牛泡沫病毒(BSV)对牛免疫缺陷病毒(BIV)的激活作用
作者：刘佳建 刘淑红 陈启民 耿运琪
单位：南开大学生命科学学院，天津 300071
关键词：牛泡沫病毒(BSV)；牛泡沫病毒反式激活因子(Borf-1)；牛免疫缺陷病毒(BIV)
中国病毒学/990310摘 要 用瞬时表达分析等方法，证明牛泡沫病毒(BSV)3026中国毒株能在体外激活牛免疫缺陷病毒(BIV)基因表达，BSV3026编码的反式激活因子Borf-1行使这种激活作用。缺失突变分析表明，Borf-1在BIV LTR上靶序列位于-410/-115(+1为转录起始位点)区域，但其中的NF-κB位点(-367/-319)与这种激活作用无关，包括转录起点下游(RU5区)在内的-115/+204区域也与这种激活作用无关。该结果对研究BIV致病机理及防治AIDS有重要意义。
Activation of Bovine Immunodeficiency Virus (BIV)
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Gene Expression by Bovine Spumavirus (BSV)
Liu Jiajian Liu Shuhong Chen Qimin Geng Yunqi
(College of Life Science, Nankai University, Tianjin 300071)
Abstract Bovine spumavirus (BSV) 3026 China strain, which was isolated by authors, encodes the transcriptional transactivator Borf-1. The Borf-1 protein, as well as the BSV3026, can transactivate the gene expression directed by bovine immunodeficiency virus long terminal repeat (BIV LTR) in transient transfection assays. To identify the specific region in BIV LTR responsible for the Borf-1 action, it was examined that the effect of the Borf-1 on firefly luciferase (Luc) gene expression in transfected cells with a series of mutant pBIV LTR-luc plasmids. The region between -410 and -115 from the transcription initiation site was identified as responsible for the transactivation by the Borf-1. However, the regions between -367 and -319 (NF-κB site), between -52 and +204, which are very important in the activation of BIV transcription, are dispensable for the Borf-1-mediated transactivation.
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Key words Bovine spumavirus (BSV), Transcriptional transactivator of the BSV (Borf-1), Bovine immunodeficiency virus (BIV)
牛免疫缺陷病毒(bovine immunodeficiency virus, BIV)是反转录病毒科慢病毒属成员之一，与HIV在病毒形态、感染周期、基因组结构、表达调控等方面十分相似，能引起牛淋巴细胞增多症、中枢神经系统损伤及进行性消瘦等多种类艾滋(AIDS)症状[1]。流行病学调查表明BIV分布范围广，普遍存在与其它病毒，如牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛泡沫病毒(bovine spumavirus, BSV)等的交叉感染，且交叉感染率高。这种交叉感染常常是导致BIV阳性牛类AIDS症状并导致死亡的原因[1，2]。BHV、BVDV对BIV激活作用的研究结果均证明了这一点[3～5]。因此，探索病毒的交叉感染对BIV的影响，对研究BIV的病理及防治AIDS具有重要意义。
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BSV与BIV同属反转录病毒科，与BIV具有相似的基因组结构，但属泡沫病毒属。流行病学调查表明BSV与BIV有较高的交叉感染率，事实上BSV3026中国病毒株就是从BIV感染的牛体内分离到的[2，6]。本研究在对BSV3026分子生物学研究取得了初步结果的基础上(另文发表)，进一步研究证明BSV在细胞水平能激活BIV，这种激活作用是由BSV编码的反式激活因子(Borf-1)所致。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 用含10%胎牛血清(天津生化制品厂生产)的DMEM，37 ℃ 5% CO2条件下培养本室分离的胎牛肺(FBL)细胞，用于繁殖病毒和转染。DMEM购自GIBCO/RBL。
1.2 质粒构建 BSV3026感染的FBL细胞中提取的Hirt DNA为模板，用PCR方法克隆BSV反式激活因子(Borf-1)基因，将该基因克隆到本室保藏的pRSVcat质粒的RSVLTR之后替换cat基因构建Borf-1表达质粒pBSVORF-1。该质粒表达249 aa Borf-1蛋白。BIV LTR各缺失质粒(参见图1)及BIV反式激活因子Tat表达质粒pBIVTat等为本室保藏[4，8，9]。
