转化生长因子β1、干扰素γ和肿瘤坏死因子α在兔日本血吸虫病发病过程中的表达
作者：陈峰 蔡卫民 陈智 杨艳宏 翁红雷 刘荣华
单位：(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所)
关键词：
中华医学杂志000232 日本血吸虫病发病过程中虫卵肉芽肿和肝纤维化是两种最主要的病理改变，肝纤维化是导致日本血吸虫病合并严重并发症与死亡的最根本原因。我们动态观察了感染日本血吸虫尾蚴后的新西兰兔虫卵肉芽肿、肝纤维化的形成过程，以形态学为基础，观察肝脏干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达的动态变化，现将结果报道如下。
一、材料与方法
1.动物：健康新西兰兔(下简称兔)由杭州市药物检验所提供，体重2.5～3.0 kg，共70只，雌雄各半。其中10只为正常对照组，余60只均感染日本血吸虫尾蚴80条±1条。于感染后4、6、8、10、12、16，20，24及28周在股静脉采血，分别处死并外科手术取左叶肝脏组织大小约2 cm×1 cm，作病理及免疫组织化学检查，以及几种细胞因子mRNA水平测定。
, http://www.100md.com
2.方法：(1)分子生物学法检测细胞因子mRNA水平。用定量PCR技术检测肝脏细胞因子TGF-β1、IFN-γ和TNF-α的mRNA水平：兔引物由美国Gibco公司合成， MMLV-RT逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Oligo d(T)15等购自美国Gibco公司，RNA酶抑制剂购自瑞典Pharmacia Biotech公司，Dig标记Kit、Dig检测Kit、正离子尼龙膜、Dig标记PCR混合物等购自德国Boehringer Mannhein公司，方法见文献[1]，以β-actin为内对照；(2) 病理与免疫组织化学检测：肝组织常规石蜡切片，HE染色，观察肝脏的形态学，并用测微量器测定单个血吸虫虫卵肉芽肿的大小(最大横径×最大纵径)，Masson三色染色和天狼红染色观察与确定纤维化程度。肝纤维化程度判断标准：0级20=1，正常；Ⅰ级21=2，胶原纤维包绕插入肉芽肿周围；Ⅱ级22=4，汇管区有大量纤维化，小叶间仅有少量纤维；Ⅲ级23=8，纤维组织大量延伸至小叶间。
, 百拇医药
3.统计学分析：所获数据输入电脑，用SPSS统计软件进行t检验。
二、结果
1.肝肉芽肿炎症坏死情况：血吸虫感染后第4周，肝组织轻度炎症，未见虫卵肉芽肿；第6周后，肝脏有急性虫卵肉芽肿形成；第8周肉芽肿大小达高峰，其后逐渐缩小(表1)。
2.肝纤维化程度：血吸虫感染后第8周肝脏肉芽肿周围已见胶原纤维。肝星状细胞在炎症早期已有激活，炎症后期大量转化为肌成纤维细胞并增殖明显(表1)。
表1 兔血吸虫不同感染时间后肝脏肉芽肿肝纤维化及细胞因子的水平(
±s) 组别
兔数
(只)
, 百拇医药
肝肉芽肿
(mm2)
肝纤维化△
细胞因子/β-actin比值
TGF-β1
IFN-γ
TNF-α
正常组
9
0
0
1.4±0.9
, 百拇医药
0.6±0.4
1.9±1.1
感染组(感染周数)
4
8
0
1.0±0.0
4.2±2.8▲
1.1±1.7
4.1±1.9
6
8
, 百拇医药 129±55
1.4±0.5
6.3±4.3*
2.5±1.9*▲
3.0±3.6▲
8
8
202±86
2.3±0.7
22.6±18.8*
12.4±1.0*
, 百拇医药
7.3±2.9*
10
8
164±41
3.8±0.7
16.9±16.2*
10.8±10.1*
8.0±7.2*
12
8
88±10
, 百拇医药 5.3±2.2
12.2±9.3*
7.3±5.9*
7.9±7.1*
16
8
30±14
5.6±2.2
2.5±1.7
1.3±0.9
3.2±2.3
20
, 百拇医药
8
13±6
6.0±2.0
1.7±1.4
1.0±0.7
2.6±1.0▲
24
8
5±3
6.5±1.9
1.8±1.2
0.9±0.5
, http://www.100md.com 2.2±1.0
28
6
4.5±2
7.0±1.7
1.7±1.4
0.6±0.3
2.1±1.5
注：△数据为肝纤维化3个等级的相应得分；*与正常组比较P<0.05；▲与第8周比较P<0.05 3.肝脏几种细胞因子mRNA水平变化：见表1
三、讨论
, 百拇医药
细胞因子在血吸虫病发病机理的研究是目前研究热点，建立一个可信的检测方法是研究的首要任务，因此我们十分重视其检测方法的运用和改进。我们根据Roulot等方法，并加以改进，建立RT-PCR加Dot blot法[1]，以β-actin为内对照均衡标本间的差异，作用可信。
