快速减压后大鼠肺组织自由基含量的变化
作者：李慈 倪大智 朱祥祺 陈士明 刘景昌 严小敏
单位：李慈 倪大智 朱祥祺 刘景昌(海军医学研究所，上海 200433)；陈士明 严小敏(复旦大学，上海 200433)
关键词：快速减压；维生素C；自由基；肺
生物医学工程学杂志000231 摘要 采用EPR波谱仪测定肺组织内自由基变 化以评价快速减压对肺的损伤。把SD大鼠在0.5MPa空气中暴露60 min，用1 min匀速 减至常压，然后分别在45 min和90 min时腹腔放血处死(处死前25 min注入0.05 M的PBN，0 .5 ml/100 g)，取肺0.75 g匀浆后用EPR波谱仪测定维生素C自由基(
)强度。结 果显示减压后45 min肺组织内强度无明显变化，减压9 0 min组的肺组织内强度明显增高(P<0.05)。表明快速减压可引起肺组织自由基增加。
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Alteration of Free Radical Generation in Pulmonary Tissue
after Quick Decompression
Li Ci Ni Dazhi Zhu Xiangqi Liu Jingchang
(Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433)
Chen Shiming Yan Xiaomin
(Fudan University, Shanghai 200433)
Abstract The purpose of this experiment was to evaluate decompression-induced pulmonary injury by means of measurement of ascorbate fre e radical () alteration in pulmonary tissue of the rats which experienc ed rapid decompression.29 male S-D rats were divided into 4 groups: A was execu ted at 45 min post-decompression; B was control for A; C was executed at 90 mi n;D was ontrol for C.Group A and group C were to compress up to 0.5 MPa(air) and stay f or 60 min, then were decompressed smoothly to normbaric in 1 min. The 0.05M N-t ert-butyl-alpha-phenylnitrone (PBN) was given at 20 min after completion of d ecompression (groups A and B) or at 65 min (groups C and D). At 25 min after PBN injection the animals were killed by cutting arteria coeliaca, and 0.75 g pulmo nary tissues were taken. These tissues were homogenized for electron paramagneti c resonance (EPR) assay. The results demonstrated that the ascorbate free radica l () signals were obtained at all samples. The intensity of signals mea sured in group C rose markedly (P<0.05) and that in group A was close to co ntrol's. So it can be concluded that rapid decompression would increase the gene ration of free radical in lung.
, 百拇医药
Key words Quick decompression Ascorbic acid Free radical Lung
1 引言
高气压暴露后需要一个缓慢的安全减压过程，快速减压可以引起机体组织不同程 度的损伤。在以往的实验中，曾注意到快速减压的小型猪有肺扩张、肺泡壁变薄和间隔变少 且有断裂等现象。这些现象是因为肺发生极度膨胀而引起，其损伤的机理是机械力的作用 [1]。此外，人或动物在快速减压后，更常见且十分重要的问题是，体内超过正常范 围的溶解相气体(主要是在高压条件下溶入体内的惰性气体，如氮气和氦气)变成游离相，从 而聚集成气泡。气泡最终由肺捕捉并清除，因此，肺是这些气泡的靶器官。可以推测，在大 量气泡的持续作用下，肺组织也可能会受到损伤。本实验拟用电子顺磁共振技术(Electron paramagnatic resonance, EPR)直接测定大鼠肺组织内的自由基变化，以评价快速减压对肺 的影响。
, 百拇医药
2 材料和方法
(1)雄性Sprague-Dawley(S-D)大鼠29只(购自上海计划生育研 究所)，体重190～ 310 g，平均241.8 g。动物随机分成：A组(n＝5)，减压后45 min处死；B组(n=9) ，为A组的对照组；C组(n=10)，减压后90 min处死；D组(n=5)，为C组的对照组。A 组和B组、C组和D组分别是同一批动物，实验前动物至少先在本所饲养一周。
