血液透析前后血小板提取液中NPY与NT含量的变化及意义
作者：罗南萍 孟建中 杨道理 武翠华 齐法莲 孔立新 刘文渊
单位：济南军区总医院 免疫科，济南 250031
关键词：神经肽Y；神经降压素；血小板；血液透析；放射免疫分析
摘要 探讨血液透析 摘要 探讨血液透析(HD)过程对慢性肾功能衰竭患者(CRF)血小板中神经肽Y(NPY)与神经降压素(NT)含量的影响及NPY与NT的作用机制。我们采用特异性放射免疫分析方法，对血小板提取液和不含血小板血浆中NPY及NT含量进行HD前后的动态观察，并以30例健康人作为对照。结果：正常对照组提取的血小板液中NPY与NT含量分别为(58.18±21.29) ng/109和(25.38±13.43) ng/109。与对照组比较，HD前CRF患者血小板提取液中NPY含量明显降低，NT显著高于对照组。而HD后CRF患者血小板提取液中NPY与HD前比较明显增高，NT则明显降低。CRF患者血浆NPY含量在HD前明显高于对照组，HD后明显下降。且NPY与NT之间具有明显的相关性。结论：在CRF病理过程中，由血小板释放的NPY和NT与5-羟色胺等生物活性物质共同参与了以缩血管效应为主的免疫反应，是造成肾性高血压和肾血管痉挛的重要病理因素。
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Expression and Significance of Neuropeptide and Neurotensin
in the Extract of Platelet of Chronic Renal
Failure Patients During Hemodialysis
Luo Nanping Meng Jianzhong Yang Daoli Wu Cunhua Qi Falian
Kong Lixin Liu Wenyuan
(Department of Immunology,Jinan General Hospital, PLA,Jinan 250031)
, 百拇医药 Abstract The aim of this study was to investigate the change of neuropeptide Y(NPY) content and neurotensin (NT) content of the platelet from chronic renal failure (CRF) patients during hemodialysis (HD) and explore its mechanism of action. Platelet was separated from the patients' plasma and the NPY and and NT contents of the platelet and plasma were dynamically observed pre-HD and post-HD.30 healthy people were chosen as the controls. The results showed the NPY and NT contents of the platelet extract were (58.18±21.29) ng/109 and (25.38±13.43) ng/109 respectively.The NPY content of the platelet extract of the CRF patients was obviously decreased and the NT content of the plasma was obviously increased; however, the NT contents of the platelet extract and the plasma were both higher than those in the control group. The NPY content of the platelet extract and NT content of the plasma at the post-HD obviously increased as compared with pre-HD, but the NT content of the platelet extract and the NPY content of the plasma obviously decreased. There was an obvious correlation between NPY and NT. The authors conclude that during the period of CRF, the immunoreactions which mainly involve bio-active substances such as NPY, NT and 5-hydroxytryptamine released by the platelet to interfer the vasoconstrictive effect are the main pathologic factors to induce renal hypertensin and renal vasospasm.