IFN-γ与TNF-α在肉芽肿形成过程中起重要调节作用，有报道注射血吸虫尾蚴疫苗后，动物体内淋巴细胞可产生大量的IFN-γ[2]。IFN-γ和TNF-α可增强T细胞介导的免疫，杀伤童虫。有学者发现TGF-β1对注射疫苗后的保护免疫起负调节作用[3]。血吸虫病感染早期即有肝内TGF-β1的增高，可能与其具有抗炎作用有关。TGF-β1是目前公认的致肝纤维化因子，而IFN-γ作为抗肝纤维化因子已在临床应用[4]，肌注1年以上未见副作用，可在某种程度上对抗TGF-β1的作用，被称为TGF-β1的拮抗剂。本研究结果显示，在血吸虫病感染早期，多种细胞因子均有增加，它们之间相互作用，构成了一个复杂的网络，TGF-β1抑制肉芽肿形成，而TNF-α起促进作用。
, 百拇医药
肉芽肿大小在血吸虫尾蚴感染后第8周达到高峰，同时可见有肌成纤维细胞形成，其后随时间推移肉芽肿逐渐缩小，但肝纤维化程度逐渐加重，提示在慢性血吸虫病肝脏肉芽肿已不是主要病理变化，肝纤维化更为重要，其形成过程肝星状细胞激活、转化为肌成纤维细胞并增殖，显示肉芽肿与肝纤维化关系中，肝星状细胞起桥梁作用。随着血吸虫感染的病程进展，肉芽肿炎症不断减轻，TGF-β1下降不明显，其与IFN-γ比值有上升，并与肝纤维化程度有关。因此，我们认为研究肉芽肿与肝纤维化不能单纯研究一个细胞因子，应同时研究多个细胞因子。
基金项目：总理专项基金资助项目(94-Y-38)
参考文献
[1]陈峰，蔡卫民，陈智，等.转化生长因子β1 mRNA检测方法的建立.中国寄生虫学寄生虫病杂志 ,1998, 16：219-222.
[2]Mountford AP,Anderson S, Wilson RA. Induction of the cell-mediated protective immunity to schistosoma mansoni by coadministration of larval antigens and IL-12 as an adjuvant. TJ Immunol ,1996,156: 4739-4745.
, http://www.100md.com
[3]Williams ME, Caspar P, Oswald I, et al. Vaccination routes that fail to elicit protective immunity against schistosoma mansoni induce the production of TGF-beta, which down-regulates macrophage antiparasitic activity. J Immunol,1995, 154: 4693-4700.
[4]蔡卫民，陈智，陈峰，等.γ-干扰素抗肝纤维化临床疗效初步观察. 临床肝胆病杂志,1998, 14：18-20.
收稿日期：1999-02-20, http://www.100md.com
单位：(310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所)
关键词：
中华医学杂志000232 日本血吸虫病发病过程中虫卵肉芽肿和肝纤维化是两种最主要的病理改变，肝纤维化是导致日本血吸虫病合并严重并发症与死亡的最根本原因。我们动态观察了感染日本血吸虫尾蚴后的新西兰兔虫卵肉芽肿、肝纤维化的形成过程，以形态学为基础，观察肝脏干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达的动态变化，现将结果报道如下。
一、材料与方法
1.动物：健康新西兰兔(下简称兔)由杭州市药物检验所提供，体重2.5～3.0 kg，共70只，雌雄各半。其中10只为正常对照组，余60只均感染日本血吸虫尾蚴80条±1条。于感染后4、6、8、10、12、16，20，24及28周在股静脉采血，分别处死并外科手术取左叶肝脏组织大小约2 cm×1 cm，作病理及免疫组织化学检查，以及几种细胞因子mRNA水平测定。
, http://www.100md.com
2.方法：(1)分子生物学法检测细胞因子mRNA水平。用定量PCR技术检测肝脏细胞因子TGF-β1、IFN-γ和TNF-α的mRNA水平：兔引物由美国Gibco公司合成， MMLV-RT逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Oligo d(T)15等购自美国Gibco公司，RNA酶抑制剂购自瑞典Pharmacia Biotech公司，Dig标记Kit、Dig检测Kit、正离子尼龙膜、Dig标记PCR混合物等购自德国Boehringer Mannhein公司，方法见文献[1]，以β-actin为内对照；(2) 病理与免疫组织化学检测：肝组织常规石蜡切片，HE染色，观察肝脏的形态学，并用测微量器测定单个血吸虫虫卵肉芽肿的大小(最大横径×最大纵径)，Masson三色染色和天狼红染色观察与确定纤维化程度。肝纤维化程度判断标准：0级20=1，正常；Ⅰ级21=2，胶原纤维包绕插入肉芽肿周围；Ⅱ级22=4，汇管区有大量纤维化，小叶间仅有少量纤维；Ⅲ级23=8，纤维组织大量延伸至小叶间。
, 百拇医药
3.统计学分析：所获数据输入电脑，用SPSS统计软件进行t检验。
二、结果
1.肝肉芽肿炎症坏死情况：血吸虫感染后第4周，肝组织轻度炎症，未见虫卵肉芽肿；第6周后，肝脏有急性虫卵肉芽肿形成；第8周肉芽肿大小达高峰，其后逐渐缩小(表1)。
