力-电环境促进骨形成的机制——骨局部因子
作者：郑磊
单位：郑磊(第一军医大学 附属南方医院创伤骨科，广州 510515)
关键词：力-电环境；骨局部因子；骨形成
生物医学工程学杂志000225 郑磊 综述 王前 裴国献 审校
摘要 应力应变环境及电、磁场刺激骨形成的机理 尚不十分清楚，最近研究发现力-电环境可通过诱导骨生成细胞产生各种骨局部因子，如前 列腺素E2(PGE2)、胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)、骨形态发生蛋白(BMP)和β转化生长 因子(TGF-β)等参与骨形成及改建。本文介绍了几种重要的骨局部因子以及力-电环境诱 导骨生成细胞产生骨局部因子的研究进展。
The Mechanism of Bone Formation Promoted by Mechano-electrical Environments——Current Studies on Local Bone Factors
, 百拇医药
Zheng Lei Wang Qian Pei Guoxian
(The Department of Orthopedics and Traumatology, Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510510)
Abstract The mechanism for promoting bone formation unde r the mechanical and the electromagnetical fields stimulation is not yet quite c lear. In recent years, it has been found the mechanical and electromagnetical en vironments may induce the osteogenic cells to produce some local bone factors, s uch as prostaglandin E2 (PGE2), insultine-like growth factors-Ⅱ(IGF-Ⅱ), bone morphogenetic protein (BMP) and transforming growth factor β(TGF-β). Th ese factors play an important role in bone formation and remodeling. This articl e introduces current studies on some of these local bone factors under the stimu lation of the mechanical and electromagnetical environments.
, 百拇医药
Key words Mechanical and electromagnetical environments Local bone factors Bone formation
应力应变环境及电、磁场刺激，具有调节骨生长代谢，促进 骨愈合及改建的作用。这个现象已被众多的理论和实验研究证实，临床实践中各式各样的加 压固定装置及电、磁场刺激仪也已广泛应用于临床治疗骨不连、先天性假关节及骨质疏松等 疾 病的治疗，并取得了满意疗效。但力-电环境刺激骨愈合机理的基础研究尚缺乏。1989年Fi tz simmons[1，2]发现体外培养的鸡胚颅盖骨细胞在电磁场作用下增殖有赖于培养基 中胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的丝裂原活性。这一发现引起不少学者注意，有关力-电 环境诱导骨局部因子产生的报道日渐增多，现就该领域的研究进展介绍如下：
1 骨局部因子在骨形成中的作用
, 百拇医药 骨代谢和骨愈合是受多种因素调节的复杂过程。骨局部因子的调节作用是内在因素之一。前 列腺素(PG)是影响骨代谢的局部因子之一，由成骨细胞产生，临近的骨髓、血管、结缔组织 、与损伤和炎症相关的细胞产生的PG对骨组织也有一定的影响。PG对骨形成和骨吸收均具有 促进和抑制的双重作用。另外，已从骨基质和骨细胞及骨器官培养基中分离出多种骨源性生 长因子(Bone-derived growth factor,BDGF)，如胰岛素样生长因子Ⅰ、Ⅱ(TGF-Ⅰ、Ⅱ) ， β转化生长因子(TGF-β)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，血小板衍生生长因子(PDGF) 以及骨形成蛋白(BMP)。骨细胞培养基中也含上述数种因子，同时还存在造血细胞因子(G-C SF，GM-CSF)。这些骨生长因子有着不同的生物活性，主要包括：丝裂原活性、分化作用、 趋化作用以及溶骨活性。骨细胞产生一定量的骨生长因子贮存于细胞外基质，同时还分泌骨 生长因子作用其相邻的成骨细胞(旁分泌作用)及其自身(自分泌作用)。骨吸收时，基质中的 骨生长因子释放，作为迟缓性旁分泌剂，刺激成骨细胞前体增殖。由此可见，骨局部因子在 成骨中起着重要作用。
, 百拇医药
1.1 前列腺素(PG)
前列腺素是花生四烯酸的代谢产物。体外培养的骨细胞主要产生PGE2、PGF2α、PG I2及PGI2的代谢产物6-酮-PGF1α。在骨组织中，PGE2含量很多，PGI2次 之。PG在骨代谢中的作用非常复杂。人们最早研究的是PG的骨吸收活性，PGE2的骨吸收活 性最强，PGI2最弱，外源性PGF2α需通过内源性PGE2才能促进骨吸收。体内研究 表 明，PG是恶性肿瘤高钙血症、牙周病和风湿性关节炎骨丢失的主要原因，关节置换术后的松 动亦与PG有关。PG在骨形成中也发挥重要作用。PGE2促进前成骨细胞增殖，加速体外骨结 节矿化，对成骨细胞DNA和碱性磷酸酶ALP活性，PGE2表现出双相性。低浓度时，PGE2可 促进DNA合成，提高ALP活性。