, 百拇医药
Key words Neuropeptide-Y Neurotensin Platelet Hemodialysis Radio-Immunity Analysis
1 引 言
1987年Ericsson[1]首先发现大鼠等巨核细胞具有合成NPY的能力，并储存于血小板，在血小板聚集时释放。至今对血小板储存、释放NPY和NT的现象、功能以及在人体机能紊乱时的病理生理作用了解甚少。本工作从慢性肾功能衰竭(CRF)血液透析(HD)患者血浆中分离出血小板，采用特异性放射免疫分析法观察分析了血小板提取液和不含血小板的血浆中NPY与NT的含量变化，探讨血小板释放的生物活性多肽调节血管收缩、舒张活性以及相互拮抗作用对CRF患者的影响。
2 材料与方法
2.1 临床资料
, 百拇医药
2.1.1 维持性血液透析的CRF患者35例 男19例，女16例。平均年龄(46.5±5.5)岁。均来自本院血液净化中心。原发病分别为慢性肾衰21例、肾小球动脉硬化4例、糖尿病肾病5例、肾盂肾炎3例、多囊肾2例。血透时间为6～74个月(平均39个月)。全部患者内生肌酐清除率(Ccr)均小于10 ml-1.min/1.73m2。均采用碳酸盐透析液，中空纤维透析器透析膜截留分子量为12000。每周透析3次，每次4～5 h。
2.1.2 选择30例健康献血员作为对照组 男17例，女13例。平均年龄为(32.5±12.0)岁。
2.2 方法
2.2.1 血小板提取液的制备 分别于HD前、后即刻抽取患者静脉血(对照组抽取空腹静脉血)3 ml，立即注入含有EDTA的试管中，轻轻摇匀，于4 ℃，以500 r/min离心30 min后，吸取所有血浆于另一硅化塑料试管中；再次在4℃，以2000 r/min离心30 min，取出上清液作为不含血小板的血浆标本，沉淀即为血小板。以生理盐水洗涤沉淀一次，离心倾去上清液，于沉淀中加入1 ml生理盐水，充分混匀后，在F800血球计数仪上行血小板计数。调整血小板数为1×109/L。分别将血浆与血小板混悬液置于-30 ℃以下待测。
, 百拇医药
2.2.2 样本NPY与NT测定 将血小板混悬液于-30～37 ℃反复冻融3～4次，镜下观察血小板形态大部分裂解、破碎，再以抽干机浓缩抽干后，取1 ml生理盐水复溶，待充分溶解后进行NPY与NT放射免疫测定。
人工合成的NPY、NT与相应抗体均为Sigma公司产品。125Ⅰ-NPY为美国Amersham公司产品，稀释为14000 cpm/min。NPY抗血清工作滴度为1∶14万，与7种常见多肽类化合物交叉反应<1%。125Ⅰ-NT用Lodogen氧化法制备。采用放射免疫非平衡法进行标准曲线及样品的复管检测。NPY与NT试剂均由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供。测量仪器：FT-630 G微机多探头r-计数仪，由中国核工业部北京核仪器厂提供。
2.2.3 样本浓度计算与统计学处理
, 百拇医药
所有数据以
±s表示，组间差异行t检验，选用P<0.05为统计显著性界值。
3 结 果
3.1 血小板提取液中NPY与NT水平
30例正常人血小板提取液中NPY与NT分别为(58.18±21.29)ng/109，(25.38±13.43)ng/109。与对照组比较，CRF患者HD前NPY水平明显降低，NT明显增高，均有显著性差异(P<0.01)；而HD后NT降低(P<0.05)，NPY变化不明显。CRF患者HD后与HD前比较NPY明显增高，NT则明显降低，并具显著性差异(P<0.05)。
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3.2 血浆中NPY与NT水平
与对照组比较，CRF患者HD前血浆NPY和NT水平明显升高(P<0.01)。CRF患者HD后血浆NPY与HD前比较明显降低(P<0.05)，NT则在HD后明显增高(P<0.05)。
3.3 相关实验
HD前CRF患者血小板提取液与血浆中NPY、NT之间分别具有良好的相关性，其中血小板提取液中NPY含量与血浆NPY含量呈显著负相关(r=-0.67；P<0.01)。血小板中NT含量也与血浆NT含量呈负相关(r=-0.40；P<0.05)。
4 讨 论
NPY与NT是近几年发现的一组生物学作用相拮抗的多肽，它们广泛分布于机体组织内，对机体多种生理活动起重要的调节作用。自1982年发现以来，一直被认为仅存于神经系统中[2]。1987年Ericsson提出血小板中也含有NPY。1991年[3]又进一步证实大鼠血小板中存在与NPY合成相关联的mRNA，表明血小板是合成NPY的主要细胞。本组实验结果发现，用CRF患者血浆分离出的血小板提取液中，能测出一定浓度的与NPY、NT特异性抗体相结合的相应抗原，其中在HD前NPY水平明低于对照组，而NT含量则较正常人明显增高。同时检测出HD前后血浆中NPY与NT的含量均处于高水平状态。而CRF患者血小板中NPY与NT的代谢紊乱表明血小板不仅参与了凝血机制，可能参与了肾脏疾病的发病过程。其致病机理可能是由于CRF患者体内毒素聚集作用、凝血机制障碍等原因诱导、活化并释放大量NPY及NT入血浆，致使血浆中NPY与NT浓度增高，这一结果与Mgers[4]动物实验报道相一致。
