川崎病患儿冠状动脉病变的发生机理及其预防探讨
作者：王宏伟 程佩萱 陈绍军 鲁维伟
单位：430030，武汉，同济医科大学附属同济医院儿科
关键词：粘膜皮肤淋巴结综合征；丙种球蛋白类；冠状动脉疾病；受体；血小板源生长因子
中华儿科杂志980207.htm 【摘要】 目的 观察川崎病患儿冠状动脉病变的发生机理及丙种球蛋白对其防治作用。方法 应用细胞培养、免疫细胞化学染色、核酸杂交和流式细胞分析方法。结果 川崎病患儿血清能够强烈诱导人血管内皮细胞表达血小板源生长因子(PDGF)B链蛋白；经川崎病血清作用后的内皮细胞条件培养基(ECM)亦能显著促进血管平滑肌细胞表达PDGF受体mRNA，并强烈诱导平滑肌细胞增殖。丙种球蛋白则能显著抑制川崎病血清的上述诱导作用。结论 PDGF-PDGF受体途径激活参与了川崎病冠状动脉病变的形成；丙种球蛋白的防治作用与抑制PDGF-PDGF受体途径的激活有关。
, 百拇医药
Pathogenesis of coronary artery lesion in Kawasaki disease and its prevention Wang Hongwei, Cheng Peixuan, Chen Shaojun, et al. Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To investigate pathogenesis of coronary artery lesion in children with Kawasaki disease and to evaluate the preventive effectiveness of r-globulin on the lesion. Methods The methods of cell culture, immunocytochemistry,hybridization and flow cytometry were used in this study. Results Serum from patients with Kawasaki disease strongly induced the expression of PDGF B chain protein; the expression of PDGF receptor mRNA was significantly promoted; and the proliferation of vascular smooth muscle cell was induced by the endothelial call conditioned media. However, the above effects of the serum from cases of Kawasaki disease were markedly inhibited by r-globulin. Conclusion Activation of PDGF-PDGF receptor may play a role in the pathogenesis of coronary complication of kawasaki disease; the preventive effects of γ-globulin relate to the inhibition of activated PDGF-PDGF receptor.
, 百拇医药
【Key words】 Mucocutaneous lymph node sgndrom Gamma-globulins Coronary disease Receptors, platelet-derived growth factor
研究观察川崎病患儿血清对体外培养血管内皮细胞表达血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)B链蛋白的影响，以及川崎病血清作用后的内皮细胞条件培养基(endothelial cell conditioned media, ECM)对血管平滑肌细胞表达PDGF受体mRNA和平滑肌细胞增殖的影响，并观察丙种球蛋白对上述过程的作用。探讨川崎病冠状动脉病变发生机理和丙种球蛋白防治作用的机理。
对象和方法
一、主要试剂
PDGF-B链蛋白单克隆抗体由日本Mochida制药有限公司Sugihara博士惠赠。LSAB法免疫细胞化学试剂盒为Zymed公司生产。PDGF受体β亚型核酸探针(cDNA，4.7 kb)Oncogene公司生产。丙种球蛋白为成都生物制品研究所产品。
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二、方法
1.川崎病患儿血清制备：取3例住本院的川崎病急性期(发热10天内)患儿和3例本院门诊健康体检的正常儿童静脉血，每例4 ml，常规方法分离血清冻存。实验前将血清溶化，分组合并，微孔滤器除菌。
2.人脐静脉内皮细胞培养和实验分组：取本院妇产科产房健康产妇分娩后4小时内健康新生儿脐带行内皮细胞原代培养[1]。分三组：(1)正常血清组：M199+10%小牛血清+10%正常血清；(2)川崎病血清组，M199+10%小牛血清+10%川崎病患儿血清；(3)丙种球蛋白组，同川崎病血清组，另加入丙种球蛋白，终浓度为4 mg/ml。并按文献[2]方法制备ECM。