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1.3 质粒转染与荧光素酶活力测定 病毒BSV3026感染质粒转染FBL细胞时，先用质粒转染FBL细胞24 h后加入培养好的病毒，其转染步骤参见GIBCO/BRL公司产品说明书。荧光素酶(Luc)活力测定参见Promega公司产品说明书。
1.4 β gal内对照系统 所有转染均设β gal内对照系统。pCMV β gal质粒为本室保藏。ONPG、β-galactosidase购自Sigma公司。
2 结果
2.1 BSV3026对BIV LTR-Luc整体水平上的激活作用
为了证明BSV3026是否能激活BIV基因表达，本研究首先用pBIV LTR-Luc质粒与pUC18(对照)或pBIV Tat共转染FBL细胞；用病毒(感染FBL细胞的BSV3026，即FBL/BSV3026)分别感染pBIV LTR-Luc质粒单独转染和pBIV LTR-Luc与pBIV Tat共转染的FBL细胞；其中病毒感染质粒转染FBL细胞时，在质粒转染24 h时后按FBL/BSV3026与FBL细胞(铺板时的计数)为1∶8的比例加入病毒，瞬时表达分析如表1所示。结果表明BIV LTR能被自身的反式激活因子Tat激活(25倍)，同时还能被BSV3026单独(11倍)或协同激活(pBIV Tat+FBL/BSV3026, 37倍)。这说明BSV3026能在整体水平上激活BIVLTR起始Luc基因表达，并能协同BIV Tat激活BIV LTR。
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表1 BSV3026对BIVLTR的激活作用
Table 1 Activation of the BIV LTR by BSV3026 共转染(或感染)
Cotransfecting plasmid
Luc值a
Luc activity of pBIVLTR-Luca
激活倍数
Fold increase
pUC18
530±28
, http://www.100md.com pBIV Tat
13420±807
25
FBL/BSV3026
5970±115
11
pBIV Tat+FBL/BSV3026
19550±1016
37
a 每孔转染用1.0 μg pBIVLTR-Luc, 1 μg pUC18(或pBIV Tat), 0.6 μg pCMV β gal 与3 μg Lipofect AMINE (GIBCO/RBL)混合。每样品设三孔平行对照。转染48 h后裂解细胞测荧光素酶(Luc)值。Luc值经β-gal内对照校正后，平行组之间变异系数<10%。
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a Each experiment was done at least 3 times in triplicate and each plate was transfected with 1 μg of pBIVLTR-Luc, 1 μg of pUC18 or pBIV Tat, 0.6 μg pCMV β gal and 3 μg Lipofect AMINE (GIBCO/BRL). The cells were harvested to determine Luc activity at 48 h after transfection. Luciferase activities were normalize for the amount of β-galactosidase. Generally, less than 10% variation in replicate samples was observed.
2.2 BSV3026的反式激活因子Borf-1对BIVLTR的激活作用
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为了探寻BSV3026对BIVLTR整体水平的激活作用是否与BSV的反式激活因子Borf-1有关，我们构建了Borf-1的表达质粒pBSVORF-1，将它与pBIV LTR-Luc系列缺失质粒[4，8，9]共转染FBL细胞，瞬时表达结果见图1。可以看出BSV的反式激活因子Borf-1能激活BIVLTR起始Luc基因表达，激活倍数为11.3；当BIVLTR从5′端缺失到-115时，激活倍数依次下降至8.9、7.4、5.2直到0.9(即缺失到-115失去激活作用)；继续从5′端缺失至-52(-52/+204)同样不能被Borf-1激活(激活倍数为1.1)；当3′端缺失+32/+204及-2/+204(整个RU5区)，即质粒-410/+32和-410/-2，能被Borf-1激活(激活倍数分别为8.7和9.5)。这些结果表明Borf-1在BIVLTR上的靶序列位于-410/-115区域，-115/+204(包括整个RU5区)与激活作用无关。
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图1 BSV Borf-1对BIVLTR的激活作用。LTR结构及质粒构建参见文献4，8，9。+和-表示有或无pBSVORF-1共转染。注a同表1。
Fig.1 Activation of the BIV LTR by the Borf-1 of the BSV. The diagram (upper) shows some regulatory elements in the BIV LTR, Luc: Firefly luciferase gene. Lines (lower) represent the BIV LTR regions remaining after deletion[4，8，9].+and-, presence or absence of Borf-1. a as in the legend of table 1.