, 百拇医药
CRF患者HD后血小板提取液中NPY水平较HD前明显增高，而血浆中NPY水平降低，可能是由于(1)血液透析作为一种中等强度刺激使病人应激，交感神经处于兴奋状态而使血小板合成释放增加。(2)HD过程机械性损伤，血小板随血循环与透析膜接触从而被激活。
NT是一种具有强烈舒张血管、降低血压作用的神经肽，其分子量为1673。在本组CRF患者中85%同时伴有高血压的发生。测定其血小板提取液与血浆中NT水平均显著增高。说明肾性高血压病人由于长期肾血管痉挛所致血压升高反馈刺激中枢神经系统，使交感神经兴奋，致使NT合成与释放增加，以抵抗NPY等多肽物质强烈的缩血管作用。
从相关实验中看出，血小板提取液和血浆中NPY与NT之间关系十分密切，表明血浆中增加的NPY与NT可能部分来源于血小板的释放。有关实验证明，NT的降血压作用是促进肥大细胞释放组织胺等生物活性物质引起[5]。而血小板释放NPY、NT可作为血小板与血管间的一种传递者，直接与其它缩血管物质(如5-羟色胺等)协同作用，发挥缩血管效应[6]。NPY与NT是一组生物学活性相拮抗的多肽。HD过程增强了NT舒血管作用，以拮抗由病理因素造成血小板聚集时NPY大量释放、与5-羟色胺等对血管的强烈收缩作用，是防止HD过程中的严重并发症，进一步提高透析质量，延长患者生命的重要环节(见表1)。
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表1 HD前后血小板提取液与血浆中NPY和NT水平(±s)
Table 1 The level of NPY and NT in platelet and plasma before and after HD(±s)
Group
n
Platelet(ng/109)
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Plasma(ng/L)
NPY
NT
NPY
NT
Control
35
58.18±21.29
25.38±13.43
144.06±33.83
70.66±24.72
Pre-HD
, 百拇医药
30
33.97±19.80△△
40.47±23.99
423.26±54.97△△
133.83±92.33△△
Post-HD
30
65.57±28.57*
15.76±13.22
315.49±50.19**△△
, 百拇医药
205.06±134.09**△
* Compared with pre-HD,P<0.05；** Compared with pre-HD,P<0.01；△ Compared with contral,P<0.05；
△△ Compared with contral, P<0.01参考文献
1 Ericsson A. Detection of neuropeptide Y and its mRNA in megakaryocytes:Enhanced levels in certain autoimmune mice. Proc Natl Acacl,USA 1987;84∶5585
2 Ailen JM, Bloom SR. Neuropeptide Y: a putative neurotramsmitter. Neurochem,1986;8∶1
, 百拇医药
3 Ericsson A. Detection of neuropeptide Y-like immunoreactivity and messenger RNA in rat platelets: The effects of vinblastine,reserpine, and dexamethasone on NPY expression in blood cells,Exper Cell Res,1991;192∶604
4 Myets AK. Biochem Biophys Res Comm,1988;155∶158
5 蔡 强.神经降压素.国外医学消化系统疾病分册，1986；3∶129
6 杨耀芳，杨丽华，施广璞.大鼠血小板中的神经肽Y及其对血管收缩的影响.生理学报，1993；15∶400
(收稿：1998-05-11 修回：1998-08-10), http://www.100md.com
单位：济南军区总医院 免疫科，济南 250031
关键词：神经肽Y；神经降压素；血小板；血液透析；放射免疫分析
