培养内皮细胞的分化
作者：刘 欣
单位：(刘欣 石应康)华西医科大学 附属第一医院 胸心血管外科，成都 610041(祝彼得)四川省卫生干部管理学院
关键词：培养；内皮细胞；分化
生物医学工程学杂志990230
刘 欣 综述 石应康 祝彼得 审校
摘要 体内细胞与体外培养细胞差异的关键在于细胞分化，内皮细胞的分化是检测内皮细胞差异的核心问题。内皮细胞在体内分布广泛，其分化表现出极大的异质性，体外培养血管内皮细胞的分化也表现出极大的差异。本文介绍了内皮细胞的胚胎起源、内皮细胞的异质性及影响内皮细胞分化的因素等方面的研究进展，揭示内皮细胞分化的分子机理，将使人们可驾驭其分化，按人们要求使内皮细胞发生特定的分化。
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Differentiation of Cultural Endothelial Cells
Liu Xin Shi Yingkang Zhu Bide
Department of Cardiothoracic Surgery, The First University Hospital, West China University of
Medical Sciences, Chengdu 610041
Abstract The disparity of function and ultrastructural characteristics between cells in vivo and cultural cells in vitro has been attributed to the differentiation of cells, so differentiation is the key to detecting the differences between endothelial cells (ECs). The ECs are widely distributed over the entire inner surface of blood vessels in the body and exhibit noticeable heterogeneity. The cultural ECs also show heterogeneity. This is a literature review focusing on the recent advance in researches on the embryonic origin of ECs, the heterogeneity of ECs and the factors that influence differentiation of ECs. Also described is the prospect of studies aimed at elucidating the molecular mechanisms involved in the differentiation of ECs. It is hoped that future studies will enhance the realization of oriented differentiation of ECs.
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Key words Culture Endothelial cells Differentiation
血管内皮细胞(ECs)位于整个循环系统的内表面，它不仅是血管的被动衬里，而且在调节血液流动性、血管张力及通透性，参与正常和新生组织的血管形成，在病理或生理条件下血细胞的激活及迁移等方面均发挥重要作用。1963年Maruyama首先建立体外培养ECs方法，为研究ECs的功能特性及相关疾病做出了重大努力，近年有关ECs的研究愈加广泛与深入，并成为多门学科研究的热点。ECs体外培养与体内环境毕竟存在巨大差异，但其增殖方式是相同的，均赖于有丝分裂。体内外细胞的差异关键在于细胞的分化，因而ECs的分化是检测ECs差异的核心问题。ECs在体内分布广泛，其分化表现出极大的异质性，体外培养ECs的分化也有极大的差异。本文简扼综述培养ECs分化的有关方面进展。
1 培养细胞的分化改变
