Hodgkin病组织中EB病毒亚型的检测
作者：周小鸽 李佩娟 纪小龙 严庆汉 张小平 笪季平
单位：
关键词：霍奇金病；疱疹病毒4型；人；淋巴瘤
New Page 1 【摘要】 目的 进一步了解EB病毒亚型在我国Hodgkin病中的感染情况。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法对已知EB病毒阳性的113例Hodgkin病和21例健康人咽部洗液标本进行了EB病毒核抗原基因(EBNA-3C)检测。结果 68例Hodgkin病出现特异扩增带，其中A型EB病毒62例，B型6例；健康人咽部洗液标本中13例有特异.扩增带，其中A型EB病毒11例，B型2例。结论 A型EB病毒是感染我国Hodgkin病的主要亚型。其原因可能不是A型EB病毒致病力强，更可能是由于我国健康人群中受A型EB病毒感染率高。
Detection of Epstein-Barr virus subtypes in Hodgkin′s disease Zhou Xiaoge*, Li Peijuan. Ji Xiaolong, et al. * Beijing Hospital，Beijing 100730
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To investigate Epstein-Barr virus (EBV) subtypes in Chinese patients with Hodgkin′s disease (HD). Methods 113 cases of HD patients with EBV latent membrane protein 1 (LMP-1) and/or EBV encoded small RAN (EBER-1) positive and throat washings from 21 healthy persons were studied for EBV subtypes by polymerase chain reaction (PCR).Results 68 HD cases exhibited specific bands, in which 62 cases were EBV type A and 6 cases were EBV type B. 13 of the control washing gave rise to specific bands, of which 11 were EBV type A and 2 of EBV type B.Conclusion The results showed that EBV type A is predominant in Chinese HD patients and healthy individuals.
, 百拇医药
【Key words】 Hodgkin′s disease Herpsvirus 4, human Lymphoma
Hodgkin病是淋巴系统的一种恶性肿瘤，其病因长期受到人们关注。我们曾用免疫组化和原位杂交方法发现了Epstein-Barr virus(EB病毒)与我国Hodgkin病存在密切关系[1，2]。现在我们采用聚合酶链反应(PCR)对EB病毒的亚型做进一步的研究，以弄清EB病毒亚型在我国Hodgkin病中的感染情况，为生产相关疫苗提供基础资料。
材料和方法
1.标本：从北京市儿童医院病理科、解放军总医院病理科、北京铁路总医院病理科、北京医院病理科、北京空军总医院病理科和内蒙古乌兰察布盟医院病理科1965年～1995年的病理标本中收集了156例Hodgkin病。除8例经Bouin液固定外，其余均由10%福马林固定和石蜡包埋。经EB病毒潜在膜蛋白抗原(LMP-1)免疫组化和EB病毒编码的小RNA(EBER-1)原位杂交检测，113例呈EB病毒阳性。其中67个阳性病例已发表[1，2]，其余46例是新补充的阳性病例。我们着重对这113例EB病毒阳性标本进行了EB病毒亚型的检测。另外，收集了21例健康成年人咽部洗液作为正常人群对照。
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2.试剂：(1)引物类型：EBNA-3C-3序列：5′-AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT-3′；产物长度：A型153 bp。EBNA-3C-5序列：5′-CGGCTGCAGTTTTTGCT CGG-3′；产物长度：B型246 bp。此引物由德国Pharmacia Biotech公司合成，可同时扩增A型和B型EB病毒核抗原基因(EBNA-3C)[3]。(2) dNTP：购自德国Pharmacia Biotech公司。(3)Taq酶、氯化镁、缓冲液购自美国Perkin-Elmer公司。
