17β-雌二醇对新生大鼠成骨细胞增殖和分化的影响
作者：郭洪敏 杜靖远
单位：430022 武汉， 同济医科大学附属协和医院骨科[郭洪敏(现在山东济宁市第一人民医院骨外科)，杜靖远]
关键词：
中华妇产科杂志990219 骨是一种有活力的、不断更新的组织，受体内激素的调控。正常情况下破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成两者间保持动态平衡。绝经后妇女雌激素低下骨丢失明显加快，已被证明是骨质疏松的关键因素[1]。近几年，有关雌激素对骨质疏松的作用研究有不少报道，但结果不一。本实验目的在于观察17β-雌二醇(E2)对新生大鼠成骨细胞增殖和分化的影响，进一步探讨雌激素对骨形成的作用。
一、材料与方法
1.材料：17β-E2为美国Sigma公司产品。溶于无水乙醇配成10-3 mol/L的贮存液。实验用培养液稀释为最终浓度10-8 mol/L～10-10 mol/L，其中的乙醇量不超过1 μl/ml。
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2.成骨细胞的分离、培养和分组：参照文献[2] 及本实验室常规方法，将从新生1～2天的SD大鼠(同济医科大学实验动物中心提供)分离到的颅骨成骨细胞种植在含体积分数为0.2的小牛血清DMEM培养液(英国Gibco公司产品)中，制成单细胞悬液，置37℃、5% CO2 培养箱内培养，10天左右细胞融合后消化传代。本实验用第2代培养的成骨细胞。将细胞分成实验组及对照组，实验组加入不同浓度的17β-E2 ，对照组加同实验组等量的乙醇(1 μl/ml)。
3.细胞生长曲线：以5×104 细胞/ml接种于培养瓶中，24小时换成低浓度血清(浓度为5%小牛血清)DMEM培养基，同时加入10-8 mol/L～10-10 mol/L的17β-E2，每种浓度4瓶，并设对照组。在给药后的第3天，用浓度为0.25%的胰酶消化。制成单细胞悬液，采用质量浓度为0.0001的台盼蓝染色排除法，用血细胞计数器计数活细胞数，连续3次，取均值。
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4.3H-胸苷掺合试验：细胞合成DNA时摄取胸苷作为原料。将培养的细胞以胰酶消化后，按3×104 细胞/孔接种于24孔培养板内，24小时后换成低浓度血清DMEM培养基，加入不同浓度的17β-E2 (10-8 mol/L～10-10 mol/L)。对照组加等体积的乙醇。每浓度重复4次，共培养72小时。在66小时每孔加入1 μCi 3 H-胸苷(中国科学院上海原子能研究所产品)继续培养6小时，吸去培养液，PBS洗涤3次，每孔内加入0.1 mol氢氧化钠溶液1 ml，在4℃过夜，将溶液收集于闪烁瓶中，加入适量的第1闪烁体及第2闪烁体。暗适应3小时，用液体闪烁仪测量每孔的放射性核素闪烁计数值(CPM)。实测CPM值=测得CPM值-非特异性结合CPM值-仪器本底CPM值。
5.细胞内骨钙素(BGP)定量测定：以5×104细胞种于培养瓶中，24小时后换成低浓度血清的DMEM培养基，同时加入不同浓度的17β-E2 (10-8 mol/L～10-10 mol/L)，每浓度重复4次。对照组加等体积乙醇，培养3天，消化悬浮后取106个细胞，离心后加入1ml PBS与浓度为0.2%的triton-x-100(含4 mmol EDTA)，按1∶1混合，静置10分钟后，用放射免疫法测定BGP含量。药盒为北方生物技术研究所提供。
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6.细胞内碱性磷酸酶(ALP)测定：细胞处理同BGP测定，按文献[3]的方法测定ALP活性。底物为0.02 mol/L的β-硝基苯磷酸盐。测ALP的反应液pH为9.3，37℃反应30分钟，加0.1 mol/L的NaOH终止反应，400 nm处测定吸光度。同时用双缩脲法测定组织液中的蛋白质含量。酶的一个活性单位(U)定义为：37℃反应30分钟，水解1 μmol底物的酶活性，结果以U/mg蛋白质表示。
7.统计学方法：所有参数均用
±s表示，采用t检验检测各不同浓度实验组与对照组间的差异。
二、结果
1.17β-E2对细胞生长的影响: 雌激素可明显促进成骨细胞的生长，且呈剂量依赖性，剂量最大者(10-8 mol/L)作用最明显。