当前人工模拟体内环境技术已逐步完善，细胞生活在人工培养条件下不仅能很好的生存、生长和增殖，在一定程度上已能使培养细胞的分化按人们的意志发展。但人工模拟条件与体内实际情况仍不完全相同，细胞置于体外培养后，一旦失去神经体液的影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化是必然的。培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现“返祖”现象，表现为细胞趋单一性或具恶性性状[1]。细胞分化机制的复杂性是在细胞与细胞，细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，由众多基因参与，经多阶段和多环节完成的动态演变过程。失掉上述体内关系时细胞分化可发生改变：(1)不适应性，即由于环境的改变而出现的变化，体外培养时间越长，分化改变越大。(2)去分化性，即细胞失掉发生分化的能力，总的来说体外培养细胞随细胞来源种属和遗传性状的不同，很多细胞呈现着一定程度的分化表达现象，与体内条件越近时，细胞愈易发生分化，离体培养时间越长分化能力越差。培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。细胞产生某一特定蛋白质的表达过程可视为分化表达现象。
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2 血管ECs的胚胎起源
研究ECs的胚胎来源及其分化对研究ECs体外的分化很有帮助。ECs的前体细胞叫成血管细胞，它是具有潜在分化为ECs但无ECs特征，未形成管腔的一种细胞类型。胚体内外血管的形成有较大差异，在卵黄囊，ECs与血岛中的造血干细胞分化发生一致，周围细胞形成血管ECs，中央造血干细胞形成原始血细胞游离于腔内。在主动脉，ECs来源于胚内中胚层单独分化的成血管细胞，无造血干细胞的一致分化。决定造血干细胞在血岛与ECs一致分化而在主动脉分化受抑的机制仍不清楚。在原始血管系统开始循环后，原始的毛细血管丛经多次重塑形成具不同直径和功能的成熟血管系统，在同一毛细血管血流方向可多次改变。ECs在胚胎及生后发育期均增殖迅速，成熟后停止或增殖很低[2]。这些过程的分子机理仍知之甚少，近年的研究取得了一定进展，血管ECs生长因子受体-2(VEGFR-2即Flk-1)是已知最早表达在分化为成血管细胞的中胚层细胞，后来胚胎发育过程中固定于ECs，与其配体VEGF功能一致，均作为ECs生长和血管通透性的调节因子。VEGF在内胚层表达，因内胚层与中胚层相邻近，内胚层分泌的VEGF，起旁分泌作用，可能促进中胚层细胞表达VEGFR-2成为成血管细胞，如内胚层缺乏，中胚层将无ECs形成，因此一定浓度的VEGF是VEGFR-2持续表达的必要条件，缺乏将导致细胞受体的下调，并影响其分化[3]。Vittet等利用胚胎干细胞建立体外模型可用于研究血管形成及ECs分化的分子机理。利用该模型研究提示ECs在不同的分化阶段表达不同的抗原，如Flk-1在干细胞分化3 d后首先表达，其后血小板ECs粘附分子(PECAM)、tie-2表达，5 d时表达VE-Cadherin和tie-1[4]。在人生长发育过程中，只有少数胚胎期的血管保留下来，多数的原始血管丛均退变，如软骨区毛细血管退变以利软骨分化；伤口毛细血管在伤口愈合后也发生退变，有证据表明ECs在这些过程中死亡，其分子机理仍不清楚[2]。近来研究提示蛋白酪氨酸磷酸化酶积极参与ECs凋亡信号的转导及可能通过调节P21的表达，而抑制ECs的分化。胚胎发育期无血流的毛细血管优先退化，可见血流也是决定因素之一。其退变可能是某种因子的缺失、内在的细胞基因阻断或遗传的程度化过程，退变涉及程度化ECs死亡(即ECs凋亡)，是ECs分化的一个程序化过程[5]。
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3 ECs的异质性
血管ECs的异质性指血管ECs之间的结构、功能、抗原成分和代谢特征等均不相同，不同器官、相同器官的不同部位，甚至在同一个微血管襻的不同节段之间的ECs都可表现出异质性[6]。ECs的异质性反映了ECs分化的差异。
3.1 结构与形态的异质性
人体的微血管ECs至少有三种类型：(1)窦状ECs分布于肝、脾、骨髓；(2)有孔ECs分布于肾脏、内分泌腺以及胃肠粘膜；(3)连续ECs分布于横纹肌、心肌、平滑肌；另外特化的ECs分布于脑、视网膜，ECs间有连续的紧密连接，并有桥粒加强，是血脑屏障、血视网膜屏障的组成部分。即使采用相同的分离技术在相同条件下培养，得到的ECs也可能有一定差异。Pupnick等将大鼠脑微血管ECs在相同条件下培养，结果出现四种不同类型的ECs：(1)弯曲和细长的；(2)铺路石样的；(3)弯曲和轻度放射状的；(4)十分开展的。这四种ECs生长融合后的表型也不同，它们之间的血栓素B2(TXB2)生长、血管紧张素转化酶(ACE)活性、胶原合成和细胞融合的密度均不同。该作者认为这些差别的原因可能是这些ECs来源不同。
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3.2 功能和代谢的异质性