2.肝纤维化程度：血吸虫感染后第8周肝脏肉芽肿周围已见胶原纤维。肝星状细胞在炎症早期已有激活，炎症后期大量转化为肌成纤维细胞并增殖明显(表1)。
表1 兔血吸虫不同感染时间后肝脏肉芽肿肝纤维化及细胞因子的水平(
±s) 组别兔数
(只)
, 百拇医药
肝肉芽肿
(mm2)
肝纤维化△
细胞因子/β-actin比值
TGF-β1
IFN-γ
TNF-α
正常组
9
0
0
1.4±0.9
, 百拇医药
0.6±0.4
1.9±1.1
感染组(感染周数)
4
8
0
1.0±0.0
4.2±2.8▲
1.1±1.7
4.1±1.9
6
8
, 百拇医药 129±55
1.4±0.5
6.3±4.3*
2.5±1.9*▲
3.0±3.6▲
8
8
202±86
2.3±0.7
22.6±18.8*
12.4±1.0*
, 百拇医药
7.3±2.9*
10
8
164±41
3.8±0.7
16.9±16.2*
10.8±10.1*
8.0±7.2*
12
8
88±10
, 百拇医药 5.3±2.2
12.2±9.3*
7.3±5.9*
7.9±7.1*
16
8
30±14
5.6±2.2
2.5±1.7
1.3±0.9
3.2±2.3
20
, 百拇医药
8
13±6
6.0±2.0
1.7±1.4
1.0±0.7
2.6±1.0▲
24
8
5±3
6.5±1.9
1.8±1.2
0.9±0.5
, http://www.100md.com 2.2±1.0
28
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4.5±2
7.0±1.7
1.7±1.4
0.6±0.3
2.1±1.5
注：△数据为肝纤维化3个等级的相应得分；*与正常组比较P<0.05；▲与第8周比较P<0.05 3.肝脏几种细胞因子mRNA水平变化：见表1
三、讨论
, 百拇医药
细胞因子在血吸虫病发病机理的研究是目前研究热点，建立一个可信的检测方法是研究的首要任务，因此我们十分重视其检测方法的运用和改进。我们根据Roulot等方法，并加以改进，建立RT-PCR加Dot blot法[1]，以β-actin为内对照均衡标本间的差异，作用可信。
IFN-γ与TNF-α在肉芽肿形成过程中起重要调节作用，有报道注射血吸虫尾蚴疫苗后，动物体内淋巴细胞可产生大量的IFN-γ[2]。IFN-γ和TNF-α可增强T细胞介导的免疫，杀伤童虫。有学者发现TGF-β1对注射疫苗后的保护免疫起负调节作用[3]。血吸虫病感染早期即有肝内TGF-β1的增高，可能与其具有抗炎作用有关。TGF-β1是目前公认的致肝纤维化因子，而IFN-γ作为抗肝纤维化因子已在临床应用[4]，肌注1年以上未见副作用，可在某种程度上对抗TGF-β1的作用，被称为TGF-β1的拮抗剂。本研究结果显示，在血吸虫病感染早期，多种细胞因子均有增加，它们之间相互作用，构成了一个复杂的网络，TGF-β1抑制肉芽肿形成，而TNF-α起促进作用。
, 百拇医药
肉芽肿大小在血吸虫尾蚴感染后第8周达到高峰，同时可见有肌成纤维细胞形成，其后随时间推移肉芽肿逐渐缩小，但肝纤维化程度逐渐加重，提示在慢性血吸虫病肝脏肉芽肿已不是主要病理变化，肝纤维化更为重要，其形成过程肝星状细胞激活、转化为肌成纤维细胞并增殖，显示肉芽肿与肝纤维化关系中，肝星状细胞起桥梁作用。随着血吸虫感染的病程进展，肉芽肿炎症不断减轻，TGF-β1下降不明显，其与IFN-γ比值有上升，并与肝纤维化程度有关。因此，我们认为研究肉芽肿与肝纤维化不能单纯研究一个细胞因子，应同时研究多个细胞因子。
基金项目：总理专项基金资助项目(94-Y-38)
参考文献
[1]陈峰，蔡卫民，陈智，等.转化生长因子β1 mRNA检测方法的建立.中国寄生虫学寄生虫病杂志 ,1998, 16：219-222.
[2]Mountford AP,Anderson S, Wilson RA. Induction of the cell-mediated protective immunity to schistosoma mansoni by coadministration of larval antigens and IL-12 as an adjuvant. TJ Immunol ,1996,156: 4739-4745.
, http://www.100md.com
[3]Williams ME, Caspar P, Oswald I, et al. Vaccination routes that fail to elicit protective immunity against schistosoma mansoni induce the production of TGF-beta, which down-regulates macrophage antiparasitic activity. J Immunol,1995, 154: 4693-4700.
[4]蔡卫民，陈智，陈峰，等.γ-干扰素抗肝纤维化临床疗效初步观察. 临床肝胆病杂志,1998, 14：18-20.
收稿日期：1999-02-20, http://www.100md.com