, 百拇医药
Weinreb[3]研究表明，大鼠服用PGE2(6 mg/kg，共服3周)，可显著增加长骨的机 械强度和颅盖骨骨密度，并可诱导骨髓细胞表达早期基因(c-fos、c-jun、egr-1)，促进 骨髓 中骨前体细胞的增殖并向成骨细胞分化。另外PG还可间接通过某些骨生长因子调节骨代谢， 如PGE2可促进IGF-I的合成[4]，PGE1则显著增强重组合人BMP的诱导成骨效应 [5]。
1.2 胰岛素样生长因子(IGF)
现已鉴别出两种IGF，即IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，分别为含有70个和67个氨基酸残基的单链多态 。IGF-Ⅰ可由成骨细胞产生并以自分泌方式刺激成骨细胞增殖和基质合成。IGF-Ⅱ也可被 成骨细胞合成，对成骨细胞的作用与IGF-Ⅰ基本相似，但较弱。人骨基质中IGF-Ⅱ含量是 IGF-Ⅰ的10～15倍。另外，IGF-Ⅰ在体外促进破骨细胞的形成，刺激成熟破骨细胞功能活 性，调节骨吸收，参与骨改建。Andrew等[6]发现人正常骨痂早期肉芽组织形成阶 段，间充质细胞、内皮细胞由IGF-Ⅱ mRNA表达；软骨形成阶段，幼稚软骨细胞成骨细胞均 有IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ mRNA的表达；至骨痂改建阶段，一些破骨细胞也有IGF-Ⅱ mRNA表达 。其中，IGF-Ⅱ mRNA在整个骨折愈合过程中持续表达。最近在犬的截骨延长实验中，发现 骨 痂中IGF-Ⅰ的浓度明显增加，提示IGF-Ⅰ在骨愈合中发挥重要作用[7]。
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1.3 骨形态发生蛋白(BMP)
BMP是一种疏水性酸性糖蛋白，天然提取的BMP很可能是几种不同分子量蛋白的混合物。BMP 的 主要生物学作用是诱导未分化的间充质细胞分化为软骨和骨，即诱导成骨作用。BMP作用无 种属特异性，具有跨种属诱导成骨能力，新骨形成量一般与BMP植入量呈正相关。现已发现B MP-1～13，其中BMP-1～9已获得相应的cDNA克隆，而报道较多的是BMP-2、-4和-7。BM P-2有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨能力。BMP-4的结构和功能均与BMP-2相似，但单 独应用时其成骨作用较BMP-2弱。BMP-7又称成骨蛋白1(OP1)，单独使用即显示很强的成骨 作用。
目前BMP修复骨缺损的主要应用形式是将BMP与各类载体材料复合植入，以达到BMP缓慢释放 ，增强局部诱导成骨作用。如Asahina等[8]将粗提的牛BMP与羟基磷灰石胶原(HC) 组成复合材料，修复成年猴下颌骨6 mm×7 mm×10 mm骨缺损，三个月后发现HC-BMP植 入组新生 骨量明显多于单纯HC植入组。Ijiri等[9]将BMP与A-W玻璃陶瓷复合后植入大鼠皮 下亦有类似发现。
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1.4 β转化生长因子(TGF-β)
TGF-β是一组多功能的多肽，广泛存在于动物正常组织细胞及转化细胞中，以血 小板和骨组织中含量最为丰富。已证明TGF-β可刺激骨膜间充质细胞增殖、分化，促进成 骨和成软骨细胞增生，诱导Ⅰ型胶原、骨桥蛋白(Osteopontin)和骨连接素(Osteonectin)的 合成。新近研究表明，TGF-β可以上调成骨细胞中一种新克隆出的增殖特异基因PROM-1的 表达[10]，进一步证实TGF-β对成骨细胞的增殖调控作用。
Nielsen等[11]在3个月龄的大鼠胫骨骨折线处持续注射4～40 ng/d的TGF-β，40 天后发现骨折线处骨及骨痂横截面积增加，并与剂量呈正相关。Sun等[12]将TGF -β复合载体植入修复兔桡骨中上端1.5厘米缺损，术后12周发现复合植入组有新生骨连接 断端皮质，为板层骨和网状骨，并含早期骨髓腔结构和骨髓成分。单纯载体植入组缺损区仅 为纤维组织填充。
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1.5 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)
bFGF是一类存在于包括骨在内的大多数组织内的多肽。在骨折愈合早期在骨折部位肉芽组织 中就有bFGF基因的表达，以后在骨愈合的各阶段均有恒定的基因表达水平。大鼠每天注 射bFGF刺激皮质骨和松质骨的骨内膜成骨，且骨内膜细胞中的内源性TGF-β含量增加， 说明bFGF刺激骨内膜骨形成的作用部分是TGF-β介导。Yamada[13]将bFGF与明胶 水凝胶渗合，用于修复兔直径为6 mm的颅骨缺损，12周后达完全愈合，而单纯明胶水凝胶 植入未见诱导成骨。bFGF还有促进血管生成作用，促进毛细血管向骨断端和移植物中生长。 将含有BMP的纤维玻璃膜(FCM)复合bFGF植入大鼠背部皮下，2周后与未复合bFGF植入组相比 ，碱性磷酸酶活性提高1.3倍，细胞内钙含量提高3倍，而Ⅱ型胶原合成量减少，认为这与b FGF快速大量促进血管长入FCM，加速成骨过程有关[14]。
1.6 血小板衍生生长因子(PDGF)
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PDGF分子量为28～35KD，主要存在形式为A、B两条多肽链组成的杂二聚体，还存在AA、BB的 均二聚体。PDGF最初由血小板分离出，在骨基质和骨肉瘤细胞中也存在。PDGF可刺激软骨细 胞和成骨细胞增生，促进骨痂中软骨形成和膜内骨化，在骨折后期骨痂中PDGF mRNA表达量 最高。在大鼠颅盖骨培养中，PDGF可促进细胞分裂，胶原及非胶原蛋白合成。将PDGF-BB吸 附于左旋聚乳酸膜用于组织引导再生材料(Guided tissue regeneration,GTR)，修复大鼠颅 盖骨缺损，2周后可达完全骨性愈合[15]。另外，PDGF还可通过刺激前列腺素的合 成而促进鼠颅骨的骨吸收，参与骨改建。