ECs不同的形态结构也就决定了它不同的生理功能和代谢特征。Jaffe指出ECs可以合成和分泌许多类型的胶原，但不同来源的ECs差别很大。培养的人脐静脉ECs分泌Ⅳ型胶原；牛主动脉、肺动脉和肠系膜静脉ECs分泌Ⅲ型胶原；牛的肾上腺微血管ECs分泌Ⅰ、Ⅱ型胶原。目前尚不清楚这些差别究竟因为培养ECs的种属不同或同一品系受试ECs的取材部位不同[7]。Johnson等证实培养人动脉ECs比静脉ECs产生前列环素(PGI2)的能力强，产生ACE的活性前者是后者的5倍，大量的文献证实血管ECs释放花生四烯酸衍生物受培养条件的影响，其释放PGI2在ECs指数生长期最大，生长融合后减少。随加入培养基中的血清成分及所占比例的不同，将影响培养ECs合成PGI2及其它的花生四烯酸衍生物[6]。Dichek等[9]观察到同种ECs的传代次数不同时，其基因表达能力亦有差异。他们对传1代(P1)和传21代(P21)的脐静脉ECs进行northern分析后发现，P21的t-PA、PAI-1、尿激酶和血凝调节素的 mRNA水平高于P1；但P1的thromobospondin、血管性假血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和蛋白S的mRNA水平高于P21。因而认为传代次数和培养时间是导致这些基因表达出现差异的重要因素。
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3.3 抗原和表面分子分布的异质性
ECs抗原表达及各种表面分子表达的不同反映了其分化的差异及功能的不同[10]。激活的细胞因子诱导的ECs及其表达的各种表面分子在各病理状态均起重要作用，包括感染、肿瘤血管形成、伤口愈合。vWF抗原是ECs的标志性抗原，但不同来源的ECs的vWF抗原并不相同。如高ECs没有vWF抗原抗血清染色，但淋巴结门动脉和门静脉管腔表面的vWF抗原呈阳性着色。这一特性与小动脉、微血管和小静脉对vWF抗原的反应一致。不同部位血管ECs凝血酶受体分布及对凝血酶的反应也不一致，在人脐静脉ECs有3300个结合部位/细胞，而在兔主动脉ECs报告有5.8×105个结合部位/细胞，报告在牛ECs凝血酶结合部位与培养细胞的密度呈负相关[6]。Morello等发现培养微血管来源的ECs转移生长因子-β(TGF-β)受体Ⅲ型具有高水平的表达，而大血管来源的ECs没有表达。Augustin对ECs表达的不同表面分子作为干预性治疗的目标进行了可行性讨论[11]。所有这些不同特点反映了ECs重要的分化途径，在特定的器官或组织环境形成特定的分化。ECs与器官或组织环境相互作用导致特异的ECs表型，但并不清楚某器官来源的ECs分化为其器官特异的表型前是否已确定其分化，如已确定，在适当的的条件下能否改变其分化。
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ECs器官特异的分化是可逆的，如有孔ECs或特化的ECs在侵入不同的器官或肿瘤即失去其特征，在许多培养的ECs也可观察到，如有孔ECs、脑血管ECs高电阻抗及高ECs的形态特征均丢失。目前在分子水平未能较好解释ECs的异质性[11]。常用方法是用单克隆抗体抗某器官特异的ECs以产生标记物或分析其特异的功能，但至今仍未成功。其中一些标记物曾被描述，但均缺乏特异性[10，12，13]。在给器官特异的ECs标记物下定义时，主要的问题可能是因为体外分析的ECs制备不纯，体外培养的ECs缺乏器官特异的标记物。近来建立的方法有1)游离更多的取材ECs并含有其表面蛋白质；2)通过在器官来源的细胞外成分上培养游离的ECs或与来源器官的细胞共同培养再诱导或保持其器官特异的特征，可能有助于获得更适合于免疫及特征性研究的材料[10]。ECs显示出异质性并非其唯一特点，这些不同的特征是否是固定的，能否通过改变其环境而影响ECs的分化?许多研究提示ECs可以接受新的特征，在活体内的研究提示局部肌注或皮内注射VEGF可增加微血管的通透性及ECs的有孔性，使其静脉及毛细血管ECs分化为有孔型ECs，正常情况下这些器官的ECs是无孔ECs，因此VEGF的独特作用有助于揭示有孔ECs分化的分子机理。ECs显示一定范围的超微结构及生化特征，从目前资料提示，这些特征并非终末分化的结果，而是ECs对周围环境信号的反应，ECs显然可根据这些信号的质和量(如激素，神经介质，细胞外基质，营养物质，氧气供应，代谢产物)的改变而调整其活性(或分化)。
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4 影响ECs分化的因素
探讨ECs分化的影响因素即研究ECs内在、外在因素和基因之间的调节体系。本文主要讨论遗传因素、ECs生长的支持物及血流动力学的影响。
4.1 遗传因素
