖、氨基酸、NGF、胰岛素、孕酮等神经元生长必需的营养成分，模拟了神经元在体内的生长环境并加速了神经元的生长分化。有研究表明，Laminin有促进胚胎期神经细胞分化成熟的功能，表现为使神经细胞的突起增加。我们用Laminin作为递质，一方面起到粘连和支持作用，另一方面能促进生长冠的长出，利于迅速地获得目的细胞。相差显微镜的应用，使我们能够连续动态观察生长冠的活动情况，为研究神经生长以及NGF和NGI的作用提供了良好的体外试验模型。
我们的检测结果表明：NGF是DRG神经细胞生长的必需因子。而NGF的促生长活性可以被成年鸡脑源性的神经抑制因子Collapsin-1阻断。这与Raper等[4]和Fan等[3]的观察结果相一致，证实了中枢神经系统中抑制因子的存在。近几年国外研究发现抑制因子为一大家族结构和功能相近的蛋白质，命名为Semaphorins/Coll apsins家族[5]。动物实验证明，这个家族的部分成员在胚胎发育期对神经轴突的生长和正常投射具有明显的诱向作用[6]。这个家族的SemaⅢ/Collapsin-1(现在统一命名为Sema 3A[7])对成年期的外周神经元也有抑制作用[8]。
, 百拇医药
总之，神经抑制因子的发现打破了神经元损伤后不能再生的旧观念，为解决中枢和周围神经元的再生问题开辟了新的思路，具有广阔的研究前景。我们的研究为进一步研究神经生长发育和神经损伤的再生、修复提供了可靠的方法。
本实验得到美国罗宇龄博士(宾夕法尼亚大学)和何志刚博士(UCSF)的支持，特此感谢。
国家自然科学基金(No 39840011)和江苏省自然科学基金(No BK97057)资助项目
参考文献
1，Tessier LM, Goodman CS. The molecular biology of axon guidance. Science, 1996,274:1123
2，Chang S, Rathjen FG, Raper JA. Extension of neurites on axons is impaired by antibodies against specific neural cell surface glycoprotein. J Cell Biol, 1987,104:355
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3，Fan JH, Mansfield SG, Redmond T, et al. The organization of F-action and microtubules in growth cones exposed to a brain-derived collapsing factor. J Cell Biol, 1993,121:867
4，Raper JA, Kapfhammer JP. The enrichment of a neuronal growth cone collapsing activity from embryonic chick brain. Neuron, 1990,4:21
5，Keynes R, Cook GMW. Axon guidance molecules. Cell, 1995,83:161
6，Messersmith EF, Leonardo ED, Shats CJ, et al. Semaphorin Ⅲ can function as a selective chemorepellent to pattern sensory projections in the spinal cord. Neuron, 1995,14:949
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7，Semaphorin Nomenclature Committee. Unified nomenclature for the Semaphorins/Collapsins. Cell, 1999,97:551
8，Pasterkamp RJ, De WF, Holtmoat AJ, et al. Evidence for a role of the chemorepellent semaphorin Ⅲ and its receptor neuropilin-1 in the regeneration of primary olfactor axons. J Neurosci, 1998,18:9962
(1999-07-09收稿), 百拇医药
单位：都爱莲 丁新生 邓晓萱 程虹 姚娟(南京医科大学第一附属医院神经内科，南京 210029)；沈霞(徐州医学院附属医院，徐州 221002)
关键词：背根神经节；细胞；培养的；神经生长因子；神经生长抑制因子
南京医科大学学报000201
摘 要 目的 研究神经生长因子(NGF)和神经生长抑制因子(NGI)对鸡胚背根神经节(DRG)轴突生长的影响。方法 分离培养鸡胚DRG，加入NGF、NGI并观察它们对轴突生长的影响。结果 DRG轴突在含NGF的培养液中迅速生长，加入NGI后这种生长被抑制。结论 NGF可促进DRG轴突的生长，而NGI抑制它的生长。
中图号 R741.02
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The Effect of Neuron Growth Factors and Neuron Growth Inhibitors on the Growth of Chick Embryonic Dorsal Root Ganglion Axon
Du Ailian Ding Xinsheng Shen Xia
(Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To evaluate the effect of neuron growth factors (NGF) and neuron growth inhibitors (NGI) on the growth of chick embryonic dorsal root ganglion (DRG) axon. Methods Chick embryonic DRG was departed and cultured. NGF and NGI were added in the culture respectively and their effect was noted. Results The axon of DRG grew rapidly in culture of NGF-supplementing and their growth was inhibited when NGI was added. Conclusion NGF may activate the growth of DRG axon while NGI may inhibit it.