(2)A组和C组动物在0.05m3加压舱内，用压缩空气使舱压升至0.5 MPa ，在这个压力下停 留60min后，用1 min匀速减至常压。其间每隔15 min通风1次，每次1 min。对照动物不作 加压处理。
(3)减压至常压后20 min(A组)或65 min(C组)，注入0.05 M的PBN(购自Si gma公司)，0.5 m l/100 g,i.p.25 min后，用20%Urethane麻醉，0.5 ml/100 g,i.p.对照组作同样处理，B组 注入时间同A组，D组同C组。麻醉后腹腔放血处死。立即取出0.75 g肺组织，加入1 ml生理 盐水匀浆。650 g离心5 min，取上清液装满60 μl扁平玻璃管，用EPR波谱仪(德国Bruker公 司，ER200D-SRC型)测定自由基信号。测试条件为：MF＝12.5kHz，MA＝1.25G，SP＝10 m W，SF＝9.81GHz。
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(4)数据用t检验处理。
3 结果
在四组动物的肺标本中，都测出了一致的EPR谱型，其谱线为双峰型(见图1，图2) 。由于所有的谱型都相同，自由基的相对强度(下称强度)以波谱的最大波幅(mm)来表示。
图1 对照组大鼠肺组织内
的EPR双峰谱型(3号动物)
Fig 1 The ascorbate radical doublet EPR signal in control group
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图2 减压后90min大鼠肺组织内的EPR双峰谱型(5号动物)
Fig 2 The ascorbate radical doublet EPR signal in rat at 90 min post-dec ompression
B组和D组肺组织自由基强度各为24.29±6.34和24.30±4.63，两组间无明显差异( P>0.05)。表示这两批动物的基础条件相对一致。
表1列出了各组的强度。结果显示，减压45 min组的动物肺组织自由基强度无明显改变(P >0.05)，90 min组则明显增加(P<0.05)且明显高于45 min组(P<0.05)。
4 讨论
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根据本研究室以往的结果，高压氧条件下肺的损伤都有自由基的参与[2]。而抗坏血酸(Vitamine C)是体内一种重要的自由基清 除剂。它主要由食物供给，水溶性，易吸收，不仅存在于细胞内，也存在于细胞外，因此它 可在细胞内外发生作用，其机制如下：[3]
表1 各组动物肺组织内自由基强度(mm,
±s)
Table 1 Intensity of free radical in the lungs of various groups Group
Cases
Intensity
A
, 百拇医药
5
21.60±
6.07
B
9
24.29±
6.34
C
10
31.42±
6.40*
D
5
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24.30±
4.63**
*A vs C,P<0.05；**C vs D,P<0.05
根据的结构，它产生的EPR谱型应为双峰谱线，每 个峰还有进一步的超精细结构(H yperfine spitting,Hfs)，其参数为：g值＝2.00518，aH4＝1.76G，aH6(2) ＝0.19G，aH5＝0.07G[4]。本实验是快速减压后在大鼠肺组织匀浆液中测 到双峰自由基信号，波谱参数为：g值＝2.0054，aH＝1.8G。由于本实验样品的信 号 较弱，用了1.25G的调制幅度，所以没有观测到进一步的超精细结构。这与Daniei等[ 5]的实验结果一致，证实这就是的PBN加合物信号 。Buettner等 [6]对作了能量学分析，认为信号强度可表示一个系统中发生氧化作用的强烈 程度。因此，快速减压后90 min时明显增加，而在45 min时增加不明显 ，说明快速减压可以引起肺组织氧化作用加强，这种作用有一个时间过程。关于快速减压引 起 体内自由基变化，尤其是肺内自由基变化的文献报道尚少。Daniei等在研究氧中毒时，偶然 发现对照组大鼠(0.5MPa，呼吸空气30 min后快速处死)中，有1只鼠的脑脂质提取物中出现信号，虽然他们并没有指出肺中的自由基情况，但发 现这只鼠的肺、心和肝等处 有泡沫状血，并且认为减压引起的气栓可广泛影响身体各部位的组织。高气压医学的研究认 为，快速减压引起的肺损伤有两种情况，一是减压过程中气道内气体快速极度膨胀，造成肺 的机械性损伤。这种损伤一般发生较快，而在减压后45 min时，已与此种情况无关。另一种 情况可能是肺损伤的主要原因。减压引起的气泡最终要集中到肺组织，肺起到屏障作用，使 气泡陷在肺部而不至于进入全身循环造成严重的动脉栓塞。Chikuda等[7]用栓子模 型观察到肺血管栓塞后肺血管阻力增大，肺顺应性下降。结合实验中观察到的肺组织自由基 增加，可以判断，这种肺损伤可能与肺组织内自由基的作用有关。目前还不清楚肺循环障碍 引起自由基增殖的机理，初步推测可能是通过下述过程起作用：气栓使血流变慢，肺组织的 循环变差，同时气泡还直接损伤血管内皮细胞。这些都能使血小板作出反应[8]， 从而释放出许多活性物质，其中包括白细胞趋化因子，使大量白细胞集中在肺内，肺组织的 自由基增加可能主要来源于这些白细胞[9]。而这些变化是一个累积过程，需要一 定的气泡量和必要的时间。