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2.17β-E2对成骨细胞3H-胸苷掺合、BGP、ALP的影响：如表1所示，17β-E2可促进成骨细胞增值，增加ALP的含量，对BGP无影响。
表1 17β-E2对成骨细胞增殖和分化的影响(±s) 药物浓度(mol/L)
CPM
BGP(ng/L)
ALP(U/mg蛋白)
0
3 488±736
25.5±5.8
, 百拇医药
179±15
10-10
5 229±620*
26.7±7.7
195±17
10-9
5 831±949*
28.2±7.9
217±14*
10-8
6 091±357**
, 百拇医药
28.4±6.3
215±21*
与对照组相比，*P<0.05 **P<0.01
三、讨论
雌激素对体外培养成骨细胞的作用有不少报道，由于细胞来源不同、生长发育成熟不同，其结果不尽一致。本实验结果表明，17β-E2可促进大鼠成骨细胞增殖，增加ALP的合成。这种增强作用呈剂量依赖性，以10-8 mol/L浓度作用为明显。说明，雌激素对成骨细胞有直接促增殖效应，同时对增殖后成骨细胞的分化程度也有促进作用。与Robert等[4]报道的相似。
对于17β-E2是否促进成骨细胞分化与增殖仍有争议。有学者认为雌激素对骨的生长、ALP活性及数种破骨细胞刺激因子的产生无作用[5] 。但多数学者认为，雌激素可促进骨形成及骨细胞增殖[3，4，6]，与我们的实验结果相似。近年来已经在成骨细胞及破骨细胞上分离出了雌激素受体[7，8]，也为雌激素直接作用于成骨细胞提供了证据。体内是一个复杂的环境，雌激素不仅直接作用于成骨细胞，同时亦可作用于骨基质细胞，使其产生或抑制不同的细胞因子的产生。
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因此，雌激素体内应用的效应是一个综合作用的结果，即直接与间接的作用总和。本研究结果为雌激素治疗骨质疏松及保护骨质的作用，提供了一定理论依据。
参考文献
1 Jonhston CCJ,Longcope C.Premenopausal bone loss:a risk factor for osteoporosis.New Eng J Med,1990，323:1271-1273.
2 王洪复.胎鼠头盖骨细胞的实验技术和细胞形态观察. 上海医科大学学报,1991,18:475-477.
3 Tobias JH,Chow J,Colston KW,et al.High concentrations of 17beta-estradiol stimulate trabecular bone formation in adult female rats.Endocrinology,1991，128:408-412.
, http://www.100md.com
4 Robert J,James TR,Thomas AE,et al.Direct modulation of osteoblastic activivty with estrogen. J Bone Joint Surgery,1994，76:713-721.
5 Chaudhary LR,Spelsberg TC,Riggs BL.Production of various cytokines by normal human osteoblast-like cells in response to interleukin-1 beta and tumor necrosis factoralpha:lack of regulation by 17beta-estradiol.Endocrinology,1992，130:2528-2534.
6 Chow JW,Lean JM,Chanbrs TJ.17beta-estradiol stimulates cancellous bone formation in female rats.Endocrinology,1992，130:3025-3032.
7 Eriksen EF,Colvard DS,Berg NJ,et al.Evidence of estrogen receptors in normal human osteoblast-like cells.Science,1988，241:84-86.
8 Ourseler M,Osdoby P,Pyfferoen J,et al.Avian osteoclasts as estrogen target cells.Proc Natl Acad Sci USA,1991，88:6613-6617.