, 百拇医药
Key words dorsal root ganglion; tumor cells, cultured; neuron growth factors; neuron growth inhibitors
在神经系统发育过程中，神经纤维的正常投射受到其生长环境中起营养作用的信号因子如神经生长因子(neuron growth factors, NGF)和抑制性信号因子如神经生长抑制因子(neuron growth inhibitors, NGI)的共同调控[1]。长期以来，国内外学者对神经营养因子做了大量的研究，建立了较为成熟的细胞模型。NGI自问世以来，一直是国外研究的热点，国内尚缺乏有关的报道。我们在美国同道的协助下，建立了E7鸡胚背根神经节(DRG)的体外培养方法。验证了NGF的神经营养作用，成功地检测了成年鸡脑源性的NGI——Collapsin-1对轴突生长冠的抑制活性。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 鸡胚DRG的取材和分离
无菌条件下取E7鸡胚，置于盛有Hank液的平皿中，解剖显微镜下，用显微剪沿腹中线剖开，清除体腔内脏器，完全暴露脊柱和沿脊柱两侧排列的DRG。在DRG的上方切开脊柱，将脊髓尾侧端向头侧端掀起，清除脊髓组织。用镊子夹DRG外周侧神经纤维根部摘取DRG，立即置于4℃ DMEM/F-12培养液中(培养液中加有NaHCO3和青、链霉素)。用显微尖镊子仔细剥去DRG外膜和背根神经残根。将DRG剪成1/2或1/4的小块。加入胰蛋白酶使终浓度为0.125%，4℃下消化30 min，10%马血清终止消化。
1.2 神经节细胞的培养
预先将硝酸清洗过、UV射线灭菌处理过的[2]盖片浸入40 μg/ml的Laminin溶液中，37℃下Hank液中温育30 min[3]。将剪下的DRG小块置于包被好的盖片上。连同盖片一起放入含有F-12标准培养液的12孔无菌培养板中，每孔放一块神经节。其中两个孔不加NGF作为对照，其余各孔均加入20 ng/ml 7S NGF。置37℃、5% CO2培养箱中培养16～24 h。
, 百拇医药
F-12标准培养液中含有200 μg/ml牛垂体提取物(F-12中透析过夜)、14 mmol/L NaHCO3、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的链霉素、6 g/L的葡萄糖、5 μg/ml胰岛素、5 μg/ml转铁蛋白、5 ng/ml硒酸、100 μmol/L腐胺、20 nmol/L孕酮。
1.3 观察前处理
在将培养物转移到显微镜上之前，用含有14 mmol/L NaCl和20 mmol/L Hepes (pH 7.4)的CO2非依赖性培养液替换原来的NaHCO3培养液。取用F-12平衡过的矿物油(Sigma)0.5～1.0 ml浮在培养液上面以防观察过程中培养液的蒸发。将培养板置于37℃微育器中(O-PMI-2)，倒置显微镜下观察。
2 结果
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2.1 生长冠形态和活动的观察
相差显微镜下，感觉神经元呈球形、椭圆形或不规则形，立体感和折光性好。在加有NGF的孔中，神经元有长的轴突和短的树突向四周生长。轴突生长的尖端——生长冠上有伸展的板状伪足和10余个丝状伪足。连续观察7 min，可观察到丝状伪足伸展、收缩，然后伸长，在培养液中自由地摆动。板状伪足的形状也随时间的变化而变化。在生长冠以50～70 μm/h速度的生长过程中，板状伪足有的伸展，有的回缩。在不加NGF的对照孔中，神经元形态较小，突起较少，短时间内看不到明显的生长现象。
2.2 Collapsin-1抑制活性的观察
加入Collapsin-1的1 min内，就可看到板状伪足伸展停止，生长冠的生长也随之停止，丝状伪足也停止摆动。继之，丝状伪足和板状伪足开始回缩。在以后的10～70 min内，丝状伪足不断地变短、减少，板状伪足也缩回形成浓缩的残球。