3.方法[4]：(1)DNA提取：每例蜡块切4张10 μm切片。然后二甲苯两次55℃30分钟脱蜡，99%乙醇两次55℃15分钟除去二甲苯，两滴丙酮55℃30分钟干燥组织，0.28 mg/ml蛋白酶K55℃48小时消化组织，然后96℃20分钟灭活酶活性，最后离心取上清液做为反应模板。咽部洗液标本DNA的提取基本同上，只是无脱蜡过程。(2) PCR：反应混合物包括5 μl DNA模板、1.25 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP、25 pmol/L引物、2 mmol/L氯化镁、5 μl10×缓冲液及双蒸水加至50 μl。第一循环为热启动。即95℃5分钟变性、72℃2分钟(此时加入Taq酶)，57℃1分钟退火及72℃2分钟延长。然后再进行下面的40个循环：94℃1分钟、53℃2分钟及72℃2分钟。在最后一个循环中72℃持续10分钟。(3)电泳：6%琼脂糖(含溴乙淀0.5 μg/ml)电泳，紫外光检测仪检测。检测标准：在153 bp出现扩增带定为A型，在246 bp出现扩增带定为B型。(4)对照：阳性对照包括已知的A型EB病毒细胞株(B95-8)和B型EB病毒细胞株(EBV-2)；阴性对照包括无DNA模板的PCR反应混合物和无组织的蜡块。
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结果
1.临床资料：在经LMP-1免疫组化和EBER-1原位杂交证实的113例EB病毒阳性病例中，男89例，女24例，男女比例为3.7∶1，年龄分布在3～80岁，平均12.77岁，14岁以下儿童占82%。
2.组织学类型：混合细胞型(MC)97例，结节硬化型(NS)10例，淋巴细胞削减型(LD)6例，无淋巴细胞为主型。
M：分子量标记；1：A型EB病毒阳性对照；2：B型EB病毒阳性对照；3～7：Hodgkin病；8，9：健康人咽部洗液标本；10：阴性对照；
附图 Hodgkin病EB病毒PCR检测结果
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3.EB病毒亚型：经过PCR检测，在113例EB病毒阳性病例中，68例出现了特异扩增带，即在153 bp处或在246 bp处出现了扩增带。A型占62例(91%)，其中MC 57例，NS 3例，LD 2例；在年龄上，53例小于14岁，9例大于14岁。B型占6例(9%)(附图)，其中MC 4例，NS 1例，LD 1例；4例小于14岁，2例大于14岁。45例无扩增带。未发现同时受两个亚型感染的病例。这45例无扩增带的病例，后来经人体珠蛋白基因检测仍未出现扩增带，提示这些病例中的DNA可能已断裂成小碎片。在21例健康人咽部洗液标本中，13例出现了特异扩增带，其中11例为A型，2例为B型。阳性对照在相应位置均出现了扩增带，阴性对照均无扩增带出现。
讨论
EB病毒分为两个亚型，A型和B型，亚型之间存在明显差异：(1)从基因结构上看，在EB病毒的一些基因组中(如EBNA-2，EBNA-3A，EBNA-3B，EBNA-3C和EBERs)存在碱基对的缺失或/和插入，因而在同组基因中形成了两种长度不等的序列，人们将其定为A型和B型。我们选用的引物正是检测EBNA-3C基因组的，其扩增产物的长度可有两种：153 bp和246 bp，前者为A型，后者为B型[3]。(2)蛋白水平上的差异，如经B型EBNA-3基因合成的蛋白比经A型EBNA-3C基因合成的蛋白长77个氨基酸[3]。(3)不同的蛋白结构引起不同的抗原抗体反应，因而用血清学方法可间接区分开A型和B型EB病毒感染。(4)在生物学上，B型EB病毒转化B淋巴细胞的能力较A型弱，因此建立B型EB病毒细胞株较困难。(5)从地区分布上看，A型遍布全球，B型多集中在非洲中部一带[5]，但最近认为B型分布有所扩大。(6)从EB病毒相关疾病看，A型感染的疾病较广，B型则集中在部分非洲的Burkitt淋巴瘤、部分人体免疫缺陷病毒(HIV)阳性淋巴瘤和爱斯基摩人鼻咽癌中[6，7]。
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我们对感染我国Hodgkin病的EB病毒亚型进行检测的结果发现，91%的病例受A型EB病毒感染，9%受B型EB病毒感染。由此表明A型EB病毒是感染我国Hodgkin病的主要亚型。这一结果与EB病毒亚型在我国南方鼻咽癌中的感染情况(A型占15/16例)[8]基本一致。
为了解A型EB病毒在我国Hodgkin病中感染占优势的原因，我们对21例健康人的咽部洗液进行了检测，结果A型占11/13例。Khanim等人[9]也有类似的报道(9/10例)。这些结果表明EB病毒在我国健康人中的感染亦以A型为主。因此，A型EB病毒在我国Hodgkin病感染中占优势的原因可能不是因为A型EB病毒致病力较B型强，更可能是由于健康人中A型EB病毒感染的基数大所致。A型EB病毒在我国Hodgkin病和健康人中感染占优势的研究结果可供生产和使用EB病毒疫苗作参考。
参考文献
, 百拇医药
1Zhou XG, Hamilton-Dutoit S, Yan QH, et al. The association between Epstein-Barr virus and Chinese Hodgkin′s disease. Int J Cancer, 1993,55：359-363.