研究表明NF-κB位点(-367/-319)在BIV Tat反式激活功能中起重要作用[8，9]，为了研究该位点是否参与Borf-1对BIV LTR的反式激活作用，将缺失该位点的质粒Δ-367/-319(NF-κB)与Borf-1表达质粒共转染，结果发现其激活倍数(图1中的10.4)比保留该位点时的激活倍数(11.3)几乎没有变化。这说明Borf-1对BIV LTR的反式激活作用与NF-κB位点无关。
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2.3 Borf-1与Tat协同激活BIV LTR起始基因表达
为了研究Borf-1对BIV LTR的激活是否与BIV自身的反式激活因子Tat具有协同作用，将质粒pBIV LTR(-410/+204)-Luc、pBIV LTR(-115/+204)-Luc分别与BIV Tat，BSV Borf-1表达质粒共转染，结果见表2。从表2可以看出Borf-1单独能激活-410/+204起始luc基因表达(11倍)，而不能激活-115/+204；Borf-1与Tat共同激活-410/+204倍数(39)超过了两者单独激活倍数(11和25)之和，而对-115/+204则没有这种作用。这表明Borf-1对BIV的激活作用与BIV Tat具有协同作用，同时也进一步证明Borf-1对BIV LTR激活作用靶序列位于-410/-115，而与-115/+204无关。
3 讨论
本研究在过去工作的基础上[1～9]，结合新近对新分离到的BSV3026中国毒株的研究结果(另文发表)，首次证实BSV在细胞水平上能对BIV行使激活功能，这种激活作用是由BSV的反式激活因子Borf-1所致，且Borf-1与BIV自身的反式激活因子能协同激活BIV。这表明BSV超感染与BHV、BVDV等一样能激活BIV基因表达[3～5]，并可诱导BIV携带者产生类AIDS症状甚至死亡，从一个侧面解释了自然界中普通存在BSV自发感染而致BIV阳性个体死亡这一现象[2，8]，也有助于对免疫缺陷病毒致病机理的探索。
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表2 BSV Borf-1, BIV Tat对BIV LTR的激活作用
Table 2 Activation of the BIV LTR by Borf-1 and Tat 共转染质粒
Cotransfecting
plasmid
Luc值a
Luc activity of pBIV LTR-Luca
pBIV LTR-Luc
-410/+204 -115/+204
pUC18
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530
340
Borf-1
6970(11)
310(0.9)b
Tat
13420(25)
13670(40)
Tat+Borf-1
20620(39)
14390(42)
a :同表1；b ：括号内为激活倍数。
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a :as in the legend of table 1 b :fold increase
深入研究表明，BSV对BIV的激活作用源于BIV LTR上存在BSV反式激活因子Borf-1的应答区(-410/-115)，在BIV Tat调控中起重要作用的NF-κB位点(-367/-319)缺失并不影响BSV Borf-1的激活功能，且该区也不包括BIV自身的反式激活因子Tat的靶序列(-2/+204)[8,9]。此外BIV及Tat均不激活BSV LTR起始基因表达(待发表)。这些结果说明Borf-1与Tat对BIV的激活机理相差很大，也反映了泡沫病毒属(BSV)与慢病毒属(BIV)基因表达调控机制的不同。
事实上，调控机理相差甚远的病毒之间的相互作用现象是普通存在的。现已证明，AIDS病人常常伴随有其他病毒的超感染，例如单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、人疱疹病毒6型(HHV-6)、巨细胞病毒(CMV)、乙肝病毒(HBV)等DNA病毒都能编码蛋白直接或间接激活HIV LTR的不同功能区[7]。不仅如此，与HIV同属反转录病毒科的HTLV、人泡沫病毒(HFV)等均能激活HIV LTR起始基因表达[11，12]。Lee等和Keller等研究表明HFV反式激活因子Bel-1在体外能激活HIV LTR，其应答序列位于HIV LTR -158/-118之间(+1为转录起点)，紧邻HIV LTR核心增强子。该区域与已知的转录调控位点缺乏同源性，而且HIV LTR缺失其基因表达调控的功能位点NF-κB时，Bel-1对其激活作用可以提高100倍。令人更感兴趣的是，将-158/-118片段克隆至异源LTR启动子上，Bel-1仍然能激活使其表达，且与该片段相对于启动子的方向无关。这些说明HIV LTR -158/-118即为Bel-1应答元件(TRE)，并具有类似增强子的特点。并且，Bel-1对TRE的应答不需要任何HIV Tat应答元件的作用，这说明Bel-1与Tat对HIV的激活作用机理也不相同，这与本研究结果类似。比较Bel-1在HIV LTR上的TRE与Bel-1在HFV LTR上的TREs发现HIV TRE区(-124/-116)与HFV TREs (-134/-126)有9个保守的核苷酸序列。这说明Bel-1对HIV的激活作用至少与Bel-1对HFV的激活作用部分相似，即通过识别LTR上特异序列行使功能[11～14]。BIV Borf-1应答区(-410/-115)与BSV Borf-1靶点(TRE)之间是否也有类似的序列，还有待深入研究。