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参考文献
1，朱祥祺，程国光.增压后快速减压引起的动物肺损伤.中国应用生 理学杂志，1997；13(2)∶280
2，刘景昌主编.高压氧医学的理论与新技术.北京：军事医学科学出版社，199 8∶11-27
3，莫简主编.医用自由基生物学导论.北京：人民卫生出版社，1989∶51-52
4，Laroff GR, Fessenden RW, Schuler RH. The electron spin resonance spectrum of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J Am Chem Soc.1972;94(26)∶9062
, 百拇医药
5，Daniei FC, Joell NK, William AF.Free radical generation in the br ain precedes hyperbaric oxygen-induced convulsions. Free Radical Biology and Me dicine.1993; 13∶101
6，Buettner GR and Jurkiewige BA. Ascorbate Free Radical as a Marker of Oxidative Stress:an EPR Study. Free Radical Biology and Medicine 1993; 14 ∶49
7，Chikuda K, Nakahara K, Binder A et al.Venous air emboli in s heep:reversible increase in lung microvascular permeability. J Appl Physiol:Resp irat Environ Exercise Physiol,1981;51∶87
, 百拇医药
8，Holmsen H. Prostaglanding and platlete function. In:Mechanisms of hemostasis and thrombosis, 1978;pp59～82.Ed CH Milke and R Rodvien, Miami:Sympos is Specialists for Year Book Medical
9，Weiss SJ, King G, Lobuglio AP. Evidence for hydroxyl radical gene ration by human monocytes. J Clin Imest.1977;6∶370
(收稿：1998-10-30 修回：1999-05-04), 百拇医药
单位：李慈 倪大智 朱祥祺 刘景昌(海军医学研究所，上海 200433)；陈士明 严小敏(复旦大学，上海 200433)
关键词：快速减压；维生素C；自由基；肺
生物医学工程学杂志000231 摘要 采用EPR波谱仪测定肺组织内自由基变 化以评价快速减压对肺的损伤。把SD大鼠在0.5MPa空气中暴露60 min，用1 min匀速 减至常压，然后分别在45 min和90 min时腹腔放血处死(处死前25 min注入0.05 M的PBN，0 .5 ml/100 g)，取肺0.75 g匀浆后用EPR波谱仪测定维生素C自由基(
)强度。结 果显示减压后45 min肺组织内强度无明显变化，减压9 0 min组的肺组织内强度明显增高(P<0.05)。表明快速减压可引起肺组织自由基增加。, http://www.100md.com
Alteration of Free Radical Generation in Pulmonary Tissue
after Quick Decompression
Li Ci Ni Dazhi Zhu Xiangqi Liu Jingchang
(Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433)
Chen Shiming Yan Xiaomin
(Fudan University, Shanghai 200433)
Abstract The purpose of this experiment was to evaluate decompression-induced pulmonary injury by means of measurement of ascorbate fre e radical (
) alteration in pulmonary tissue of the rats which experienc ed rapid decompression.29 male S-D rats were divided into 4 groups: A was execu ted at 45 min post-decompression; B was control for A; C was executed at 90 mi n;D was ontrol for C.Group A and group C were to compress up to 0.5 MPa(air) and stay f or 60 min, then were decompressed smoothly to normbaric in 1 min. The 0.05M N-t