2李佩娟，周小鸽，刘梓荣，等.小儿何杰金淋巴瘤与EB病毒的关系，中华病理学杂志，1994，23：224-226.
3Sample J, Young L, Martin B, et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. J Virol, 1990, 64：4084-4092.
4Sandvaj K, Peh SC, Andersen BS, et al. Identification of potential hot spots in the carboxy-terminal part of the Epstein-Barr virus (EBV) BNLF-1 gene in both malignant and benign EBV-associated disease: high frequency of a 30 bp deletion in Malaysian and Danish peripheral T-cell lymphomas. Blood, 1994,84：4053-4060.
, http://www.100md.com
5Zimber U, Adldinger H, Lenoir G, et al. Genograpgical prevalence of two types of Epstein-Barr virus. Virology, 1986,154：56-66.
6Boyle MJ, Sculley TB, Penny R, et al. The role of Epstein-Barr virus subtypes in human immunodeficiency virus-associatied lymphoma. Leuk Lymphoma, 1993,10：17-23.
7Abdel-Hamid M, Chen JJ, Constantine N, et al. EBV strain variation: geographical distribution and relation to disease state. Virology, 1992,190：168-175.
, http://www.100md.com
8Chen XY, Pepper S, Arrand JR. Prevalence of the A and B types of Epstein-Barr virus DNA in nasopharyngeal carcinoma biopsies from southern China. J General Virol, 1992,73：463-466.
9Khanim F, Yao QY, Niedobitek G, et al. Analysis of Epstein-Barr virus gene polymorphisms in normal donors and in virus-associatied tumors from different geographical locations. Blood, 1996,88：3491-3501.
(收稿：1997-09-11 修回：1998-03-12), 百拇医药
单位：
关键词：霍奇金病；疱疹病毒4型；人；淋巴瘤
New Page 1 【摘要】 目的 进一步了解EB病毒亚型在我国Hodgkin病中的感染情况。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法对已知EB病毒阳性的113例Hodgkin病和21例健康人咽部洗液标本进行了EB病毒核抗原基因(EBNA-3C)检测。结果 68例Hodgkin病出现特异扩增带，其中A型EB病毒62例，B型6例；健康人咽部洗液标本中13例有特异.扩增带，其中A型EB病毒11例，B型2例。结论 A型EB病毒是感染我国Hodgkin病的主要亚型。其原因可能不是A型EB病毒致病力强，更可能是由于我国健康人群中受A型EB病毒感染率高。
Detection of Epstein-Barr virus subtypes in Hodgkin′s disease Zhou Xiaoge*, Li Peijuan. Ji Xiaolong, et al. * Beijing Hospital，Beijing 100730
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【Abstract】 Objective To investigate Epstein-Barr virus (EBV) subtypes in Chinese patients with Hodgkin′s disease (HD). Methods 113 cases of HD patients with EBV latent membrane protein 1 (LMP-1) and/or EBV encoded small RAN (EBER-1) positive and throat washings from 21 healthy persons were studied for EBV subtypes by polymerase chain reaction (PCR).Results 68 HD cases exhibited specific bands, in which 62 cases were EBV type A and 6 cases were EBV type B. 13 of the control washing gave rise to specific bands, of which 11 were EBV type A and 2 of EBV type B.Conclusion The results showed that EBV type A is predominant in Chinese HD patients and healthy individuals.