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体内研究也证明了HFV对HIV的激活作用，而且证明这种作用需要HIV LTR NF-κB位点(这点与Lee等、Keller等体外研究结果明显有别[15])。研究表明转基因鼠体内HFV对HIV的激活是一种协同作用，这种作用的机理，一方面可能是因为HFV能包裹HIV基因组而扩大其宿主范围，HFV毒株形成的特殊性支持这种设想[15，16]；另一方面可能是HIV携带者免疫力低下，使HFV机会感染增强而协同加速AIDS进程。从本研究结果推测自然状态下BSV与BIV共感染可能也会协同激活BIV，加速BIV携带个体的类AIDS进程并死亡，其机制是否与上述机理相同尚需研究证实。
最后需指出的是FBL细胞可能是BSV3026的最佳宿主之一，但不一定是BIV的最佳宿主[6，7，17，18]，而不同的宿主细胞或细胞系及不同的毒株都会影响激活效果[11，12，19]。这可能是本研究中BSV对BIV激活倍数不高的原因之一，也不排除可能BSV对BIV的激活作用本来就较弱。此外，研究反式激活因子(Borf-1)在异源LTR上的精确靶点，需在本研究的基础上进一步缩小靶点范围并引入点突变，这也是深入进行BSV与BIV共感染机理研究的方向之一。
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参考文献
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单位：南开大学生命科学学院，天津 300071
关键词：牛泡沫病毒(BSV)；牛泡沫病毒反式激活因子(Borf-1)；牛免疫缺陷病毒(BIV)
中国病毒学/990310摘 要 用瞬时表达分析等方法，证明牛泡沫病毒(BSV)3026中国毒株能在体外激活牛免疫缺陷病毒(BIV)基因表达，BSV3026编码的反式激活因子Borf-1行使这种激活作用。缺失突变分析表明，Borf-1在BIV LTR上靶序列位于-410/-115(+1为转录起始位点)区域，但其中的NF-κB位点(-367/-319)与这种激活作用无关，包括转录起点下游(RU5区)在内的-115/+204区域也与这种激活作用无关。该结果对研究BIV致病机理及防治AIDS有重要意义。
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Gene Expression by Bovine Spumavirus (BSV)
Liu Jiajian Liu Shuhong Chen Qimin Geng Yunqi
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Abstract Bovine spumavirus (BSV) 3026 China strain, which was isolated by authors, encodes the transcriptional transactivator Borf-1. The Borf-1 protein, as well as the BSV3026, can transactivate the gene expression directed by bovine immunodeficiency virus long terminal repeat (BIV LTR) in transient transfection assays. To identify the specific region in BIV LTR responsible for the Borf-1 action, it was examined that the effect of the Borf-1 on firefly luciferase (Luc) gene expression in transfected cells with a series of mutant pBIV LTR-luc plasmids. The region between -410 and -115 from the transcription initiation site was identified as responsible for the transactivation by the Borf-1. However, the regions between -367 and -319 (NF-κB site), between -52 and +204, which are very important in the activation of BIV transcription, are dispensable for the Borf-1-mediated transactivation.