ert-butyl-alpha-phenylnitrone (PBN) was given at 20 min after completion of d ecompression (groups A and B) or at 65 min (groups C and D). At 25 min after PBN injection the animals were killed by cutting arteria coeliaca, and 0.75 g pulmo nary tissues were taken. These tissues were homogenized for electron paramagneti c resonance (EPR) assay. The results demonstrated that the ascorbate free radica l () signals were obtained at all samples. The intensity of signals mea sured in group C rose markedly (P<0.05) and that in group A was close to co ntrol's. So it can be concluded that rapid decompression would increase the gene ration of free radical in lung., 百拇医药
Key words Quick decompression Ascorbic acid Free radical Lung
1 引言
高气压暴露后需要一个缓慢的安全减压过程，快速减压可以引起机体组织不同程 度的损伤。在以往的实验中，曾注意到快速减压的小型猪有肺扩张、肺泡壁变薄和间隔变少 且有断裂等现象。这些现象是因为肺发生极度膨胀而引起，其损伤的机理是机械力的作用 [1]。此外，人或动物在快速减压后，更常见且十分重要的问题是，体内超过正常范 围的溶解相气体(主要是在高压条件下溶入体内的惰性气体，如氮气和氦气)变成游离相，从 而聚集成气泡。气泡最终由肺捕捉并清除，因此，肺是这些气泡的靶器官。可以推测，在大 量气泡的持续作用下，肺组织也可能会受到损伤。本实验拟用电子顺磁共振技术(Electron paramagnatic resonance, EPR)直接测定大鼠肺组织内的自由基变化，以评价快速减压对肺 的影响。
, 百拇医药
2 材料和方法
(1)雄性Sprague-Dawley(S-D)大鼠29只(购自上海计划生育研 究所)，体重190～ 310 g，平均241.8 g。动物随机分成：A组(n＝5)，减压后45 min处死；B组(n=9) ，为A组的对照组；C组(n=10)，减压后90 min处死；D组(n=5)，为C组的对照组。A 组和B组、C组和D组分别是同一批动物，实验前动物至少先在本所饲养一周。
(2)A组和C组动物在0.05m3加压舱内，用压缩空气使舱压升至0.5 MPa ，在这个压力下停 留60min后，用1 min匀速减至常压。其间每隔15 min通风1次，每次1 min。对照动物不作 加压处理。
(3)减压至常压后20 min(A组)或65 min(C组)，注入0.05 M的PBN(购自Si gma公司)，0.5 m l/100 g,i.p.25 min后，用20%Urethane麻醉，0.5 ml/100 g,i.p.对照组作同样处理，B组 注入时间同A组，D组同C组。麻醉后腹腔放血处死。立即取出0.75 g肺组织，加入1 ml生理 盐水匀浆。650 g离心5 min，取上清液装满60 μl扁平玻璃管，用EPR波谱仪(德国Bruker公 司，ER200D-SRC型)测定自由基信号。测试条件为：MF＝12.5kHz，MA＝1.25G，SP＝10 m W，SF＝9.81GHz。
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(4)数据用t检验处理。
3 结果
在四组动物的肺标本中，都测出了一致的EPR谱型，其谱线为双峰型(见图1，图2) 。由于所有的谱型都相同，自由基的相对强度(下称强度)以波谱的最大波幅(mm)来表示。
图1 对照组大鼠肺组织内
的EPR双峰谱型(3号动物)Fig 1 The ascorbate radical doublet EPR signal in control group
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图2 减压后90min大鼠肺组织内
的EPR双峰谱型(5号动物)Fig 2 The ascorbate radical doublet EPR signal in rat at 90 min post-dec ompression
B组和D组肺组织自由基强度各为24.29±6.34和24.30±4.63，两组间无明显差异( P>0.05)。表示这两批动物的基础条件相对一致。
表1列出了各组的强度。结果显示，减压45 min组的动物肺组织自由基强度无明显改变(P >0.05)，90 min组则明显增加(P<0.05)且明显高于45 min组(P<0.05)。
4 讨论
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根据本研究室以往的结果，高压氧条件下肺的损伤都有自由基的参与[2]。而抗坏血酸(Vitamine C)是体内一种重要的自由基清 除剂。它主要由食物供给，水溶性，易吸收，不仅存在于细胞内，也存在于细胞外，因此它 可在细胞内外发生作用，其机制如下：[3]