(收稿：1998-06-01 修回：1998-10-16), 百拇医药
单位：430022 武汉， 同济医科大学附属协和医院骨科[郭洪敏(现在山东济宁市第一人民医院骨外科)，杜靖远]
关键词：
中华妇产科杂志990219 骨是一种有活力的、不断更新的组织，受体内激素的调控。正常情况下破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成两者间保持动态平衡。绝经后妇女雌激素低下骨丢失明显加快，已被证明是骨质疏松的关键因素[1]。近几年，有关雌激素对骨质疏松的作用研究有不少报道，但结果不一。本实验目的在于观察17β-雌二醇(E2)对新生大鼠成骨细胞增殖和分化的影响，进一步探讨雌激素对骨形成的作用。
一、材料与方法
1.材料：17β-E2为美国Sigma公司产品。溶于无水乙醇配成10-3 mol/L的贮存液。实验用培养液稀释为最终浓度10-8 mol/L～10-10 mol/L，其中的乙醇量不超过1 μl/ml。
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2.成骨细胞的分离、培养和分组：参照文献[2] 及本实验室常规方法，将从新生1～2天的SD大鼠(同济医科大学实验动物中心提供)分离到的颅骨成骨细胞种植在含体积分数为0.2的小牛血清DMEM培养液(英国Gibco公司产品)中，制成单细胞悬液，置37℃、5% CO2 培养箱内培养，10天左右细胞融合后消化传代。本实验用第2代培养的成骨细胞。将细胞分成实验组及对照组，实验组加入不同浓度的17β-E2 ，对照组加同实验组等量的乙醇(1 μl/ml)。
3.细胞生长曲线：以5×104 细胞/ml接种于培养瓶中，24小时换成低浓度血清(浓度为5%小牛血清)DMEM培养基，同时加入10-8 mol/L～10-10 mol/L的17β-E2，每种浓度4瓶，并设对照组。在给药后的第3天，用浓度为0.25%的胰酶消化。制成单细胞悬液，采用质量浓度为0.0001的台盼蓝染色排除法，用血细胞计数器计数活细胞数，连续3次，取均值。
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4.3H-胸苷掺合试验：细胞合成DNA时摄取胸苷作为原料。将培养的细胞以胰酶消化后，按3×104 细胞/孔接种于24孔培养板内，24小时后换成低浓度血清DMEM培养基，加入不同浓度的17β-E2 (10-8 mol/L～10-10 mol/L)。对照组加等体积的乙醇。每浓度重复4次，共培养72小时。在66小时每孔加入1 μCi 3 H-胸苷(中国科学院上海原子能研究所产品)继续培养6小时，吸去培养液，PBS洗涤3次，每孔内加入0.1 mol氢氧化钠溶液1 ml，在4℃过夜，将溶液收集于闪烁瓶中，加入适量的第1闪烁体及第2闪烁体。暗适应3小时，用液体闪烁仪测量每孔的放射性核素闪烁计数值(CPM)。实测CPM值=测得CPM值-非特异性结合CPM值-仪器本底CPM值。
5.细胞内骨钙素(BGP)定量测定：以5×104细胞种于培养瓶中，24小时后换成低浓度血清的DMEM培养基，同时加入不同浓度的17β-E2 (10-8 mol/L～10-10 mol/L)，每浓度重复4次。对照组加等体积乙醇，培养3天，消化悬浮后取106个细胞，离心后加入1ml PBS与浓度为0.2%的triton-x-100(含4 mmol EDTA)，按1∶1混合，静置10分钟后，用放射免疫法测定BGP含量。药盒为北方生物技术研究所提供。
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6.细胞内碱性磷酸酶(ALP)测定：细胞处理同BGP测定，按文献[3]的方法测定ALP活性。底物为0.02 mol/L的β-硝基苯磷酸盐。测ALP的反应液pH为9.3，37℃反应30分钟，加0.1 mol/L的NaOH终止反应，400 nm处测定吸光度。同时用双缩脲法测定组织液中的蛋白质含量。酶的一个活性单位(U)定义为：37℃反应30分钟，水解1 μmol底物的酶活性，结果以U/mg蛋白质表示。
7.统计学方法：所有参数均用
±s表示，采用t检验检测各不同浓度实验组与对照组间的差异。二、结果
1.17β-E2对细胞生长的影响: 雌激素可明显促进成骨细胞的生长，且呈剂量依赖性，剂量最大者(10-8 mol/L)作用最明显。
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2.17β-E2对成骨细胞3H-胸苷掺合、BGP、ALP的影响：如表1所示，17β-E2可促进成骨细胞增值，增加ALP的含量，对BGP无影响。