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Key words Bovine spumavirus (BSV), Transcriptional transactivator of the BSV (Borf-1), Bovine immunodeficiency virus (BIV)
牛免疫缺陷病毒(bovine immunodeficiency virus, BIV)是反转录病毒科慢病毒属成员之一，与HIV在病毒形态、感染周期、基因组结构、表达调控等方面十分相似，能引起牛淋巴细胞增多症、中枢神经系统损伤及进行性消瘦等多种类艾滋(AIDS)症状[1]。流行病学调查表明BIV分布范围广，普遍存在与其它病毒，如牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛泡沫病毒(bovine spumavirus, BSV)等的交叉感染，且交叉感染率高。这种交叉感染常常是导致BIV阳性牛类AIDS症状并导致死亡的原因[1，2]。BHV、BVDV对BIV激活作用的研究结果均证明了这一点[3～5]。因此，探索病毒的交叉感染对BIV的影响，对研究BIV的病理及防治AIDS具有重要意义。
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BSV与BIV同属反转录病毒科，与BIV具有相似的基因组结构，但属泡沫病毒属。流行病学调查表明BSV与BIV有较高的交叉感染率，事实上BSV3026中国病毒株就是从BIV感染的牛体内分离到的[2，6]。本研究在对BSV3026分子生物学研究取得了初步结果的基础上(另文发表)，进一步研究证明BSV在细胞水平能激活BIV，这种激活作用是由BSV编码的反式激活因子(Borf-1)所致。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 用含10%胎牛血清(天津生化制品厂生产)的DMEM，37 ℃ 5% CO2条件下培养本室分离的胎牛肺(FBL)细胞，用于繁殖病毒和转染。DMEM购自GIBCO/RBL。
1.2 质粒构建 BSV3026感染的FBL细胞中提取的Hirt DNA为模板，用PCR方法克隆BSV反式激活因子(Borf-1)基因，将该基因克隆到本室保藏的pRSVcat质粒的RSVLTR之后替换cat基因构建Borf-1表达质粒pBSVORF-1。该质粒表达249 aa Borf-1蛋白。BIV LTR各缺失质粒(参见图1)及BIV反式激活因子Tat表达质粒pBIVTat等为本室保藏[4，8，9]。
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1.3 质粒转染与荧光素酶活力测定 病毒BSV3026感染质粒转染FBL细胞时，先用质粒转染FBL细胞24 h后加入培养好的病毒，其转染步骤参见GIBCO/BRL公司产品说明书。荧光素酶(Luc)活力测定参见Promega公司产品说明书。
1.4 β gal内对照系统 所有转染均设β gal内对照系统。pCMV β gal质粒为本室保藏。ONPG、β-galactosidase购自Sigma公司。
2 结果
2.1 BSV3026对BIV LTR-Luc整体水平上的激活作用
为了证明BSV3026是否能激活BIV基因表达，本研究首先用pBIV LTR-Luc质粒与pUC18(对照)或pBIV Tat共转染FBL细胞；用病毒(感染FBL细胞的BSV3026，即FBL/BSV3026)分别感染pBIV LTR-Luc质粒单独转染和pBIV LTR-Luc与pBIV Tat共转染的FBL细胞；其中病毒感染质粒转染FBL细胞时，在质粒转染24 h时后按FBL/BSV3026与FBL细胞(铺板时的计数)为1∶8的比例加入病毒，瞬时表达分析如表1所示。结果表明BIV LTR能被自身的反式激活因子Tat激活(25倍)，同时还能被BSV3026单独(11倍)或协同激活(pBIV Tat+FBL/BSV3026, 37倍)。这说明BSV3026能在整体水平上激活BIVLTR起始Luc基因表达，并能协同BIV Tat激活BIV LTR。
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表1 BSV3026对BIVLTR的激活作用
Table 1 Activation of the BIV LTR by BSV3026 共转染(或感染)
Cotransfecting plasmid
Luc值a
Luc activity of pBIVLTR-Luca
激活倍数
Fold increase
pUC18
530±28
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13420±807
25
FBL/BSV3026
5970±115
11
pBIV Tat+FBL/BSV3026
19550±1016
37
a 每孔转染用1.0 μg pBIVLTR-Luc, 1 μg pUC18(或pBIV Tat), 0.6 μg pCMV β gal 与3 μg Lipofect AMINE (GIBCO/RBL)混合。每样品设三孔平行对照。转染48 h后裂解细胞测荧光素酶(Luc)值。Luc值经β-gal内对照校正后，平行组之间变异系数<10%。
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a Each experiment was done at least 3 times in triplicate and each plate was transfected with 1 μg of pBIVLTR-Luc, 1 μg of pUC18 or pBIV Tat, 0.6 μg pCMV β gal and 3 μg Lipofect AMINE (GIBCO/BRL). The cells were harvested to determine Luc activity at 48 h after transfection. Luciferase activities were normalize for the amount of β-galactosidase. Generally, less than 10% variation in replicate samples was observed.