在ECs分化过程中细胞核内基因组的选择性表达是ECs分化的基础。大量研究表明细胞分化的基因表达调节主要发生在转录水平上，即是否出现某种性状取决于是否存在相关的mRNA，取材不同的培养ECs表现出不同的形态特征、功能差异及各种因子表达，这反映了其遗传学上的差异。体外培养成熟组织的ECs发生退变现象而在胚胎组织的ECs却保持其旺盛的增殖。来源于胚胎的脑组织可诱导来源于体节或绒毛膜尿囊膜的ECs形成血脑屏障的特征，可见成年组织的ECs至少部分失去了其可能的多种发育途径(或可逆性)难以形成不同器官特异的ECs，实验表明个体愈老，体外培养ECs分裂次数及可传代次数就愈少。癌基因也被用于ECs分化的研究，Wagner发现在大鼠ECs表达多瘤T(PymT)癌基因将导致其迅速转化并形成血管瘤，这些内皮细胞性肿瘤可建立内皮瘤细胞系，PymT癌基因对ECs生长的作用主要通过激活酪氨酸激酶介导的途径。胚胎性ECs比成年性ECs更易受PymT癌基因的转化，然而成年性与胚胎性ECs相区别的分子基础仍不清楚[14]，近年来分析ECs特异的微小启动子揭示了早期与晚期胚胎性ECs基因调节的区别。类似的研究将有助于分析涉及ECs分化的信号传递通路的分子基础。Ronicke提出在鼠胚胎发育过程中，Flk-1基因显示其阻止完全的ECs分化的功能[15]。ECs是作为基因治疗理想的载体，遗传修饰的ECs也是通过DNA重组技术改变ECs的基因组，以产生分化途径的改变或表达特定的蛋白质，产生治疗疾病的作用[16]。揭示ECs分化的分子机理将使人们可驾驭其分化，按人们的要求使ECs发生特定的分化。
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4.2 ECs生长的支持物
ECs生长的支持物对其分化影响较大，随着生物材料的发展，在生物材料上种植ECs，使之ECs化成为活化的生物材料已成为一种趋势，许多学者对此进行了研究，采用在细胞外基质成分的一种或几种粘附基质预铺的表面上培养ECs，观察其分化改变[17]。ECs与细胞外基质的相互作用决定了细胞的生长状态，人微血管ECs在分化的生长状态对细胞外基质环境反应性最高[18]。现已证实纤维粘连蛋白、层粘连蛋白(Laminin)、玻璃体连接蛋白(vintronectin)、胶原等可促进ECs的粘附，但胶原并不促进ECs的生长[19]。不同的基质蛋白通过特异的受体诱导其表达不同的基因，粘附分子如Integrin, Selectin及Cadherin家族(主要由Integrin)介导ECs与不同粘附基质的结合，转导特定信号，使ECs发生相应反应。ECs表面表达的粘附分子并不是不变的，随粘附基质的不同其表面表达的粘附分子也有所不同。纤维粘连蛋白，层粘连蛋白，玻璃体连接蛋白均含有三氨基酸序列即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸顺序(RGD)，是粘附蛋白与细胞结合的活性部分之一。Holland等[19]证实采用含有RGD的合成肽链覆盖的表面与纤维粘连蛋白覆盖的比较，有助于粘附、扩展和生长的特点相似，而前者使粘附、扩展更快，生长更迅速。层粘连蛋白对ECs有较强的促进粘附、生长分化及迁移的作用。在重建的细胞外基质上培养ECs可较快分化形成毛细血管样的结构，而层粘连蛋白是诱导产生这种改变的主要因子。现已鉴定出至少三种有生物活性的肽链顺序参与层粘连蛋白介导的作用，包括-RGD-介导的ECs粘附，-YIGSR-为层粘连蛋白多种行为的激活部位，介导ECs的形态改变，-SIKVAV-参与激活或促进几种生物活动过程，主要在ECs的分化中起重要作用[20]。Milici等报告在塑料板上培养牛肾上腺毛细血管ECs仅偶可见有隔膜的有孔型ECs，且无跨ECs的通道。当这些细胞培养在MDCK细胞(一种犬肾上皮细胞系)的细胞外基质上时则形成许多有隔膜的有孔型ECs，并有跨ECs的通道。ECs培养在重建的细胞外基质上可较迅速的分化。重建细胞外基质的方法很多[21，22]，其中较有代表性的是采用Matrigel，一种从Englebreth-HolmSwarm肿瘤制备的基质，所含成分与基质膜成分相似。Matrigel可诱导多种细胞的分化，如骨细胞分化出现骨小管，乳腺癌细胞分化形成腺样结构，人脐静脉ECs或微血管ECs种植在其上18 h后即可形成毛细血管样的结构，而正常从激活的生长细胞分化形成管样结构需2 d～8周时间，其过程模拟了ECs的排列，ECs与ECs的粘附，管腔的形成，基底面分泌基底膜的成份。ECs粘附于Matrigel导致了细胞骨架的重排并合成其分化表型细胞所需的特种蛋白质，因此ECs培养在Matrigel提供了很有用且迅速的体外研究ECs分化及血管形成的模型。
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4.3 血流动力学对培养ECs分化的影响