摘要 探讨血液透析 摘要 探讨血液透析(HD)过程对慢性肾功能衰竭患者(CRF)血小板中神经肽Y(NPY)与神经降压素(NT)含量的影响及NPY与NT的作用机制。我们采用特异性放射免疫分析方法，对血小板提取液和不含血小板血浆中NPY及NT含量进行HD前后的动态观察，并以30例健康人作为对照。结果：正常对照组提取的血小板液中NPY与NT含量分别为(58.18±21.29) ng/109和(25.38±13.43) ng/109。与对照组比较，HD前CRF患者血小板提取液中NPY含量明显降低，NT显著高于对照组。而HD后CRF患者血小板提取液中NPY与HD前比较明显增高，NT则明显降低。CRF患者血浆NPY含量在HD前明显高于对照组，HD后明显下降。且NPY与NT之间具有明显的相关性。结论：在CRF病理过程中，由血小板释放的NPY和NT与5-羟色胺等生物活性物质共同参与了以缩血管效应为主的免疫反应，是造成肾性高血压和肾血管痉挛的重要病理因素。
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Expression and Significance of Neuropeptide and Neurotensin
in the Extract of Platelet of Chronic Renal
Failure Patients During Hemodialysis
Luo Nanping Meng Jianzhong Yang Daoli Wu Cunhua Qi Falian
Kong Lixin Liu Wenyuan
(Department of Immunology,Jinan General Hospital, PLA,Jinan 250031)
, 百拇医药 Abstract The aim of this study was to investigate the change of neuropeptide Y(NPY) content and neurotensin (NT) content of the platelet from chronic renal failure (CRF) patients during hemodialysis (HD) and explore its mechanism of action. Platelet was separated from the patients' plasma and the NPY and and NT contents of the platelet and plasma were dynamically observed pre-HD and post-HD.30 healthy people were chosen as the controls. The results showed the NPY and NT contents of the platelet extract were (58.18±21.29) ng/109 and (25.38±13.43) ng/109 respectively.The NPY content of the platelet extract of the CRF patients was obviously decreased and the NT content of the plasma was obviously increased; however, the NT contents of the platelet extract and the plasma were both higher than those in the control group. The NPY content of the platelet extract and NT content of the plasma at the post-HD obviously increased as compared with pre-HD, but the NT content of the platelet extract and the NPY content of the plasma obviously decreased. There was an obvious correlation between NPY and NT. The authors conclude that during the period of CRF, the immunoreactions which mainly involve bio-active substances such as NPY, NT and 5-hydroxytryptamine released by the platelet to interfer the vasoconstrictive effect are the main pathologic factors to induce renal hypertensin and renal vasospasm.