3.兔主动脉平滑肌细胞培养：按文献方法取4周龄日本大耳白兔主动脉中膜平滑肌细胞行原代和传代培养[2]。第4代平滑肌细胞生长达亚融合时弃去原培养基，分别加入上述各组的ECM，即分为三组：正常血清-ECM组，川崎病血清-ECM组和丙种球蛋白-ECM组。继续培养10小时后收集标本。
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4.免疫细胞化学染色：采用LSAB法，按试剂盒操作说明书进行。PDGF-B链蛋白单克隆抗体工作浓度为1∶500。用TJTV-300型图像分析仪测定PDGF-B链蛋白在各组中的表达强度。
5.Northern印迹杂交和狭缝杂交：按《分子克隆实验指南》介绍的方法提取各组平滑肌细胞的总RNA，随机引物法标记PDGF受体β亚型核酸探针，进行Northern印迹杂交和狭缝杂交[3]。狭缝杂交强度用图像分析仪处理。
6.流式细胞仪测定血管平滑肌细胞周期：采用EPICS-751型流式细胞仪，按文献介绍的方法测定各组平滑肌细胞的细胞周期构成，了解其增殖分化状况[4]。每组标本每次计数10 000个细胞，重复6次，以细胞周期中各细胞的多少计算结果。
三、统计学方法
各组数据以±s表示。组间比较采用t检验。
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图1 正常血清组，PDGF-B阳性表达信号呈棕黄色，位于核周胞浆。LSAB×250
图2 川崎病血清组，PDGF-B表达明显增强，弥漫于胞浆及胞核。LSAB×250
图3 丙种球蛋白组，PDGF-B表达强度与川崎病血清组比较明显减弱。LSAB×250
图4 血小板源生长因子受体β亚型在血管平源肌细胞中的表达 C-正常血清组，K-川崎病血清组，G-丙种球蛋白组 左图为Northern印迹杂交结果，右图为狭缝杂交结果结果
一、免疫细胞化学染色
与正常血清组比较，川崎病血清组PDGF-B链蛋白表达强度明显增加(P<0.01)；而丙种球蛋白组与川崎病血清组比较，PDGF-B链蛋白的表达强度则明显减弱(P<0.01)(表1，图1～3)。
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二、Northern印迹杂交和狭缝杂交
Northern杂交结果显示，各组平滑肌细胞均有PDGF受体β亚型mRNA的强烈表达，mRNA分子约为4.7kb。川崎病血清-ECM组与正常血清-ECM组比较，PDGF受体β亚型mRNA表达明显增强；丙种球蛋白-ECM组与川崎病血清ECM组比较，则明显减弱(图4)。狭缝杂交结果经图像分析显示，川崎病血清-ECM组PDGF受体mRNA的表达强度亦明显增强，为正常血清-ECM组的2.1倍；而丙种球蛋白-ECM组PDGF受体mRNA表达则被显著抑制，为川崎病血清-ECM组的53%。
三、流式细胞仪测定平滑肌细胞周期(表2)
川崎病血清-ECM组与正常血清-ECM组比较，DNA合成前期(G1)的细胞数明显减少(P<0.01)，DNA合成期(S)和DNA合成后期(G2)/有丝分裂期(M)的细胞数显著增多(P<0.01)。
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表2 流式细胞术测定各组VSMC的细胞周期构成(
±s，个，n=6)
组别
细胞数
G1
S
G2+M
正常血清-ECM组
10 000
7 032±151
2 361±106
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638±89
川崎病血清-ECM组
10 000
2 038±119**
6 310±166*
1 623±134*
丙种球蛋白+川崎病血清-ECM组
10 000
5 955±171* *
3 609±106**
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857±72**
*与正常血清-ECM组比较，G1 t=4.03，S t=3.91，G2+M t=3.87，P<0.01，**与川崎病血清-ECM组比较，G1 t=4.36，S t=3.83，G2+M t=3.93，P<0.01表1 各组脐静脉EC PDGF-B表达强度的平均吸光度A值(±s) 组别
细胞数
PDGF-B(A值)
正常血清组
30
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0.071±0.009
川崎病血清组
30
0.247±0.034*
丙种球蛋白+川崎病血清组
30
0.092±0.012* *
*与正常血清组比较，t=3.04，P<0.01，**与川崎病血清组比较，t=2.81，P<0.01讨论
一、PDGF及受体在川崎病血管损伤中的作用
近年发现，PDGF及其受体参与了一些自身免疫性疾病的病理过程[5]。本研究发现，急性期川崎病患儿的血清能够强烈诱导人脐静脉内皮细胞表达PDGF-B链蛋白；川崎病血清作用后的ECM亦能够显著促进兔动脉平滑肌细胞表达PDGF受体β亚型mRNA，并诱导平滑肌细胞由G1向S和G2+M转化，促进平滑肌细胞的分裂增殖。因此提示，川崎病病程中血管内皮损伤引起PDGF-PDGF受体途径激活，参与了受损血管壁平滑肌细胞增生和冠状动脉管腔狭窄形成的病理过程。
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二、丙种球蛋白对血管壁细胞表达PDGF及其受体的抑制作用