血管ECs在体内不断地受到脉动血流的剪切力作用，对于不同血管，ECs受到不同类型，不同强度的力学作用。这种血流动力学环境对ECs生物学特性和正常功能至关重要，静态培养的ECs多为三角形，无明显定位效应。而在高剪切力作用下，ECs变为鹅卵石形，而且它们与流动方向一致的长轴也被拉长。研究发现不仅ECs粘附功能，其屏障、抗血栓形成、止血、物质转运、血管张力调节均受血流剪切力的影响[23]。近来的研究显示缺乏血流动力学的作用将诱导血管ECs的凋亡[5]。Dimmder等证实血流剪切力可完全阻断因撤出培养人脐静脉ECs中的生长因子或与肿瘤坏死因子α共同孵育而导致的ECs凋亡，剪切力干扰ECs死亡的信号传递涉及Cpp32样的蛋白酶家族并通过抑制ECs的凋亡，保持ECs的完整性[24]。已证实ECs根据所处力学环境具有很强的定向性及适应性，且这种适应性的取向过程具有力的大小和作用时间的依赖性，剪切力作用于ECs通过ECs的细胞骨架将应力在整个细胞内传递，同时力学信号可以改变ECs中信号分子的行为，使力的信息以级联生物化学反应的方式在细胞内传播。已有研究表明：参与力学信号转导过程中存在膜上力学敏感的离子通道变化及G蛋白耦连的信号途径。在基因水平，切应力作用对很多基因产物生成有影响，提示力学信号传入核内，调节相关基因的表达，这些基因产物可再作为反式作用因子，对其它基因的转录起调控作用[25]。因此液流对ECs的分化具有重要影响，可以促进其分化表达相关抗原，维持正常的生理功能，随流动状态的改变其分化发生适应性改变，出现某种因子的过度表达，可形成病理基础或造成ECs的损伤，其机理正是近年来研究的热点问题，现已积累了大量资料，但对许多根本机制尚无法给出肯定回答。目前培养均在静态下，其分化必然与生理状态的分化有较大差异，因此目前研究应致力于建立一个既能分解各种作用方式，又能反映生理、病理条件的流动培养模型，为ECs的分化研究提供合理的环境。
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5 小 结
综上所述，培养ECs在研究ECs相关的疾病及机制方面做出了巨大贡献，但培养ECs因脱离了体内环境，其分化发生较大的改变，人们应正确地分析基于培养ECs得出的结论。ECs具有较大的异质性，其不同特点反映了ECs重要的分化途径，ECs分化的特征可根据外界环境的信号(生长因子、激素、神经介质、支持物、流动剪切力)的改变而调整，ECs的取材(遗传因素)也具有决定性影响。通过建立能更好模拟ECs体内生存环境的培养模型，诱导ECs的分化，揭示ECs分化的分子机理，为人们达到使ECs定向分化的目的迈出关键的一步。
注释：国家自然科学基金资助项目(39670221)
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收稿：1998-01-10, http://www.100md.com
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1 培养细胞的分化改变
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2 血管ECs的胚胎起源
研究ECs的胚胎来源及其分化对研究ECs体外的分化很有帮助。ECs的前体细胞叫成血管细胞，它是具有潜在分化为ECs但无ECs特征，未形成管腔的一种细胞类型。胚体内外血管的形成有较大差异，在卵黄囊，ECs与血岛中的造血干细胞分化发生一致，周围细胞形成血管ECs，中央造血干细胞形成原始血细胞游离于腔内。在主动脉，ECs来源于胚内中胚层单独分化的成血管细胞，无造血干细胞的一致分化。决定造血干细胞在血岛与ECs一致分化而在主动脉分化受抑的机制仍不清楚。在原始血管系统开始循环后，原始的毛细血管丛经多次重塑形成具不同直径和功能的成熟血管系统，在同一毛细血管血流方向可多次改变。ECs在胚胎及生后发育期均增殖迅速，成熟后停止或增殖很低[2]。这些过程的分子机理仍知之甚少，近年的研究取得了一定进展，血管ECs生长因子受体-2(VEGFR-2即Flk-1)是已知最早表达在分化为成血管细胞的中胚层细胞，后来胚胎发育过程中固定于ECs，与其配体VEGF功能一致，均作为ECs生长和血管通透性的调节因子。VEGF在内胚层表达，因内胚层与中胚层相邻近，内胚层分泌的VEGF，起旁分泌作用，可能促进中胚层细胞表达VEGFR-2成为成血管细胞，如内胚层缺乏，中胚层将无ECs形成，因此一定浓度的VEGF是VEGFR-2持续表达的必要条件，缺乏将导致细胞受体的下调，并影响其分化[3]。Vittet等利用胚胎干细胞建立体外模型可用于研究血管形成及ECs分化的分子机理。利用该模型研究提示ECs在不同的分化阶段表达不同的抗原，如Flk-1在干细胞分化3 d后首先表达，其后血小板ECs粘附分子(PECAM)、tie-2表达，5 d时表达VE-Cadherin和tie-1[4]。在人生长发育过程中，只有少数胚胎期的血管保留下来，多数的原始血管丛均退变，如软骨区毛细血管退变以利软骨分化；伤口毛细血管在伤口愈合后也发生退变，有证据表明ECs在这些过程中死亡，其分子机理仍不清楚[2]。近来研究提示蛋白酪氨酸磷酸化酶积极参与ECs凋亡信号的转导及可能通过调节P21的表达，而抑制ECs的分化。胚胎发育期无血流的毛细血管优先退化，可见血流也是决定因素之一。其退变可能是某种因子的缺失、内在的细胞基因阻断或遗传的程度化过程，退变涉及程度化ECs死亡(即ECs凋亡)，是ECs分化的一个程序化过程[5]。