2 力-电环境调节骨局部因子生成的实验研究
2.1 应力与前列腺素E2(PGE2)
骨源性细胞对应力的反应是PG依赖性。牵拉骨源性细胞，剪切应力促进PGE2合成，PGE2 对牵拉骨源性细胞的反应呈三相性。压力负荷引起的合成反应也是PG依赖性，压力负荷可促 进骨细胞合成PGI2，成骨细胞合成PGE2，生成的PG促进细胞中DNA和RNA合成。
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Brighton[16，17]选用单层多聚氨基甲酸乙酯膜作为培养皿基底材料，通过气体动 力加载牵张基底膜，使之产生200、400、1000微应变，加载频率为1 Hz，从而使附着于 膜上的骨细胞间接承受到拉应力的作用。实验发现，400微应变的应力环境中加载15 min、2 4 h和48 h，细胞中的DNA含量明显增加，分化增生活动增强；但胶原纤维、非胶原 蛋白、蛋白多糖的合成，以及ALP活性均有明显降低。同时，测得培养液中PGE2浓度明显 升高，升高的PGE2通过自分泌和旁分泌增强磷酸肌醇信使通路作用，导致成骨细胞增殖、 细胞外成份合成减少。当在培养液中加入PGE2生成抑制剂——消炎痛后，并未减弱拉应力 的促细胞增殖作用，这提示除PGE2外，还存在其他机制参与拉应力诱导成骨细胞增殖。
2.2 电磁与胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)
人、鼠的骨细胞都可产生IGF-Ⅱ，对人、鸡、鼠无血清培养的骨细胞具有促增殖作用。IGF -Ⅱ可很快诱导鼠成骨细胞样细胞中的前肿瘤基因c-fos表达，后者可能在诱导成骨细胞的 增殖中具有重要作用。此外，IGF-Ⅱ还具有促分化作用，可刺激鼠成骨细胞株MC-3T3-E1 合成Ⅰ型胶原，还可在24 h内增加培养的非转化正常人骨细胞合成2-4倍的原胶原mRNA。 由此可见，IGF-Ⅱ在骨代谢中的重要作用。
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Fitzsimmons[1，2]发现电磁场在刺激成骨细胞增殖的同时不仅可诱导成骨细胞释 放IGF-Ⅱ到培养基，而且可增加细胞膜上IGF-Ⅱ受体的数目，两者共同作用促进细胞增殖 。将鸡胚颅盖骨组织暴露于低幅电容耦合电磁场中(培养基中电压梯度为10-7v/cm)， 发现骨细胞增殖不仅有频率依赖性，还依赖于培养基中丝裂原活性。另外，骨细胞增殖和丝 裂原活性与培养基中碱性磷酸酶浓度呈正相关，表明丝裂原是由定向分化的成骨细胞产生。 为明确丝裂原性质，他们将人骨肉瘤细胞株TE-85置于相同电磁场中，用Nortern印迹杂交 技术检测培养基中IGF-Ⅱ mRNA表达水平，结果4.8 kb和7.0 kb的转录产物显著增加，尤 其4.8 kb转录产物在暴露30 min是对照组的4.6倍。而IGF-Ⅰ mRNA低于检测水平。这提 示引起细胞增殖的丝裂原主要是IGF-Ⅱ。
后来，他们改用复合磁场(200 mG的静止磁场复合峰值为400 mG的间变磁场)作用于TE-85细 胞株同样发现细胞增殖以及IGF-Ⅱ水平增加。用抗IGF-Ⅱ单克隆抗体可以阻断复合磁场的 促细胞增殖作用[18]。进一步证实电磁场诱导生成的IGF-Ⅱ促进了细胞增殖。另 外，暴露相同复合磁场中，TE-85细胞膜上IGF-Ⅱ受体数也增加，且与受体解离常数显著 增加有关[19]。
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2.3 电磁与骨形成蛋白(BMP)
BMP能诱导未分化的间充质细胞经过趋化、分裂、分化三个环节不可逆分化为软骨细胞和成 骨细胞，诱导新骨形成。但对已分化成熟的骨和软骨细胞基本无促增殖作用。
Nagai[20]利用脉冲电磁场研究其对发育中鸡胚颅盖骨BMP-mRNA表达的影响。这种 脉冲电磁场临床上证实有明显刺激骨愈合作用，其共同点有：双相准方波，每个脉冲的正相 脉冲宽度为200 μs，反向脉冲为24 μs，每个脉冲群持续5 ms，重复频率为15 Hz。他们 将鸡胚置于脉冲电磁场中培养，用狭线杂交技术(Slot-blot)检测颅盖骨组织BMP-2 mRNA 、BMP-4 mRNA的表达水平，结果发现与对照组相比，培育15 d和17 d的鸡胚颅盖骨组织BMP -2 mRNA水平分别增加2.7倍和1.6倍，BMP-4 mRNA分别增加1.6倍和1.5倍。而培育19 d的颅盖骨中两种mRNA与对照组无明显差异。表明脉冲电磁场可以刺激鸡胚颅盖骨表达BMP -2、BMP-4，且早期鸡胚颅盖骨更为敏感。另外，他们指出，脉冲电磁场的靶细胞可能是 颅盖骨中的骨生成细胞。
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2.4 电磁与β转化生长因子(TGF-β)
目前已鉴定出5种不同分子类型的TGF-β，即TGF-β1～TGF-β5。TGF-β具有促细胞增 殖、调节细胞分化、促细胞外基质合成和调节机体免疫的作用。
Zhung等[21]将MC3T3-E1成骨细胞株暴露于60 Hz的正弦电容耦合电场中，每天刺 激一次，每次30 min，观察了成骨细胞增殖和TGF-β1 mRNA水平变化情况。用体外扩增 逆转录PCR技术检测TGF-β1 mRNA水平，发现电场暴露2 h以上，TGF-β1 mRNA水平明显 高 于对照组。但抗TGF-β1抗体并没有阻断电场下成骨细胞的增殖。然而这并不说明TGF-β1 在体内不参与电刺激成骨，因为TGF-β1在体内的生物效应并不完全在体外重现。如TGF- β1在体内可促进成骨细胞在骨折端聚集。另外，TGF-β可诱导其他生长因子表达，包括bF GF、PDGF-AA、PDGF-BB和M-CSF等，TGF-β也可能通过它们对骨代谢发挥作用。