临床已证明，在川崎病早期，应用大剂量丙种球蛋白静脉注射，可有效防治冠状动脉并发症，但其机理仍不十分清楚。一些学者认为，是丙种球蛋白封闭了血液中单核细胞、血小板或血管内皮细胞表面的Fc受体，从而阻断了血管表面的免疫反应。本研究发现，丙种球蛋白可抑制川崎病血清所诱导的血管内皮细胞表达PDGF，抑制川崎病血清作用后的ECM所诱导的血管平滑肌细胞表达PDGF受体mRNA，并抑制平滑肌细胞的增殖活性。提示，丙种球蛋白防治川崎病冠状动脉并发症的药理作用，与抑制PDGF-PDGF受体途径的激活有关。
参考文献
1 阮秋蓉，邓仲端，徐增绶，等.培养的人脐静脉内皮细胞产生单核细胞趋化因子的研究.中华病理学杂志，1991，20：205-208.
2 邓仲端，邱红明，瞿智玲，等.巨噬细胞趋化因子致平滑肌细胞迁移.中华病理学杂志，1993，22：163-166.
, 百拇医药
3 分子克隆-实验指南.金冬雁，黎盂枫，译.第2版.北京：科学出版社，1995.362-371.
4 Gong J. Li X, Traganos F, et al. Expression of G1 and G2 cyclins measured in individual cells by multiparameter flow cytometry: a ew tool in the analysis of the cells cycle. Cell Prolif, 1994, 27:357-360.
5 Rubin K, Terracio L, Ronnstrand L, et al. Expression of platelet-derived growth factor receptors is induced on conective tissue cells during choronic synovial inflammation. Scand J Immunol, 1988, 27:285-289.
(收稿：1997-01-17 修回：1997-05-04), 百拇医药
单位：430030，武汉，同济医科大学附属同济医院儿科
关键词：粘膜皮肤淋巴结综合征；丙种球蛋白类；冠状动脉疾病；受体；血小板源生长因子
中华儿科杂志980207.htm 【摘要】 目的 观察川崎病患儿冠状动脉病变的发生机理及丙种球蛋白对其防治作用。方法 应用细胞培养、免疫细胞化学染色、核酸杂交和流式细胞分析方法。结果 川崎病患儿血清能够强烈诱导人血管内皮细胞表达血小板源生长因子(PDGF)B链蛋白；经川崎病血清作用后的内皮细胞条件培养基(ECM)亦能显著促进血管平滑肌细胞表达PDGF受体mRNA，并强烈诱导平滑肌细胞增殖。丙种球蛋白则能显著抑制川崎病血清的上述诱导作用。结论 PDGF-PDGF受体途径激活参与了川崎病冠状动脉病变的形成；丙种球蛋白的防治作用与抑制PDGF-PDGF受体途径的激活有关。
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Pathogenesis of coronary artery lesion in Kawasaki disease and its prevention Wang Hongwei, Cheng Peixuan, Chen Shaojun, et al. Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To investigate pathogenesis of coronary artery lesion in children with Kawasaki disease and to evaluate the preventive effectiveness of r-globulin on the lesion. Methods The methods of cell culture, immunocytochemistry,hybridization and flow cytometry were used in this study. Results Serum from patients with Kawasaki disease strongly induced the expression of PDGF B chain protein; the expression of PDGF receptor mRNA was significantly promoted; and the proliferation of vascular smooth muscle cell was induced by the endothelial call conditioned media. However, the above effects of the serum from cases of Kawasaki disease were markedly inhibited by r-globulin. Conclusion Activation of PDGF-PDGF receptor may play a role in the pathogenesis of coronary complication of kawasaki disease; the preventive effects of γ-globulin relate to the inhibition of activated PDGF-PDGF receptor.