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周围神经节的体外培养具有胞体大、成分单一、可保持结构和功能上的某些特征等特点。我们在培养液中加入了葡萄糖、氨基酸、NGF、胰岛素、孕酮等神经元生长必需的营养成分，模拟了神经元在体内的生长环境并加速了神经元的生长分化。有研究表明，Laminin有促进胚胎期神经细胞分化成熟的功能，表现为使神经细胞的突起增加。我们用Laminin作为递质，一方面起到粘连和支持作用，另一方面能促进生长冠的长出，利于迅速地获得目的细胞。相差显微镜的应用，使我们能够连续动态观察生长冠的活动情况，为研究神经生长以及NGF和NGI的作用提供了良好的体外试验模型。
我们的检测结果表明：NGF是DRG神经细胞生长的必需因子。而NGF的促生长活性可以被成年鸡脑源性的神经抑制因子Collapsin-1阻断。这与Raper等[4]和Fan等[3]的观察结果相一致，证实了中枢神经系统中抑制因子的存在。近几年国外研究发现抑制因子为一大家族结构和功能相近的蛋白质，命名为Semaphorins/Coll apsins家族[5]。动物实验证明，这个家族的部分成员在胚胎发育期对神经轴突的生长和正常投射具有明显的诱向作用[6]。这个家族的SemaⅢ/Collapsin-1(现在统一命名为Sema 3A[7])对成年期的外周神经元也有抑制作用[8]。
, 百拇医药
总之，神经抑制因子的发现打破了神经元损伤后不能再生的旧观念，为解决中枢和周围神经元的再生问题开辟了新的思路，具有广阔的研究前景。我们的研究为进一步研究神经生长发育和神经损伤的再生、修复提供了可靠的方法。
本实验得到美国罗宇龄博士(宾夕法尼亚大学)和何志刚博士(UCSF)的支持，特此感谢。
国家自然科学基金(No 39840011)和江苏省自然科学基金(No BK97057)资助项目
参考文献
1，Tessier LM, Goodman CS. The molecular biology of axon guidance. Science, 1996,274:1123
2，Chang S, Rathjen FG, Raper JA. Extension of neurites on axons is impaired by antibodies against specific neural cell surface glycoprotein. J Cell Biol, 1987,104:355
, http://www.100md.com
3，Fan JH, Mansfield SG, Redmond T, et al. The organization of F-action and microtubules in growth cones exposed to a brain-derived collapsing factor. J Cell Biol, 1993,121:867
4，Raper JA, Kapfhammer JP. The enrichment of a neuronal growth cone collapsing activity from embryonic chick brain. Neuron, 1990,4:21
5，Keynes R, Cook GMW. Axon guidance molecules. Cell, 1995,83:161
6，Messersmith EF, Leonardo ED, Shats CJ, et al. Semaphorin Ⅲ can function as a selective chemorepellent to pattern sensory projections in the spinal cord. Neuron, 1995,14:949
, http://www.100md.com
7，Semaphorin Nomenclature Committee. Unified nomenclature for the Semaphorins/Collapsins. Cell, 1999,97:551
8，Pasterkamp RJ, De WF, Holtmoat AJ, et al. Evidence for a role of the chemorepellent semaphorin Ⅲ and its receptor neuropilin-1 in the regeneration of primary olfactor axons. J Neurosci, 1998,18:9962
(1999-07-09收稿), 百拇医药