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2.5 电磁与其它局部因子
PDGF和bFGF在局部成骨中发挥着重要作用，但目前未见有关电磁诱导骨生成细胞产生PDGF和 bFGF的报道，相信探讨电磁促进成骨过程中是否有PDGF和bFGF等骨生长因子产生，将在今后 电磁成骨基础研究中逐渐展开。
来源于造血系统细胞的一些因子也可影响骨重建，如白介素1、3、6(IL-1、3、6)、肿瘤坏 死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等。Cossarizza[22]对脉冲电磁场作 用于免疫系统细胞产生多种细胞因子作了多年研究，发现这些因子不光作用于免疫系统细胞 ， 还广泛作用于神经和内分泌细胞、软骨细胞、成纤维细胞和骨细胞等。其中脉冲电磁场作用 于人周围血单核细胞(PBMC)，产生IL-1β、IL-6，这两种细胞因子有促进骨质吸收、胶原 合成，参与骨改建等作用。
3 力-电环境诱导骨局部因子产生的机制
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3.1 应力诱导前列腺素产生的机制
研究证明，合适的机械应力可刺激骨细胞产生PGE2。机械刺激作用于骨细胞膜相应受体， 激活胞膜上磷脂酶A2，促进花生四烯酸从胞膜磷脂中释放，进一步氧化生成PGE2。另外， 机械应力还可通过白三烯协同PGE2作用于磷酸肌醇通路，进一步引起胞内一系列生化变化 ，导致促细胞增殖作用[16，17]。
3.2 电磁诱导骨生长因子产生的机制
大量研究表明，各种电刺激可以增加胞液中游离钙离子浓度[23]。钙离子增加可直 接或通过激活钙调蛋白间接激活一些蛋白激酶，进而引起蛋白磷酸化作用改变胞内一系列信 号通路，将刺激信号传递至核内，引起促细胞增殖作用[17]。现在认为，电磁刺激 成骨细胞产生骨生长因子也可能通过这一机制。
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Fitzsimmons[19]根据复合磁场可以增加TE-85细胞内质网45Ca的摄入，以 及提高细胞外Ca2+浓度可增加骨细胞培养基中IGF-Ⅱ浓度推测，复合磁场暴露下，T E-85细胞产生IGF-Ⅱ也存在Ca2+依赖机制。他还指出细胞膜上IGF-Ⅱ受体数目的 增加是受体从细胞间隙转移到细胞膜的结果，这种转移作用也通过增加钙离子转运和磷酸化 作用实现[24]。
维拉帕米是钙离子通道阻滞剂，W-7可抑制活性钙调蛋白的增加。维拉帕米和W-7可抑制电 容耦合电磁场下成骨细胞增殖，而对正常状态下成骨细胞增殖无影响。Zhung[21] 发现培养基中加入维拉帕米和W-7后抑制了电磁场下成骨细胞表达TGF-β1mRNA，这提 示电磁场刺激成骨细胞增殖并表达TGF-β1mRNA都依赖钙-钙调蛋白途径。但是钙离子 载体A23187本身在促进MC3T3-E1细胞株DNA合成所需的相同浓度下，并不诱导TGF-β1 mRNA表达，这表明胞液中钙离子浓度升高在电磁场增加TGF-β1 mRNA表达过程中，只 是一个必要但不是充分的信号。
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近二十多年来，为了更好地利用力-电刺激这一有效治疗手段，学者们一直在探讨力-电环 境下成骨的机制。力-电刺激诱导骨局部因子产生已相继被体外实验所证实，被认为是力- 电 刺激促进骨愈合的机制之一[25]。但应力大小和方式以及电磁场波形、参数的选择 等对刺激效果的影响还不太清楚，有待于进一步研究。
王前(第一军医大学 附属南方医院创伤骨科，广州 510515)
裴国献(第一军医大学 附属南方医院创伤骨科，广州 510515)
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(收稿：1998-12-02), 百拇医药
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Abstract The mechanism for promoting bone formation unde r the mechanical and the electromagnetical fields stimulation is not yet quite c lear. In recent years, it has been found the mechanical and electromagnetical en vironments may induce the osteogenic cells to produce some local bone factors, s uch as prostaglandin E2 (PGE2), insultine-like growth factors-Ⅱ(IGF-Ⅱ), bone morphogenetic protein (BMP) and transforming growth factor β(TGF-β). Th ese factors play an important role in bone formation and remodeling. This articl e introduces current studies on some of these local bone factors under the stimu lation of the mechanical and electromagnetical environments.