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Key words Neuropeptide-Y Neurotensin Platelet Hemodialysis Radio-Immunity Analysis
1 引 言
1987年Ericsson[1]首先发现大鼠等巨核细胞具有合成NPY的能力，并储存于血小板，在血小板聚集时释放。至今对血小板储存、释放NPY和NT的现象、功能以及在人体机能紊乱时的病理生理作用了解甚少。本工作从慢性肾功能衰竭(CRF)血液透析(HD)患者血浆中分离出血小板，采用特异性放射免疫分析法观察分析了血小板提取液和不含血小板的血浆中NPY与NT的含量变化，探讨血小板释放的生物活性多肽调节血管收缩、舒张活性以及相互拮抗作用对CRF患者的影响。
2 材料与方法
2.1 临床资料
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2.1.1 维持性血液透析的CRF患者35例 男19例，女16例。平均年龄(46.5±5.5)岁。均来自本院血液净化中心。原发病分别为慢性肾衰21例、肾小球动脉硬化4例、糖尿病肾病5例、肾盂肾炎3例、多囊肾2例。血透时间为6～74个月(平均39个月)。全部患者内生肌酐清除率(Ccr)均小于10 ml-1.min/1.73m2。均采用碳酸盐透析液，中空纤维透析器透析膜截留分子量为12000。每周透析3次，每次4～5 h。
2.1.2 选择30例健康献血员作为对照组 男17例，女13例。平均年龄为(32.5±12.0)岁。
2.2 方法
2.2.1 血小板提取液的制备 分别于HD前、后即刻抽取患者静脉血(对照组抽取空腹静脉血)3 ml，立即注入含有EDTA的试管中，轻轻摇匀，于4 ℃，以500 r/min离心30 min后，吸取所有血浆于另一硅化塑料试管中；再次在4℃，以2000 r/min离心30 min，取出上清液作为不含血小板的血浆标本，沉淀即为血小板。以生理盐水洗涤沉淀一次，离心倾去上清液，于沉淀中加入1 ml生理盐水，充分混匀后，在F800血球计数仪上行血小板计数。调整血小板数为1×109/L。分别将血浆与血小板混悬液置于-30 ℃以下待测。
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2.2.2 样本NPY与NT测定 将血小板混悬液于-30～37 ℃反复冻融3～4次，镜下观察血小板形态大部分裂解、破碎，再以抽干机浓缩抽干后，取1 ml生理盐水复溶，待充分溶解后进行NPY与NT放射免疫测定。
人工合成的NPY、NT与相应抗体均为Sigma公司产品。125Ⅰ-NPY为美国Amersham公司产品，稀释为14000 cpm/min。NPY抗血清工作滴度为1∶14万，与7种常见多肽类化合物交叉反应<1%。125Ⅰ-NT用Lodogen氧化法制备。采用放射免疫非平衡法进行标准曲线及样品的复管检测。NPY与NT试剂均由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供。测量仪器：FT-630 G微机多探头r-计数仪，由中国核工业部北京核仪器厂提供。
2.2.3 样本浓度计算与统计学处理
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所有数据以
±s表示，组间差异行t检验，选用P<0.05为统计显著性界值。3 结 果
3.1 血小板提取液中NPY与NT水平
30例正常人血小板提取液中NPY与NT分别为(58.18±21.29)ng/109，(25.38±13.43)ng/109。与对照组比较，CRF患者HD前NPY水平明显降低，NT明显增高，均有显著性差异(P<0.01)；而HD后NT降低(P<0.05)，NPY变化不明显。CRF患者HD后与HD前比较NPY明显增高，NT则明显降低，并具显著性差异(P<0.05)。
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3.2 血浆中NPY与NT水平
与对照组比较，CRF患者HD前血浆NPY和NT水平明显升高(P<0.01)。CRF患者HD后血浆NPY与HD前比较明显降低(P<0.05)，NT则在HD后明显增高(P<0.05)。
3.3 相关实验
HD前CRF患者血小板提取液与血浆中NPY、NT之间分别具有良好的相关性，其中血小板提取液中NPY含量与血浆NPY含量呈显著负相关(r=-0.67；P<0.01)。血小板中NT含量也与血浆NT含量呈负相关(r=-0.40；P<0.05)。
4 讨 论