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3 ECs的异质性
血管ECs的异质性指血管ECs之间的结构、功能、抗原成分和代谢特征等均不相同，不同器官、相同器官的不同部位，甚至在同一个微血管襻的不同节段之间的ECs都可表现出异质性[6]。ECs的异质性反映了ECs分化的差异。
3.1 结构与形态的异质性
人体的微血管ECs至少有三种类型：(1)窦状ECs分布于肝、脾、骨髓；(2)有孔ECs分布于肾脏、内分泌腺以及胃肠粘膜；(3)连续ECs分布于横纹肌、心肌、平滑肌；另外特化的ECs分布于脑、视网膜，ECs间有连续的紧密连接，并有桥粒加强，是血脑屏障、血视网膜屏障的组成部分。即使采用相同的分离技术在相同条件下培养，得到的ECs也可能有一定差异。Pupnick等将大鼠脑微血管ECs在相同条件下培养，结果出现四种不同类型的ECs：(1)弯曲和细长的；(2)铺路石样的；(3)弯曲和轻度放射状的；(4)十分开展的。这四种ECs生长融合后的表型也不同，它们之间的血栓素B2(TXB2)生长、血管紧张素转化酶(ACE)活性、胶原合成和细胞融合的密度均不同。该作者认为这些差别的原因可能是这些ECs来源不同。
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3.2 功能和代谢的异质性
ECs不同的形态结构也就决定了它不同的生理功能和代谢特征。Jaffe指出ECs可以合成和分泌许多类型的胶原，但不同来源的ECs差别很大。培养的人脐静脉ECs分泌Ⅳ型胶原；牛主动脉、肺动脉和肠系膜静脉ECs分泌Ⅲ型胶原；牛的肾上腺微血管ECs分泌Ⅰ、Ⅱ型胶原。目前尚不清楚这些差别究竟因为培养ECs的种属不同或同一品系受试ECs的取材部位不同[7]。Johnson等证实培养人动脉ECs比静脉ECs产生前列环素(PGI2)的能力强，产生ACE的活性前者是后者的5倍，大量的文献证实血管ECs释放花生四烯酸衍生物受培养条件的影响，其释放PGI2在ECs指数生长期最大，生长融合后减少。随加入培养基中的血清成分及所占比例的不同，将影响培养ECs合成PGI2及其它的花生四烯酸衍生物[6]。Dichek等[9]观察到同种ECs的传代次数不同时，其基因表达能力亦有差异。他们对传1代(P1)和传21代(P21)的脐静脉ECs进行northern分析后发现，P21的t-PA、PAI-1、尿激酶和血凝调节素的 mRNA水平高于P1；但P1的thromobospondin、血管性假血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和蛋白S的mRNA水平高于P21。因而认为传代次数和培养时间是导致这些基因表达出现差异的重要因素。
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3.3 抗原和表面分子分布的异质性
ECs抗原表达及各种表面分子表达的不同反映了其分化的差异及功能的不同[10]。激活的细胞因子诱导的ECs及其表达的各种表面分子在各病理状态均起重要作用，包括感染、肿瘤血管形成、伤口愈合。vWF抗原是ECs的标志性抗原，但不同来源的ECs的vWF抗原并不相同。如高ECs没有vWF抗原抗血清染色，但淋巴结门动脉和门静脉管腔表面的vWF抗原呈阳性着色。这一特性与小动脉、微血管和小静脉对vWF抗原的反应一致。不同部位血管ECs凝血酶受体分布及对凝血酶的反应也不一致，在人脐静脉ECs有3300个结合部位/细胞，而在兔主动脉ECs报告有5.8×105个结合部位/细胞，报告在牛ECs凝血酶结合部位与培养细胞的密度呈负相关[6]。Morello等发现培养微血管来源的ECs转移生长因子-β(TGF-β)受体Ⅲ型具有高水平的表达，而大血管来源的ECs没有表达。Augustin对ECs表达的不同表面分子作为干预性治疗的目标进行了可行性讨论[11]。所有这些不同特点反映了ECs重要的分化途径，在特定的器官或组织环境形成特定的分化。ECs与器官或组织环境相互作用导致特异的ECs表型，但并不清楚某器官来源的ECs分化为其器官特异的表型前是否已确定其分化，如已确定，在适当的的条件下能否改变其分化。