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【Key words】 Hodgkin′s disease Herpsvirus 4, human Lymphoma
Hodgkin病是淋巴系统的一种恶性肿瘤，其病因长期受到人们关注。我们曾用免疫组化和原位杂交方法发现了Epstein-Barr virus(EB病毒)与我国Hodgkin病存在密切关系[1，2]。现在我们采用聚合酶链反应(PCR)对EB病毒的亚型做进一步的研究，以弄清EB病毒亚型在我国Hodgkin病中的感染情况，为生产相关疫苗提供基础资料。
材料和方法
1.标本：从北京市儿童医院病理科、解放军总医院病理科、北京铁路总医院病理科、北京医院病理科、北京空军总医院病理科和内蒙古乌兰察布盟医院病理科1965年～1995年的病理标本中收集了156例Hodgkin病。除8例经Bouin液固定外，其余均由10%福马林固定和石蜡包埋。经EB病毒潜在膜蛋白抗原(LMP-1)免疫组化和EB病毒编码的小RNA(EBER-1)原位杂交检测，113例呈EB病毒阳性。其中67个阳性病例已发表[1，2]，其余46例是新补充的阳性病例。我们着重对这113例EB病毒阳性标本进行了EB病毒亚型的检测。另外，收集了21例健康成年人咽部洗液作为正常人群对照。
, 百拇医药
2.试剂：(1)引物类型：EBNA-3C-3序列：5′-AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT-3′；产物长度：A型153 bp。EBNA-3C-5序列：5′-CGGCTGCAGTTTTTGCT CGG-3′；产物长度：B型246 bp。此引物由德国Pharmacia Biotech公司合成，可同时扩增A型和B型EB病毒核抗原基因(EBNA-3C)[3]。(2) dNTP：购自德国Pharmacia Biotech公司。(3)Taq酶、氯化镁、缓冲液购自美国Perkin-Elmer公司。
3.方法[4]：(1)DNA提取：每例蜡块切4张10 μm切片。然后二甲苯两次55℃30分钟脱蜡，99%乙醇两次55℃15分钟除去二甲苯，两滴丙酮55℃30分钟干燥组织，0.28 mg/ml蛋白酶K55℃48小时消化组织，然后96℃20分钟灭活酶活性，最后离心取上清液做为反应模板。咽部洗液标本DNA的提取基本同上，只是无脱蜡过程。(2) PCR：反应混合物包括5 μl DNA模板、1.25 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP、25 pmol/L引物、2 mmol/L氯化镁、5 μl10×缓冲液及双蒸水加至50 μl。第一循环为热启动。即95℃5分钟变性、72℃2分钟(此时加入Taq酶)，57℃1分钟退火及72℃2分钟延长。然后再进行下面的40个循环：94℃1分钟、53℃2分钟及72℃2分钟。在最后一个循环中72℃持续10分钟。(3)电泳：6%琼脂糖(含溴乙淀0.5 μg/ml)电泳，紫外光检测仪检测。检测标准：在153 bp出现扩增带定为A型，在246 bp出现扩增带定为B型。(4)对照：阳性对照包括已知的A型EB病毒细胞株(B95-8)和B型EB病毒细胞株(EBV-2)；阴性对照包括无DNA模板的PCR反应混合物和无组织的蜡块。
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结果
1.临床资料：在经LMP-1免疫组化和EBER-1原位杂交证实的113例EB病毒阳性病例中，男89例，女24例，男女比例为3.7∶1，年龄分布在3～80岁，平均12.77岁，14岁以下儿童占82%。
2.组织学类型：混合细胞型(MC)97例，结节硬化型(NS)10例，淋巴细胞削减型(LD)6例，无淋巴细胞为主型。
M：分子量标记；1：A型EB病毒阳性对照；2：B型EB病毒阳性对照；3～7：Hodgkin病；8，9：健康人咽部洗液标本；10：阴性对照；
附图 Hodgkin病EB病毒PCR检测结果
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3.EB病毒亚型：经过PCR检测，在113例EB病毒阳性病例中，68例出现了特异扩增带，即在153 bp处或在246 bp处出现了扩增带。A型占62例(91%)，其中MC 57例，NS 3例，LD 2例；在年龄上，53例小于14岁，9例大于14岁。B型占6例(9%)(附图)，其中MC 4例，NS 1例，LD 1例；4例小于14岁，2例大于14岁。45例无扩增带。未发现同时受两个亚型感染的病例。这45例无扩增带的病例，后来经人体珠蛋白基因检测仍未出现扩增带，提示这些病例中的DNA可能已断裂成小碎片。在21例健康人咽部洗液标本中，13例出现了特异扩增带，其中11例为A型，2例为B型。阳性对照在相应位置均出现了扩增带，阴性对照均无扩增带出现。
讨论