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1 骨局部因子在骨形成中的作用
, 百拇医药 骨代谢和骨愈合是受多种因素调节的复杂过程。骨局部因子的调节作用是内在因素之一。前 列腺素(PG)是影响骨代谢的局部因子之一，由成骨细胞产生，临近的骨髓、血管、结缔组织 、与损伤和炎症相关的细胞产生的PG对骨组织也有一定的影响。PG对骨形成和骨吸收均具有 促进和抑制的双重作用。另外，已从骨基质和骨细胞及骨器官培养基中分离出多种骨源性生 长因子(Bone-derived growth factor,BDGF)，如胰岛素样生长因子Ⅰ、Ⅱ(TGF-Ⅰ、Ⅱ) ， β转化生长因子(TGF-β)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，血小板衍生生长因子(PDGF) 以及骨形成蛋白(BMP)。骨细胞培养基中也含上述数种因子，同时还存在造血细胞因子(G-C SF，GM-CSF)。这些骨生长因子有着不同的生物活性，主要包括：丝裂原活性、分化作用、 趋化作用以及溶骨活性。骨细胞产生一定量的骨生长因子贮存于细胞外基质，同时还分泌骨 生长因子作用其相邻的成骨细胞(旁分泌作用)及其自身(自分泌作用)。骨吸收时，基质中的 骨生长因子释放，作为迟缓性旁分泌剂，刺激成骨细胞前体增殖。由此可见，骨局部因子在 成骨中起着重要作用。
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1.1 前列腺素(PG)
前列腺素是花生四烯酸的代谢产物。体外培养的骨细胞主要产生PGE2、PGF2α、PG I2及PGI2的代谢产物6-酮-PGF1α。在骨组织中，PGE2含量很多，PGI2次 之。PG在骨代谢中的作用非常复杂。人们最早研究的是PG的骨吸收活性，PGE2的骨吸收活 性最强，PGI2最弱，外源性PGF2α需通过内源性PGE2才能促进骨吸收。体内研究 表 明，PG是恶性肿瘤高钙血症、牙周病和风湿性关节炎骨丢失的主要原因，关节置换术后的松 动亦与PG有关。PG在骨形成中也发挥重要作用。PGE2促进前成骨细胞增殖，加速体外骨结 节矿化，对成骨细胞DNA和碱性磷酸酶ALP活性，PGE2表现出双相性。低浓度时，PGE2可 促进DNA合成，提高ALP活性。
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Weinreb[3]研究表明，大鼠服用PGE2(6 mg/kg，共服3周)，可显著增加长骨的机 械强度和颅盖骨骨密度，并可诱导骨髓细胞表达早期基因(c-fos、c-jun、egr-1)，促进 骨髓 中骨前体细胞的增殖并向成骨细胞分化。另外PG还可间接通过某些骨生长因子调节骨代谢， 如PGE2可促进IGF-I的合成[4]，PGE1则显著增强重组合人BMP的诱导成骨效应 [5]。
1.2 胰岛素样生长因子(IGF)
现已鉴别出两种IGF，即IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，分别为含有70个和67个氨基酸残基的单链多态 。IGF-Ⅰ可由成骨细胞产生并以自分泌方式刺激成骨细胞增殖和基质合成。IGF-Ⅱ也可被 成骨细胞合成，对成骨细胞的作用与IGF-Ⅰ基本相似，但较弱。人骨基质中IGF-Ⅱ含量是 IGF-Ⅰ的10～15倍。另外，IGF-Ⅰ在体外促进破骨细胞的形成，刺激成熟破骨细胞功能活 性，调节骨吸收，参与骨改建。Andrew等[6]发现人正常骨痂早期肉芽组织形成阶 段，间充质细胞、内皮细胞由IGF-Ⅱ mRNA表达；软骨形成阶段，幼稚软骨细胞成骨细胞均 有IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ mRNA的表达；至骨痂改建阶段，一些破骨细胞也有IGF-Ⅱ mRNA表达 。其中，IGF-Ⅱ mRNA在整个骨折愈合过程中持续表达。最近在犬的截骨延长实验中，发现 骨 痂中IGF-Ⅰ的浓度明显增加，提示IGF-Ⅰ在骨愈合中发挥重要作用[7]。
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1.3 骨形态发生蛋白(BMP)