表1 各组动物肺组织内自由基强度(mm,
±s)Table 1 Intensity of free radical in the lungs of various groups Group
Cases
Intensity
A
, 百拇医药
5
21.60±
6.07
B
9
24.29±
6.34
C
10
31.42±
6.40*
D
5
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24.30±
4.63**
*A vs C,P<0.05；**C vs D,P<0.05
根据
的结构，它产生的EPR谱型应为双峰谱线，每 个峰还有进一步的超精细结构(H yperfine spitting,Hfs)，其参数为：g值＝2.00518，aH4＝1.76G，aH6(2) ＝0.19G，aH5＝0.07G[4]。本实验是快速减压后在大鼠肺组织匀浆液中测 到双峰自由基信号，波谱参数为：g值＝2.0054，aH＝1.8G。由于本实验样品的信 号 较弱，用了1.25G的调制幅度，所以没有观测到进一步的超精细结构。这与Daniei等[ 5]的实验结果一致，证实这就是的PBN加合物信号 。Buettner等 [6]对作了能量学分析，认为信号强度可表示一个系统中发生氧化作用的强烈 程度。因此，快速减压后90 min时明显增加，而在45 min时增加不明显 ，说明快速减压可以引起肺组织氧化作用加强，这种作用有一个时间过程。关于快速减压引 起 体内自由基变化，尤其是肺内自由基变化的文献报道尚少。Daniei等在研究氧中毒时，偶然 发现对照组大鼠(0.5MPa，呼吸空气30 min后快速处死)中，有1只鼠的脑脂质提取物中出现信号，虽然他们并没有指出肺中的自由基情况，但发 现这只鼠的肺、心和肝等处 有泡沫状血，并且认为减压引起的气栓可广泛影响身体各部位的组织。高气压医学的研究认 为，快速减压引起的肺损伤有两种情况，一是减压过程中气道内气体快速极度膨胀，造成肺 的机械性损伤。这种损伤一般发生较快，而在减压后45 min时，已与此种情况无关。另一种 情况可能是肺损伤的主要原因。减压引起的气泡最终要集中到肺组织，肺起到屏障作用，使 气泡陷在肺部而不至于进入全身循环造成严重的动脉栓塞。Chikuda等[7]用栓子模 型观察到肺血管栓塞后肺血管阻力增大，肺顺应性下降。结合实验中观察到的肺组织自由基 增加，可以判断，这种肺损伤可能与肺组织内自由基的作用有关。目前还不清楚肺循环障碍 引起自由基增殖的机理，初步推测可能是通过下述过程起作用：气栓使血流变慢，肺组织的 循环变差，同时气泡还直接损伤血管内皮细胞。这些都能使血小板作出反应[8]， 从而释放出许多活性物质，其中包括白细胞趋化因子，使大量白细胞集中在肺内，肺组织的 自由基增加可能主要来源于这些白细胞[9]。而这些变化是一个累积过程，需要一 定的气泡量和必要的时间。, http://www.100md.com
参考文献
1，朱祥祺，程国光.增压后快速减压引起的动物肺损伤.中国应用生 理学杂志，1997；13(2)∶280
2，刘景昌主编.高压氧医学的理论与新技术.北京：军事医学科学出版社，199 8∶11-27
3，莫简主编.医用自由基生物学导论.北京：人民卫生出版社，1989∶51-52
4，Laroff GR, Fessenden RW, Schuler RH. The electron spin resonance spectrum of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J Am Chem Soc.1972;94(26)∶9062
, 百拇医药
5，Daniei FC, Joell NK, William AF.Free radical generation in the br ain precedes hyperbaric oxygen-induced convulsions. Free Radical Biology and Me dicine.1993; 13∶101
6，Buettner GR and Jurkiewige BA. Ascorbate Free Radical as a Marker of Oxidative Stress:an EPR Study. Free Radical Biology and Medicine 1993; 14 ∶49
7，Chikuda K, Nakahara K, Binder A et al.Venous air emboli in s heep:reversible increase in lung microvascular permeability. J Appl Physiol:Resp irat Environ Exercise Physiol,1981;51∶87
, 百拇医药
8，Holmsen H. Prostaglanding and platlete function. In:Mechanisms of hemostasis and thrombosis, 1978;pp59～82.Ed CH Milke and R Rodvien, Miami:Sympos is Specialists for Year Book Medical
9，Weiss SJ, King G, Lobuglio AP. Evidence for hydroxyl radical gene ration by human monocytes. J Clin Imest.1977;6∶370
(收稿：1998-10-30 修回：1999-05-04), 百拇医药