表1 17β-E2对成骨细胞增殖和分化的影响(
±s) 药物浓度(mol/L)CPM
BGP(ng/L)
ALP(U/mg蛋白)
0
3 488±736
25.5±5.8
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179±15
10-10
5 229±620*
26.7±7.7
195±17
10-9
5 831±949*
28.2±7.9
217±14*
10-8
6 091±357**
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28.4±6.3
215±21*
与对照组相比，*P<0.05 **P<0.01
三、讨论
雌激素对体外培养成骨细胞的作用有不少报道，由于细胞来源不同、生长发育成熟不同，其结果不尽一致。本实验结果表明，17β-E2可促进大鼠成骨细胞增殖，增加ALP的合成。这种增强作用呈剂量依赖性，以10-8 mol/L浓度作用为明显。说明，雌激素对成骨细胞有直接促增殖效应，同时对增殖后成骨细胞的分化程度也有促进作用。与Robert等[4]报道的相似。
对于17β-E2是否促进成骨细胞分化与增殖仍有争议。有学者认为雌激素对骨的生长、ALP活性及数种破骨细胞刺激因子的产生无作用[5] 。但多数学者认为，雌激素可促进骨形成及骨细胞增殖[3，4，6]，与我们的实验结果相似。近年来已经在成骨细胞及破骨细胞上分离出了雌激素受体[7，8]，也为雌激素直接作用于成骨细胞提供了证据。体内是一个复杂的环境，雌激素不仅直接作用于成骨细胞，同时亦可作用于骨基质细胞，使其产生或抑制不同的细胞因子的产生。
, http://www.100md.com
因此，雌激素体内应用的效应是一个综合作用的结果，即直接与间接的作用总和。本研究结果为雌激素治疗骨质疏松及保护骨质的作用，提供了一定理论依据。
参考文献
1 Jonhston CCJ,Longcope C.Premenopausal bone loss:a risk factor for osteoporosis.New Eng J Med,1990，323:1271-1273.
2 王洪复.胎鼠头盖骨细胞的实验技术和细胞形态观察. 上海医科大学学报,1991,18:475-477.
3 Tobias JH,Chow J,Colston KW,et al.High concentrations of 17beta-estradiol stimulate trabecular bone formation in adult female rats.Endocrinology,1991，128:408-412.
, http://www.100md.com
4 Robert J,James TR,Thomas AE,et al.Direct modulation of osteoblastic activivty with estrogen. J Bone Joint Surgery,1994，76:713-721.
5 Chaudhary LR,Spelsberg TC,Riggs BL.Production of various cytokines by normal human osteoblast-like cells in response to interleukin-1 beta and tumor necrosis factoralpha:lack of regulation by 17beta-estradiol.Endocrinology,1992，130:2528-2534.
6 Chow JW,Lean JM,Chanbrs TJ.17beta-estradiol stimulates cancellous bone formation in female rats.Endocrinology,1992，130:3025-3032.
7 Eriksen EF,Colvard DS,Berg NJ,et al.Evidence of estrogen receptors in normal human osteoblast-like cells.Science,1988，241:84-86.
8 Ourseler M,Osdoby P,Pyfferoen J,et al.Avian osteoclasts as estrogen target cells.Proc Natl Acad Sci USA,1991，88:6613-6617.
(收稿：1998-06-01 修回：1998-10-16), 百拇医药