BMP是一种疏水性酸性糖蛋白，天然提取的BMP很可能是几种不同分子量蛋白的混合物。BMP 的 主要生物学作用是诱导未分化的间充质细胞分化为软骨和骨，即诱导成骨作用。BMP作用无 种属特异性，具有跨种属诱导成骨能力，新骨形成量一般与BMP植入量呈正相关。现已发现B MP-1～13，其中BMP-1～9已获得相应的cDNA克隆，而报道较多的是BMP-2、-4和-7。BM P-2有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨能力。BMP-4的结构和功能均与BMP-2相似，但单 独应用时其成骨作用较BMP-2弱。BMP-7又称成骨蛋白1(OP1)，单独使用即显示很强的成骨 作用。
目前BMP修复骨缺损的主要应用形式是将BMP与各类载体材料复合植入，以达到BMP缓慢释放 ，增强局部诱导成骨作用。如Asahina等[8]将粗提的牛BMP与羟基磷灰石胶原(HC) 组成复合材料，修复成年猴下颌骨6 mm×7 mm×10 mm骨缺损，三个月后发现HC-BMP植 入组新生 骨量明显多于单纯HC植入组。Ijiri等[9]将BMP与A-W玻璃陶瓷复合后植入大鼠皮 下亦有类似发现。
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1.4 β转化生长因子(TGF-β)
TGF-β是一组多功能的多肽，广泛存在于动物正常组织细胞及转化细胞中，以血 小板和骨组织中含量最为丰富。已证明TGF-β可刺激骨膜间充质细胞增殖、分化，促进成 骨和成软骨细胞增生，诱导Ⅰ型胶原、骨桥蛋白(Osteopontin)和骨连接素(Osteonectin)的 合成。新近研究表明，TGF-β可以上调成骨细胞中一种新克隆出的增殖特异基因PROM-1的 表达[10]，进一步证实TGF-β对成骨细胞的增殖调控作用。
Nielsen等[11]在3个月龄的大鼠胫骨骨折线处持续注射4～40 ng/d的TGF-β，40 天后发现骨折线处骨及骨痂横截面积增加，并与剂量呈正相关。Sun等[12]将TGF -β复合载体植入修复兔桡骨中上端1.5厘米缺损，术后12周发现复合植入组有新生骨连接 断端皮质，为板层骨和网状骨，并含早期骨髓腔结构和骨髓成分。单纯载体植入组缺损区仅 为纤维组织填充。
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1.5 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)
bFGF是一类存在于包括骨在内的大多数组织内的多肽。在骨折愈合早期在骨折部位肉芽组织 中就有bFGF基因的表达，以后在骨愈合的各阶段均有恒定的基因表达水平。大鼠每天注 射bFGF刺激皮质骨和松质骨的骨内膜成骨，且骨内膜细胞中的内源性TGF-β含量增加， 说明bFGF刺激骨内膜骨形成的作用部分是TGF-β介导。Yamada[13]将bFGF与明胶 水凝胶渗合，用于修复兔直径为6 mm的颅骨缺损，12周后达完全愈合，而单纯明胶水凝胶 植入未见诱导成骨。bFGF还有促进血管生成作用，促进毛细血管向骨断端和移植物中生长。 将含有BMP的纤维玻璃膜(FCM)复合bFGF植入大鼠背部皮下，2周后与未复合bFGF植入组相比 ，碱性磷酸酶活性提高1.3倍，细胞内钙含量提高3倍，而Ⅱ型胶原合成量减少，认为这与b FGF快速大量促进血管长入FCM，加速成骨过程有关[14]。
1.6 血小板衍生生长因子(PDGF)
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PDGF分子量为28～35KD，主要存在形式为A、B两条多肽链组成的杂二聚体，还存在AA、BB的 均二聚体。PDGF最初由血小板分离出，在骨基质和骨肉瘤细胞中也存在。PDGF可刺激软骨细 胞和成骨细胞增生，促进骨痂中软骨形成和膜内骨化，在骨折后期骨痂中PDGF mRNA表达量 最高。在大鼠颅盖骨培养中，PDGF可促进细胞分裂，胶原及非胶原蛋白合成。将PDGF-BB吸 附于左旋聚乳酸膜用于组织引导再生材料(Guided tissue regeneration,GTR)，修复大鼠颅 盖骨缺损，2周后可达完全骨性愈合[15]。另外，PDGF还可通过刺激前列腺素的合 成而促进鼠颅骨的骨吸收，参与骨改建。
2 力-电环境调节骨局部因子生成的实验研究
2.1 应力与前列腺素E2(PGE2)
骨源性细胞对应力的反应是PG依赖性。牵拉骨源性细胞，剪切应力促进PGE2合成，PGE2 对牵拉骨源性细胞的反应呈三相性。压力负荷引起的合成反应也是PG依赖性，压力负荷可促 进骨细胞合成PGI2，成骨细胞合成PGE2，生成的PG促进细胞中DNA和RNA合成。