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ECs器官特异的分化是可逆的，如有孔ECs或特化的ECs在侵入不同的器官或肿瘤即失去其特征，在许多培养的ECs也可观察到，如有孔ECs、脑血管ECs高电阻抗及高ECs的形态特征均丢失。目前在分子水平未能较好解释ECs的异质性[11]。常用方法是用单克隆抗体抗某器官特异的ECs以产生标记物或分析其特异的功能，但至今仍未成功。其中一些标记物曾被描述，但均缺乏特异性[10，12，13]。在给器官特异的ECs标记物下定义时，主要的问题可能是因为体外分析的ECs制备不纯，体外培养的ECs缺乏器官特异的标记物。近来建立的方法有1)游离更多的取材ECs并含有其表面蛋白质；2)通过在器官来源的细胞外成分上培养游离的ECs或与来源器官的细胞共同培养再诱导或保持其器官特异的特征，可能有助于获得更适合于免疫及特征性研究的材料[10]。ECs显示出异质性并非其唯一特点，这些不同的特征是否是固定的，能否通过改变其环境而影响ECs的分化?许多研究提示ECs可以接受新的特征，在活体内的研究提示局部肌注或皮内注射VEGF可增加微血管的通透性及ECs的有孔性，使其静脉及毛细血管ECs分化为有孔型ECs，正常情况下这些器官的ECs是无孔ECs，因此VEGF的独特作用有助于揭示有孔ECs分化的分子机理。ECs显示一定范围的超微结构及生化特征，从目前资料提示，这些特征并非终末分化的结果，而是ECs对周围环境信号的反应，ECs显然可根据这些信号的质和量(如激素，神经介质，细胞外基质，营养物质，氧气供应，代谢产物)的改变而调整其活性(或分化)。
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4 影响ECs分化的因素
探讨ECs分化的影响因素即研究ECs内在、外在因素和基因之间的调节体系。本文主要讨论遗传因素、ECs生长的支持物及血流动力学的影响。
4.1 遗传因素
在ECs分化过程中细胞核内基因组的选择性表达是ECs分化的基础。大量研究表明细胞分化的基因表达调节主要发生在转录水平上，即是否出现某种性状取决于是否存在相关的mRNA，取材不同的培养ECs表现出不同的形态特征、功能差异及各种因子表达，这反映了其遗传学上的差异。体外培养成熟组织的ECs发生退变现象而在胚胎组织的ECs却保持其旺盛的增殖。来源于胚胎的脑组织可诱导来源于体节或绒毛膜尿囊膜的ECs形成血脑屏障的特征，可见成年组织的ECs至少部分失去了其可能的多种发育途径(或可逆性)难以形成不同器官特异的ECs，实验表明个体愈老，体外培养ECs分裂次数及可传代次数就愈少。癌基因也被用于ECs分化的研究，Wagner发现在大鼠ECs表达多瘤T(PymT)癌基因将导致其迅速转化并形成血管瘤，这些内皮细胞性肿瘤可建立内皮瘤细胞系，PymT癌基因对ECs生长的作用主要通过激活酪氨酸激酶介导的途径。胚胎性ECs比成年性ECs更易受PymT癌基因的转化，然而成年性与胚胎性ECs相区别的分子基础仍不清楚[14]，近年来分析ECs特异的微小启动子揭示了早期与晚期胚胎性ECs基因调节的区别。类似的研究将有助于分析涉及ECs分化的信号传递通路的分子基础。Ronicke提出在鼠胚胎发育过程中，Flk-1基因显示其阻止完全的ECs分化的功能[15]。ECs是作为基因治疗理想的载体，遗传修饰的ECs也是通过DNA重组技术改变ECs的基因组，以产生分化途径的改变或表达特定的蛋白质，产生治疗疾病的作用[16]。揭示ECs分化的分子机理将使人们可驾驭其分化，按人们的要求使ECs发生特定的分化。
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4.2 ECs生长的支持物
ECs生长的支持物对其分化影响较大，随着生物材料的发展，在生物材料上种植ECs，使之ECs化成为活化的生物材料已成为一种趋势，许多学者对此进行了研究，采用在细胞外基质成分的一种或几种粘附基质预铺的表面上培养ECs，观察其分化改变[17]。ECs与细胞外基质的相互作用决定了细胞的生长状态，人微血管ECs在分化的生长状态对细胞外基质环境反应性最高[18]。现已证实纤维粘连蛋白、层粘连蛋白(Laminin)、玻璃体连接蛋白(vintronectin)、胶原等可促进ECs的粘附，但胶原并不促进ECs的生长[19]。不同的基质蛋白通过特异的受体诱导其表达不同的基因，粘附分子如Integrin, Selectin及Cadherin家族(主要由Integrin)介导ECs与不同粘附基质的结合，转导特定信号，使ECs发生相应反应。ECs表面表达的粘附分子并不是不变的，随粘附基质的不同其表面表达的粘附分子也有所不同。纤维粘连蛋白，层粘连蛋白，玻璃体连接蛋白均含有三氨基酸序列即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸顺序(RGD)，是粘附蛋白与细胞结合的活性部分之一。