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【Key words】 Mucocutaneous lymph node sgndrom Gamma-globulins Coronary disease Receptors, platelet-derived growth factor
研究观察川崎病患儿血清对体外培养血管内皮细胞表达血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)B链蛋白的影响，以及川崎病血清作用后的内皮细胞条件培养基(endothelial cell conditioned media, ECM)对血管平滑肌细胞表达PDGF受体mRNA和平滑肌细胞增殖的影响，并观察丙种球蛋白对上述过程的作用。探讨川崎病冠状动脉病变发生机理和丙种球蛋白防治作用的机理。
对象和方法
一、主要试剂
PDGF-B链蛋白单克隆抗体由日本Mochida制药有限公司Sugihara博士惠赠。LSAB法免疫细胞化学试剂盒为Zymed公司生产。PDGF受体β亚型核酸探针(cDNA，4.7 kb)Oncogene公司生产。丙种球蛋白为成都生物制品研究所产品。
, 百拇医药
二、方法
1.川崎病患儿血清制备：取3例住本院的川崎病急性期(发热10天内)患儿和3例本院门诊健康体检的正常儿童静脉血，每例4 ml，常规方法分离血清冻存。实验前将血清溶化，分组合并，微孔滤器除菌。
2.人脐静脉内皮细胞培养和实验分组：取本院妇产科产房健康产妇分娩后4小时内健康新生儿脐带行内皮细胞原代培养[1]。分三组：(1)正常血清组：M199+10%小牛血清+10%正常血清；(2)川崎病血清组，M199+10%小牛血清+10%川崎病患儿血清；(3)丙种球蛋白组，同川崎病血清组，另加入丙种球蛋白，终浓度为4 mg/ml。并按文献[2]方法制备ECM。
3.兔主动脉平滑肌细胞培养：按文献方法取4周龄日本大耳白兔主动脉中膜平滑肌细胞行原代和传代培养[2]。第4代平滑肌细胞生长达亚融合时弃去原培养基，分别加入上述各组的ECM，即分为三组：正常血清-ECM组，川崎病血清-ECM组和丙种球蛋白-ECM组。继续培养10小时后收集标本。
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4.免疫细胞化学染色：采用LSAB法，按试剂盒操作说明书进行。PDGF-B链蛋白单克隆抗体工作浓度为1∶500。用TJTV-300型图像分析仪测定PDGF-B链蛋白在各组中的表达强度。
5.Northern印迹杂交和狭缝杂交：按《分子克隆实验指南》介绍的方法提取各组平滑肌细胞的总RNA，随机引物法标记PDGF受体β亚型核酸探针，进行Northern印迹杂交和狭缝杂交[3]。狭缝杂交强度用图像分析仪处理。
6.流式细胞仪测定血管平滑肌细胞周期：采用EPICS-751型流式细胞仪，按文献介绍的方法测定各组平滑肌细胞的细胞周期构成，了解其增殖分化状况[4]。每组标本每次计数10 000个细胞，重复6次，以细胞周期中各细胞的多少计算结果。
三、统计学方法
各组数据以±s表示。组间比较采用t检验。
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图1 正常血清组，PDGF-B阳性表达信号呈棕黄色，位于核周胞浆。LSAB×250
图2 川崎病血清组，PDGF-B表达明显增强，弥漫于胞浆及胞核。LSAB×250
图3 丙种球蛋白组，PDGF-B表达强度与川崎病血清组比较明显减弱。LSAB×250
图4 血小板源生长因子受体β亚型在血管平源肌细胞中的表达 C-正常血清组，K-川崎病血清组，G-丙种球蛋白组 左图为Northern印迹杂交结果，右图为狭缝杂交结果结果
一、免疫细胞化学染色
与正常血清组比较，川崎病血清组PDGF-B链蛋白表达强度明显增加(P<0.01)；而丙种球蛋白组与川崎病血清组比较，PDGF-B链蛋白的表达强度则明显减弱(P<0.01)(表1，图1～3)。
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二、Northern印迹杂交和狭缝杂交
Northern杂交结果显示，各组平滑肌细胞均有PDGF受体β亚型mRNA的强烈表达，mRNA分子约为4.7kb。川崎病血清-ECM组与正常血清-ECM组比较，PDGF受体β亚型mRNA表达明显增强；丙种球蛋白-ECM组与川崎病血清ECM组比较，则明显减弱(图4)。狭缝杂交结果经图像分析显示，川崎病血清-ECM组PDGF受体mRNA的表达强度亦明显增强，为正常血清-ECM组的2.1倍；而丙种球蛋白-ECM组PDGF受体mRNA表达则被显著抑制，为川崎病血清-ECM组的53%。
三、流式细胞仪测定平滑肌细胞周期(表2)