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Brighton[16，17]选用单层多聚氨基甲酸乙酯膜作为培养皿基底材料，通过气体动 力加载牵张基底膜，使之产生200、400、1000微应变，加载频率为1 Hz，从而使附着于 膜上的骨细胞间接承受到拉应力的作用。实验发现，400微应变的应力环境中加载15 min、2 4 h和48 h，细胞中的DNA含量明显增加，分化增生活动增强；但胶原纤维、非胶原 蛋白、蛋白多糖的合成，以及ALP活性均有明显降低。同时，测得培养液中PGE2浓度明显 升高，升高的PGE2通过自分泌和旁分泌增强磷酸肌醇信使通路作用，导致成骨细胞增殖、 细胞外成份合成减少。当在培养液中加入PGE2生成抑制剂——消炎痛后，并未减弱拉应力 的促细胞增殖作用，这提示除PGE2外，还存在其他机制参与拉应力诱导成骨细胞增殖。
2.2 电磁与胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)
人、鼠的骨细胞都可产生IGF-Ⅱ，对人、鸡、鼠无血清培养的骨细胞具有促增殖作用。IGF -Ⅱ可很快诱导鼠成骨细胞样细胞中的前肿瘤基因c-fos表达，后者可能在诱导成骨细胞的 增殖中具有重要作用。此外，IGF-Ⅱ还具有促分化作用，可刺激鼠成骨细胞株MC-3T3-E1 合成Ⅰ型胶原，还可在24 h内增加培养的非转化正常人骨细胞合成2-4倍的原胶原mRNA。 由此可见，IGF-Ⅱ在骨代谢中的重要作用。
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Fitzsimmons[1，2]发现电磁场在刺激成骨细胞增殖的同时不仅可诱导成骨细胞释 放IGF-Ⅱ到培养基，而且可增加细胞膜上IGF-Ⅱ受体的数目，两者共同作用促进细胞增殖 。将鸡胚颅盖骨组织暴露于低幅电容耦合电磁场中(培养基中电压梯度为10-7v/cm)， 发现骨细胞增殖不仅有频率依赖性，还依赖于培养基中丝裂原活性。另外，骨细胞增殖和丝 裂原活性与培养基中碱性磷酸酶浓度呈正相关，表明丝裂原是由定向分化的成骨细胞产生。 为明确丝裂原性质，他们将人骨肉瘤细胞株TE-85置于相同电磁场中，用Nortern印迹杂交 技术检测培养基中IGF-Ⅱ mRNA表达水平，结果4.8 kb和7.0 kb的转录产物显著增加，尤 其4.8 kb转录产物在暴露30 min是对照组的4.6倍。而IGF-Ⅰ mRNA低于检测水平。这提 示引起细胞增殖的丝裂原主要是IGF-Ⅱ。
后来，他们改用复合磁场(200 mG的静止磁场复合峰值为400 mG的间变磁场)作用于TE-85细 胞株同样发现细胞增殖以及IGF-Ⅱ水平增加。用抗IGF-Ⅱ单克隆抗体可以阻断复合磁场的 促细胞增殖作用[18]。进一步证实电磁场诱导生成的IGF-Ⅱ促进了细胞增殖。另 外，暴露相同复合磁场中，TE-85细胞膜上IGF-Ⅱ受体数也增加，且与受体解离常数显著 增加有关[19]。
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2.3 电磁与骨形成蛋白(BMP)
BMP能诱导未分化的间充质细胞经过趋化、分裂、分化三个环节不可逆分化为软骨细胞和成 骨细胞，诱导新骨形成。但对已分化成熟的骨和软骨细胞基本无促增殖作用。
Nagai[20]利用脉冲电磁场研究其对发育中鸡胚颅盖骨BMP-mRNA表达的影响。这种 脉冲电磁场临床上证实有明显刺激骨愈合作用，其共同点有：双相准方波，每个脉冲的正相 脉冲宽度为200 μs，反向脉冲为24 μs，每个脉冲群持续5 ms，重复频率为15 Hz。他们 将鸡胚置于脉冲电磁场中培养，用狭线杂交技术(Slot-blot)检测颅盖骨组织BMP-2 mRNA 、BMP-4 mRNA的表达水平，结果发现与对照组相比，培育15 d和17 d的鸡胚颅盖骨组织BMP -2 mRNA水平分别增加2.7倍和1.6倍，BMP-4 mRNA分别增加1.6倍和1.5倍。而培育19 d的颅盖骨中两种mRNA与对照组无明显差异。表明脉冲电磁场可以刺激鸡胚颅盖骨表达BMP -2、BMP-4，且早期鸡胚颅盖骨更为敏感。另外，他们指出，脉冲电磁场的靶细胞可能是 颅盖骨中的骨生成细胞。
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2.4 电磁与β转化生长因子(TGF-β)
目前已鉴定出5种不同分子类型的TGF-β，即TGF-β1～TGF-β5。TGF-β具有促细胞增 殖、调节细胞分化、促细胞外基质合成和调节机体免疫的作用。