2.2 BSV3026的反式激活因子Borf-1对BIVLTR的激活作用
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为了探寻BSV3026对BIVLTR整体水平的激活作用是否与BSV的反式激活因子Borf-1有关，我们构建了Borf-1的表达质粒pBSVORF-1，将它与pBIV LTR-Luc系列缺失质粒[4，8，9]共转染FBL细胞，瞬时表达结果见图1。可以看出BSV的反式激活因子Borf-1能激活BIVLTR起始Luc基因表达，激活倍数为11.3；当BIVLTR从5′端缺失到-115时，激活倍数依次下降至8.9、7.4、5.2直到0.9(即缺失到-115失去激活作用)；继续从5′端缺失至-52(-52/+204)同样不能被Borf-1激活(激活倍数为1.1)；当3′端缺失+32/+204及-2/+204(整个RU5区)，即质粒-410/+32和-410/-2，能被Borf-1激活(激活倍数分别为8.7和9.5)。这些结果表明Borf-1在BIVLTR上的靶序列位于-410/-115区域，-115/+204(包括整个RU5区)与激活作用无关。
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图1 BSV Borf-1对BIVLTR的激活作用。LTR结构及质粒构建参见文献4，8，9。+和-表示有或无pBSVORF-1共转染。注a同表1。
Fig.1 Activation of the BIV LTR by the Borf-1 of the BSV. The diagram (upper) shows some regulatory elements in the BIV LTR, Luc: Firefly luciferase gene. Lines (lower) represent the BIV LTR regions remaining after deletion[4，8，9].+and-, presence or absence of Borf-1. a as in the legend of table 1.
研究表明NF-κB位点(-367/-319)在BIV Tat反式激活功能中起重要作用[8，9]，为了研究该位点是否参与Borf-1对BIV LTR的反式激活作用，将缺失该位点的质粒Δ-367/-319(NF-κB)与Borf-1表达质粒共转染，结果发现其激活倍数(图1中的10.4)比保留该位点时的激活倍数(11.3)几乎没有变化。这说明Borf-1对BIV LTR的反式激活作用与NF-κB位点无关。
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2.3 Borf-1与Tat协同激活BIV LTR起始基因表达
为了研究Borf-1对BIV LTR的激活是否与BIV自身的反式激活因子Tat具有协同作用，将质粒pBIV LTR(-410/+204)-Luc、pBIV LTR(-115/+204)-Luc分别与BIV Tat，BSV Borf-1表达质粒共转染，结果见表2。从表2可以看出Borf-1单独能激活-410/+204起始luc基因表达(11倍)，而不能激活-115/+204；Borf-1与Tat共同激活-410/+204倍数(39)超过了两者单独激活倍数(11和25)之和，而对-115/+204则没有这种作用。这表明Borf-1对BIV的激活作用与BIV Tat具有协同作用，同时也进一步证明Borf-1对BIV LTR激活作用靶序列位于-410/-115，而与-115/+204无关。
3 讨论
本研究在过去工作的基础上[1～9]，结合新近对新分离到的BSV3026中国毒株的研究结果(另文发表)，首次证实BSV在细胞水平上能对BIV行使激活功能，这种激活作用是由BSV的反式激活因子Borf-1所致，且Borf-1与BIV自身的反式激活因子能协同激活BIV。这表明BSV超感染与BHV、BVDV等一样能激活BIV基因表达[3～5]，并可诱导BIV携带者产生类AIDS症状甚至死亡，从一个侧面解释了自然界中普通存在BSV自发感染而致BIV阳性个体死亡这一现象[2，8]，也有助于对免疫缺陷病毒致病机理的探索。
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表2 BSV Borf-1, BIV Tat对BIV LTR的激活作用
Table 2 Activation of the BIV LTR by Borf-1 and Tat 共转染质粒
Cotransfecting
plasmid
Luc值a