川崎病血清-ECM组与正常血清-ECM组比较，DNA合成前期(G1)的细胞数明显减少(P<0.01)，DNA合成期(S)和DNA合成后期(G2)/有丝分裂期(M)的细胞数显著增多(P<0.01)。
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表2 流式细胞术测定各组VSMC的细胞周期构成(
±s，个，n=6)组别
细胞数
G1
S
G2+M
正常血清-ECM组
10 000
7 032±151
2 361±106
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638±89
川崎病血清-ECM组
10 000
2 038±119**
6 310±166*
1 623±134*
丙种球蛋白+川崎病血清-ECM组
10 000
5 955±171* *
3 609±106**
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857±72**
*与正常血清-ECM组比较，G1 t=4.03，S t=3.91，G2+M t=3.87，P<0.01，**与川崎病血清-ECM组比较，G1 t=4.36，S t=3.83，G2+M t=3.93，P<0.01表1 各组脐静脉EC PDGF-B表达强度的平均吸光度A值(
±s) 组别细胞数
PDGF-B(A值)
正常血清组
30
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0.071±0.009
川崎病血清组
30
0.247±0.034*
丙种球蛋白+川崎病血清组
30
0.092±0.012* *
*与正常血清组比较，t=3.04，P<0.01，**与川崎病血清组比较，t=2.81，P<0.01讨论
一、PDGF及受体在川崎病血管损伤中的作用
近年发现，PDGF及其受体参与了一些自身免疫性疾病的病理过程[5]。本研究发现，急性期川崎病患儿的血清能够强烈诱导人脐静脉内皮细胞表达PDGF-B链蛋白；川崎病血清作用后的ECM亦能够显著促进兔动脉平滑肌细胞表达PDGF受体β亚型mRNA，并诱导平滑肌细胞由G1向S和G2+M转化，促进平滑肌细胞的分裂增殖。因此提示，川崎病病程中血管内皮损伤引起PDGF-PDGF受体途径激活，参与了受损血管壁平滑肌细胞增生和冠状动脉管腔狭窄形成的病理过程。
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二、丙种球蛋白对血管壁细胞表达PDGF及其受体的抑制作用
临床已证明，在川崎病早期，应用大剂量丙种球蛋白静脉注射，可有效防治冠状动脉并发症，但其机理仍不十分清楚。一些学者认为，是丙种球蛋白封闭了血液中单核细胞、血小板或血管内皮细胞表面的Fc受体，从而阻断了血管表面的免疫反应。本研究发现，丙种球蛋白可抑制川崎病血清所诱导的血管内皮细胞表达PDGF，抑制川崎病血清作用后的ECM所诱导的血管平滑肌细胞表达PDGF受体mRNA，并抑制平滑肌细胞的增殖活性。提示，丙种球蛋白防治川崎病冠状动脉并发症的药理作用，与抑制PDGF-PDGF受体途径的激活有关。
参考文献
1 阮秋蓉，邓仲端，徐增绶，等.培养的人脐静脉内皮细胞产生单核细胞趋化因子的研究.中华病理学杂志，1991，20：205-208.
2 邓仲端，邱红明，瞿智玲，等.巨噬细胞趋化因子致平滑肌细胞迁移.中华病理学杂志，1993，22：163-166.
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3 分子克隆-实验指南.金冬雁，黎盂枫，译.第2版.北京：科学出版社，1995.362-371.
4 Gong J. Li X, Traganos F, et al. Expression of G1 and G2 cyclins measured in individual cells by multiparameter flow cytometry: a ew tool in the analysis of the cells cycle. Cell Prolif, 1994, 27:357-360.
5 Rubin K, Terracio L, Ronnstrand L, et al. Expression of platelet-derived growth factor receptors is induced on conective tissue cells during choronic synovial inflammation. Scand J Immunol, 1988, 27:285-289.
(收稿：1997-01-17 修回：1997-05-04), 百拇医药