EB病毒分为两个亚型，A型和B型，亚型之间存在明显差异：(1)从基因结构上看，在EB病毒的一些基因组中(如EBNA-2，EBNA-3A，EBNA-3B，EBNA-3C和EBERs)存在碱基对的缺失或/和插入，因而在同组基因中形成了两种长度不等的序列，人们将其定为A型和B型。我们选用的引物正是检测EBNA-3C基因组的，其扩增产物的长度可有两种：153 bp和246 bp，前者为A型，后者为B型[3]。(2)蛋白水平上的差异，如经B型EBNA-3基因合成的蛋白比经A型EBNA-3C基因合成的蛋白长77个氨基酸[3]。(3)不同的蛋白结构引起不同的抗原抗体反应，因而用血清学方法可间接区分开A型和B型EB病毒感染。(4)在生物学上，B型EB病毒转化B淋巴细胞的能力较A型弱，因此建立B型EB病毒细胞株较困难。(5)从地区分布上看，A型遍布全球，B型多集中在非洲中部一带[5]，但最近认为B型分布有所扩大。(6)从EB病毒相关疾病看，A型感染的疾病较广，B型则集中在部分非洲的Burkitt淋巴瘤、部分人体免疫缺陷病毒(HIV)阳性淋巴瘤和爱斯基摩人鼻咽癌中[6，7]。
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我们对感染我国Hodgkin病的EB病毒亚型进行检测的结果发现，91%的病例受A型EB病毒感染，9%受B型EB病毒感染。由此表明A型EB病毒是感染我国Hodgkin病的主要亚型。这一结果与EB病毒亚型在我国南方鼻咽癌中的感染情况(A型占15/16例)[8]基本一致。
为了解A型EB病毒在我国Hodgkin病中感染占优势的原因，我们对21例健康人的咽部洗液进行了检测，结果A型占11/13例。Khanim等人[9]也有类似的报道(9/10例)。这些结果表明EB病毒在我国健康人中的感染亦以A型为主。因此，A型EB病毒在我国Hodgkin病感染中占优势的原因可能不是因为A型EB病毒致病力较B型强，更可能是由于健康人中A型EB病毒感染的基数大所致。A型EB病毒在我国Hodgkin病和健康人中感染占优势的研究结果可供生产和使用EB病毒疫苗作参考。
参考文献
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1Zhou XG, Hamilton-Dutoit S, Yan QH, et al. The association between Epstein-Barr virus and Chinese Hodgkin′s disease. Int J Cancer, 1993,55：359-363.
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3Sample J, Young L, Martin B, et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. J Virol, 1990, 64：4084-4092.
4Sandvaj K, Peh SC, Andersen BS, et al. Identification of potential hot spots in the carboxy-terminal part of the Epstein-Barr virus (EBV) BNLF-1 gene in both malignant and benign EBV-associated disease: high frequency of a 30 bp deletion in Malaysian and Danish peripheral T-cell lymphomas. Blood, 1994,84：4053-4060.
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5Zimber U, Adldinger H, Lenoir G, et al. Genograpgical prevalence of two types of Epstein-Barr virus. Virology, 1986,154：56-66.
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7Abdel-Hamid M, Chen JJ, Constantine N, et al. EBV strain variation: geographical distribution and relation to disease state. Virology, 1992,190：168-175.
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8Chen XY, Pepper S, Arrand JR. Prevalence of the A and B types of Epstein-Barr virus DNA in nasopharyngeal carcinoma biopsies from southern China. J General Virol, 1992,73：463-466.
9Khanim F, Yao QY, Niedobitek G, et al. Analysis of Epstein-Barr virus gene polymorphisms in normal donors and in virus-associatied tumors from different geographical locations. Blood, 1996,88：3491-3501.
(收稿：1997-09-11 修回：1998-03-12), 百拇医药