Luc activity of pBIV LTR-Luca
pBIV LTR-Luc
-410/+204 -115/+204
pUC18
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530
340
Borf-1
6970(11)
310(0.9)b
Tat
13420(25)
13670(40)
Tat+Borf-1
20620(39)
14390(42)
a :同表1；b ：括号内为激活倍数。
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a :as in the legend of table 1 b :fold increase
深入研究表明，BSV对BIV的激活作用源于BIV LTR上存在BSV反式激活因子Borf-1的应答区(-410/-115)，在BIV Tat调控中起重要作用的NF-κB位点(-367/-319)缺失并不影响BSV Borf-1的激活功能，且该区也不包括BIV自身的反式激活因子Tat的靶序列(-2/+204)[8,9]。此外BIV及Tat均不激活BSV LTR起始基因表达(待发表)。这些结果说明Borf-1与Tat对BIV的激活机理相差很大，也反映了泡沫病毒属(BSV)与慢病毒属(BIV)基因表达调控机制的不同。
事实上，调控机理相差甚远的病毒之间的相互作用现象是普通存在的。现已证明，AIDS病人常常伴随有其他病毒的超感染，例如单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、人疱疹病毒6型(HHV-6)、巨细胞病毒(CMV)、乙肝病毒(HBV)等DNA病毒都能编码蛋白直接或间接激活HIV LTR的不同功能区[7]。不仅如此，与HIV同属反转录病毒科的HTLV、人泡沫病毒(HFV)等均能激活HIV LTR起始基因表达[11，12]。Lee等和Keller等研究表明HFV反式激活因子Bel-1在体外能激活HIV LTR，其应答序列位于HIV LTR -158/-118之间(+1为转录起点)，紧邻HIV LTR核心增强子。该区域与已知的转录调控位点缺乏同源性，而且HIV LTR缺失其基因表达调控的功能位点NF-κB时，Bel-1对其激活作用可以提高100倍。令人更感兴趣的是，将-158/-118片段克隆至异源LTR启动子上，Bel-1仍然能激活使其表达，且与该片段相对于启动子的方向无关。这些说明HIV LTR -158/-118即为Bel-1应答元件(TRE)，并具有类似增强子的特点。并且，Bel-1对TRE的应答不需要任何HIV Tat应答元件的作用，这说明Bel-1与Tat对HIV的激活作用机理也不相同，这与本研究结果类似。比较Bel-1在HIV LTR上的TRE与Bel-1在HFV LTR上的TREs发现HIV TRE区(-124/-116)与HFV TREs (-134/-126)有9个保守的核苷酸序列。这说明Bel-1对HIV的激活作用至少与Bel-1对HFV的激活作用部分相似，即通过识别LTR上特异序列行使功能[11～14]。BIV Borf-1应答区(-410/-115)与BSV Borf-1靶点(TRE)之间是否也有类似的序列，还有待深入研究。
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体内研究也证明了HFV对HIV的激活作用，而且证明这种作用需要HIV LTR NF-κB位点(这点与Lee等、Keller等体外研究结果明显有别[15])。研究表明转基因鼠体内HFV对HIV的激活是一种协同作用，这种作用的机理，一方面可能是因为HFV能包裹HIV基因组而扩大其宿主范围，HFV毒株形成的特殊性支持这种设想[15，16]；另一方面可能是HIV携带者免疫力低下，使HFV机会感染增强而协同加速AIDS进程。从本研究结果推测自然状态下BSV与BIV共感染可能也会协同激活BIV，加速BIV携带个体的类AIDS进程并死亡，其机制是否与上述机理相同尚需研究证实。
最后需指出的是FBL细胞可能是BSV3026的最佳宿主之一，但不一定是BIV的最佳宿主[6，7，17，18]，而不同的宿主细胞或细胞系及不同的毒株都会影响激活效果[11，12，19]。这可能是本研究中BSV对BIV激活倍数不高的原因之一，也不排除可能BSV对BIV的激活作用本来就较弱。此外，研究反式激活因子(Borf-1)在异源LTR上的精确靶点，需在本研究的基础上进一步缩小靶点范围并引入点突变，这也是深入进行BSV与BIV共感染机理研究的方向之一。
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