Holland等[19]证实采用含有RGD的合成肽链覆盖的表面与纤维粘连蛋白覆盖的比较，有助于粘附、扩展和生长的特点相似，而前者使粘附、扩展更快，生长更迅速。层粘连蛋白对ECs有较强的促进粘附、生长分化及迁移的作用。在重建的细胞外基质上培养ECs可较快分化形成毛细血管样的结构，而层粘连蛋白是诱导产生这种改变的主要因子。现已鉴定出至少三种有生物活性的肽链顺序参与层粘连蛋白介导的作用，包括-RGD-介导的ECs粘附，-YIGSR-为层粘连蛋白多种行为的激活部位，介导ECs的形态改变，-SIKVAV-参与激活或促进几种生物活动过程，主要在ECs的分化中起重要作用[20]。Milici等报告在塑料板上培养牛肾上腺毛细血管ECs仅偶可见有隔膜的有孔型ECs，且无跨ECs的通道。当这些细胞培养在MDCK细胞(一种犬肾上皮细胞系)的细胞外基质上时则形成许多有隔膜的有孔型ECs，并有跨ECs的通道。ECs培养在重建的细胞外基质上可较迅速的分化。重建细胞外基质的方法很多[21，22]，其中较有代表性的是采用Matrigel，一种从Englebreth-HolmSwarm肿瘤制备的基质，所含成分与基质膜成分相似。Matrigel可诱导多种细胞的分化，如骨细胞分化出现骨小管，乳腺癌细胞分化形成腺样结构，人脐静脉ECs或微血管ECs种植在其上18 h后即可形成毛细血管样的结构，而正常从激活的生长细胞分化形成管样结构需2 d～8周时间，其过程模拟了ECs的排列，ECs与ECs的粘附，管腔的形成，基底面分泌基底膜的成份。ECs粘附于Matrigel导致了细胞骨架的重排并合成其分化表型细胞所需的特种蛋白质，因此ECs培养在Matrigel提供了很有用且迅速的体外研究ECs分化及血管形成的模型。
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4.3 血流动力学对培养ECs分化的影响
血管ECs在体内不断地受到脉动血流的剪切力作用，对于不同血管，ECs受到不同类型，不同强度的力学作用。这种血流动力学环境对ECs生物学特性和正常功能至关重要，静态培养的ECs多为三角形，无明显定位效应。而在高剪切力作用下，ECs变为鹅卵石形，而且它们与流动方向一致的长轴也被拉长。研究发现不仅ECs粘附功能，其屏障、抗血栓形成、止血、物质转运、血管张力调节均受血流剪切力的影响[23]。近来的研究显示缺乏血流动力学的作用将诱导血管ECs的凋亡[5]。Dimmder等证实血流剪切力可完全阻断因撤出培养人脐静脉ECs中的生长因子或与肿瘤坏死因子α共同孵育而导致的ECs凋亡，剪切力干扰ECs死亡的信号传递涉及Cpp32样的蛋白酶家族并通过抑制ECs的凋亡，保持ECs的完整性[24]。已证实ECs根据所处力学环境具有很强的定向性及适应性，且这种适应性的取向过程具有力的大小和作用时间的依赖性，剪切力作用于ECs通过ECs的细胞骨架将应力在整个细胞内传递，同时力学信号可以改变ECs中信号分子的行为，使力的信息以级联生物化学反应的方式在细胞内传播。已有研究表明：参与力学信号转导过程中存在膜上力学敏感的离子通道变化及G蛋白耦连的信号途径。在基因水平，切应力作用对很多基因产物生成有影响，提示力学信号传入核内，调节相关基因的表达，这些基因产物可再作为反式作用因子，对其它基因的转录起调控作用[25]。因此液流对ECs的分化具有重要影响，可以促进其分化表达相关抗原，维持正常的生理功能，随流动状态的改变其分化发生适应性改变，出现某种因子的过度表达，可形成病理基础或造成ECs的损伤，其机理正是近年来研究的热点问题，现已积累了大量资料，但对许多根本机制尚无法给出肯定回答。目前培养均在静态下，其分化必然与生理状态的分化有较大差异，因此目前研究应致力于建立一个既能分解各种作用方式，又能反映生理、病理条件的流动培养模型，为ECs的分化研究提供合理的环境。
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5 小 结
综上所述，培养ECs在研究ECs相关的疾病及机制方面做出了巨大贡献，但培养ECs因脱离了体内环境，其分化发生较大的改变，人们应正确地分析基于培养ECs得出的结论。ECs具有较大的异质性，其不同特点反映了ECs重要的分化途径，ECs分化的特征可根据外界环境的信号(生长因子、激素、神经介质、支持物、流动剪切力)的改变而调整，ECs的取材(遗传因素)也具有决定性影响。通过建立能更好模拟ECs体内生存环境的培养模型，诱导ECs的分化，揭示ECs分化的分子机理，为人们达到使ECs定向分化的目的迈出关键的一步。
注释：国家自然科学基金资助项目(39670221)
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收稿：1998-01-10, http://www.100md.com