NPY与NT是近几年发现的一组生物学作用相拮抗的多肽，它们广泛分布于机体组织内，对机体多种生理活动起重要的调节作用。自1982年发现以来，一直被认为仅存于神经系统中[2]。1987年Ericsson提出血小板中也含有NPY。1991年[3]又进一步证实大鼠血小板中存在与NPY合成相关联的mRNA，表明血小板是合成NPY的主要细胞。本组实验结果发现，用CRF患者血浆分离出的血小板提取液中，能测出一定浓度的与NPY、NT特异性抗体相结合的相应抗原，其中在HD前NPY水平明低于对照组，而NT含量则较正常人明显增高。同时检测出HD前后血浆中NPY与NT的含量均处于高水平状态。而CRF患者血小板中NPY与NT的代谢紊乱表明血小板不仅参与了凝血机制，可能参与了肾脏疾病的发病过程。其致病机理可能是由于CRF患者体内毒素聚集作用、凝血机制障碍等原因诱导、活化并释放大量NPY及NT入血浆，致使血浆中NPY与NT浓度增高，这一结果与Mgers[4]动物实验报道相一致。
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CRF患者HD后血小板提取液中NPY水平较HD前明显增高，而血浆中NPY水平降低，可能是由于(1)血液透析作为一种中等强度刺激使病人应激，交感神经处于兴奋状态而使血小板合成释放增加。(2)HD过程机械性损伤，血小板随血循环与透析膜接触从而被激活。
NT是一种具有强烈舒张血管、降低血压作用的神经肽，其分子量为1673。在本组CRF患者中85%同时伴有高血压的发生。测定其血小板提取液与血浆中NT水平均显著增高。说明肾性高血压病人由于长期肾血管痉挛所致血压升高反馈刺激中枢神经系统，使交感神经兴奋，致使NT合成与释放增加，以抵抗NPY等多肽物质强烈的缩血管作用。
从相关实验中看出，血小板提取液和血浆中NPY与NT之间关系十分密切，表明血浆中增加的NPY与NT可能部分来源于血小板的释放。有关实验证明，NT的降血压作用是促进肥大细胞释放组织胺等生物活性物质引起[5]。而血小板释放NPY、NT可作为血小板与血管间的一种传递者，直接与其它缩血管物质(如5-羟色胺等)协同作用，发挥缩血管效应[6]。NPY与NT是一组生物学活性相拮抗的多肽。HD过程增强了NT舒血管作用，以拮抗由病理因素造成血小板聚集时NPY大量释放、与5-羟色胺等对血管的强烈收缩作用，是防止HD过程中的严重并发症，进一步提高透析质量，延长患者生命的重要环节(见表1)。
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表1 HD前后血小板提取液与血浆中NPY和NT水平(
±s)Table 1 The level of NPY and NT in platelet and plasma before and after HD(
±s)Group
n
Platelet(ng/109)
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Plasma(ng/L)
NPY
NT
NPY
NT
Control
35
58.18±21.29
25.38±13.43
144.06±33.83
70.66±24.72
Pre-HD
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30
33.97±19.80△△
40.47±23.99
423.26±54.97△△
133.83±92.33△△
Post-HD
30
65.57±28.57*
15.76±13.22
315.49±50.19**△△
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205.06±134.09**△
* Compared with pre-HD,P<0.05；** Compared with pre-HD,P<0.01；△ Compared with contral,P<0.05；
△△ Compared with contral, P<0.01参考文献
1 Ericsson A. Detection of neuropeptide Y and its mRNA in megakaryocytes:Enhanced levels in certain autoimmune mice. Proc Natl Acacl,USA 1987;84∶5585
2 Ailen JM, Bloom SR. Neuropeptide Y: a putative neurotramsmitter. Neurochem,1986;8∶1
, 百拇医药
3 Ericsson A. Detection of neuropeptide Y-like immunoreactivity and messenger RNA in rat platelets: The effects of vinblastine,reserpine, and dexamethasone on NPY expression in blood cells,Exper Cell Res,1991;192∶604
4 Myets AK. Biochem Biophys Res Comm,1988;155∶158
5 蔡 强.神经降压素.国外医学消化系统疾病分册，1986；3∶129
6 杨耀芳，杨丽华，施广璞.大鼠血小板中的神经肽Y及其对血管收缩的影响.生理学报，1993；15∶400
(收稿：1998-05-11 修回：1998-08-10), http://www.100md.com