Zhung等[21]将MC3T3-E1成骨细胞株暴露于60 Hz的正弦电容耦合电场中，每天刺 激一次，每次30 min，观察了成骨细胞增殖和TGF-β1 mRNA水平变化情况。用体外扩增 逆转录PCR技术检测TGF-β1 mRNA水平，发现电场暴露2 h以上，TGF-β1 mRNA水平明显 高 于对照组。但抗TGF-β1抗体并没有阻断电场下成骨细胞的增殖。然而这并不说明TGF-β1 在体内不参与电刺激成骨，因为TGF-β1在体内的生物效应并不完全在体外重现。如TGF- β1在体内可促进成骨细胞在骨折端聚集。另外，TGF-β可诱导其他生长因子表达，包括bF GF、PDGF-AA、PDGF-BB和M-CSF等，TGF-β也可能通过它们对骨代谢发挥作用。
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2.5 电磁与其它局部因子
PDGF和bFGF在局部成骨中发挥着重要作用，但目前未见有关电磁诱导骨生成细胞产生PDGF和 bFGF的报道，相信探讨电磁促进成骨过程中是否有PDGF和bFGF等骨生长因子产生，将在今后 电磁成骨基础研究中逐渐展开。
来源于造血系统细胞的一些因子也可影响骨重建，如白介素1、3、6(IL-1、3、6)、肿瘤坏 死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等。Cossarizza[22]对脉冲电磁场作 用于免疫系统细胞产生多种细胞因子作了多年研究，发现这些因子不光作用于免疫系统细胞 ， 还广泛作用于神经和内分泌细胞、软骨细胞、成纤维细胞和骨细胞等。其中脉冲电磁场作用 于人周围血单核细胞(PBMC)，产生IL-1β、IL-6，这两种细胞因子有促进骨质吸收、胶原 合成，参与骨改建等作用。
3 力-电环境诱导骨局部因子产生的机制
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3.1 应力诱导前列腺素产生的机制
研究证明，合适的机械应力可刺激骨细胞产生PGE2。机械刺激作用于骨细胞膜相应受体， 激活胞膜上磷脂酶A2，促进花生四烯酸从胞膜磷脂中释放，进一步氧化生成PGE2。另外， 机械应力还可通过白三烯协同PGE2作用于磷酸肌醇通路，进一步引起胞内一系列生化变化 ，导致促细胞增殖作用[16，17]。
3.2 电磁诱导骨生长因子产生的机制
大量研究表明，各种电刺激可以增加胞液中游离钙离子浓度[23]。钙离子增加可直 接或通过激活钙调蛋白间接激活一些蛋白激酶，进而引起蛋白磷酸化作用改变胞内一系列信 号通路，将刺激信号传递至核内，引起促细胞增殖作用[17]。现在认为，电磁刺激 成骨细胞产生骨生长因子也可能通过这一机制。
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Fitzsimmons[19]根据复合磁场可以增加TE-85细胞内质网45Ca的摄入，以 及提高细胞外Ca2+浓度可增加骨细胞培养基中IGF-Ⅱ浓度推测，复合磁场暴露下，T E-85细胞产生IGF-Ⅱ也存在Ca2+依赖机制。他还指出细胞膜上IGF-Ⅱ受体数目的 增加是受体从细胞间隙转移到细胞膜的结果，这种转移作用也通过增加钙离子转运和磷酸化 作用实现[24]。
维拉帕米是钙离子通道阻滞剂，W-7可抑制活性钙调蛋白的增加。维拉帕米和W-7可抑制电 容耦合电磁场下成骨细胞增殖，而对正常状态下成骨细胞增殖无影响。Zhung[21] 发现培养基中加入维拉帕米和W-7后抑制了电磁场下成骨细胞表达TGF-β1mRNA，这提 示电磁场刺激成骨细胞增殖并表达TGF-β1mRNA都依赖钙-钙调蛋白途径。但是钙离子 载体A23187本身在促进MC3T3-E1细胞株DNA合成所需的相同浓度下，并不诱导TGF-β1 mRNA表达，这表明胞液中钙离子浓度升高在电磁场增加TGF-β1 mRNA表达过程中，只 是一个必要但不是充分的信号。
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近二十多年来，为了更好地利用力-电刺激这一有效治疗手段，学者们一直在探讨力-电环 境下成骨的机制。力-电刺激诱导骨局部因子产生已相继被体外实验所证实，被认为是力- 电 刺激促进骨愈合的机制之一[25]。但应力大小和方式以及电磁场波形、参数的选择 等对刺激效果的影响还不太清楚，有待于进一步研究。
王前(第一军医大学 附属南方医院创伤骨科，广州 510515)
裴国献(第一军医大学 附属南方医院创伤骨科，广州 510515)
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(收稿：1998-12-02), 百拇医药