瘦素受体基因Gln223Arg变异与上海地区糖尿病患者代谢紊乱及合并高血压的关系
作者：郑以漫 项坤三 张蓉 贾伟平 陆俊茜 唐峻岭
单位：200233 上海市第六人民医院内分泌代谢科、医学遗传研究室
关键词：
中华内科杂志990309 【摘要】 目的 研究瘦素受体基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病代谢紊乱及其合并高血压的关系。方法 运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法测定无亲缘关系，且有完整临床资料的359例上海地区汉人的瘦素受体基因Gln223Arg变异的基因型(包括193例糖耐量正常者及166例Ⅱ型糖尿病患者)。局部体脂分布参数由核磁共振仪测定。结果 Ⅱ型糖尿病不同性别、不同瘦素受体基因Gln223Arg变异的高血压合并频率比较发现,瘦素受体基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关(P=0.008)。“A”等位基因与Ⅱ型糖尿病男性较高的收缩压(P=0.0026)及舒张压(P=0.0084)相关。logistic回归分析证实，该基因变异是Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的独立风险因子(P=0.0031),且主要与收缩压相关(P=0.0054)。携带“A”等位基因的Ⅱ型糖尿病男性其高血压发生的比数比(OR)为2.825(95%可信限为1.418、5.627)。结论 瘦素受体基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关,且主要表现与收缩压相关。
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Association of Gln223Arg variant in leptin receptor gene with metabolic abnormalities and hypertension in type Ⅱ diabetes mellitus in Shanghai “Han” population ZHENG Yiman, XIANG Kunsan, ZHANG Rong,et al. Department of Endocrinology and Metabolism, Laboratory of Medical Genetics, Shanghai Sixth People′s Hospital,Shanghai 200233
【Abstract】 Objective To investigate the association of Gln223Arg variant in leptin receptor gene with metabolic abnormalities and hypertension in type Ⅱ diabetes mellitus. Methods The genotypes of Gln223Arg variant in leptin receptor gene were determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms (PCR-RFLP) assay in 359 unrelated subjects of Shanghai “Han” population (including 193 subjects with normal glucose tolerance and 166 type Ⅱ diabetic patients). The clinical data were also analyzed. The parameters for regional adipose tissue distribution were measured by magnetic resonance imaging (MRI). Results Significant difference of genotype frequency of Gln223Arg variant in leptin receptor gene was observed between hypertensive and normotensive type Ⅱ diabetic male patients (P=0.008). “A” allele was associated with increased systolic blood pressure (P=0.0026) and diastolic blood pressure (P=0.0084) in type Ⅱ diabetic male paitents. Logistic regression analysis showed that this gene variant was an independent risk factor of type Ⅱ diabetic male patients accompanied with hypertension (P=0.0031),and it was associated with elevation of systolic blood pressure (P=0.0054) . The odds ratio of hypertension in type Ⅱ diabetic male patients with “A” allele was 2.825 (95% CI 1.418,5.627). Conclusion Gln223Arg variant in leptin receptor gene is associated with hypertension in type Ⅱ diabetic male patients, especially with elevation of systolic blood pressure.
, 百拇医药
【Key words】 Diabetes mellitus, non-insulin dependent Hypertension Gene Receptor, leptin
自1994年瘦素(leptin)基因被定位克隆以来,在体脂及能量代谢的分子调控机制研究领域取得了突破性进展[1]。瘦素受体(leptin receptor,Lepr)作为瘦素调节机体摄食及能量代谢的信号传递中介备受关注。Lepr属细胞因子受体超家族，编码基因位于1p31,转录后已知有5种(a～e)拼接异型(spliced isoform)。除e拼接异型外,其余4种均含有单一跨膜结构,通过Janus激酶-信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription proteins,STATs)途径促进细胞内基因的转录,参与体脂恒定的调节[2]。肥胖、Ⅱ型糖尿病、高血压及脂质代谢紊乱是一类具有共同遗传背景的复杂病,它们常相伴发生,称之为“多发代谢综合征”(multiple metabolic syndrome)或“X综合征”。目前国际上对Lepr基因与疾病的关系研究刚刚起步,以下就该基因与中国人Ⅱ型糖尿病相关代谢紊乱的关系进行研究。
, 百拇医药
对象与方法
一、研究对象
359例无亲缘关系的上海地区汉族人,据1997年美国糖尿病学会(ADA)推荐的糖尿病诊断及分型标准分组：(1)糖耐量正常组(NGT):193例,男84例,女109例,年龄(53.0±11.7)岁,体重指数(BMI)为(25.61±4.33) kg/m2;(2)Ⅱ型糖尿病组(Ⅱ型DM):166例,男75例,女91例,年龄(56.4±9.7)岁,BMI(26.76±3.67)kg/m2。各组尚根据1995年WHO标准以BMI 25 kg/m2作为切割点分为正常体重组及超重组。高血压按WHO诊断标准。
二、临床资料
1.体脂含量与分布：(1)BMI：脱鞋及穿内衣测身高及体重,BMI=体重(kg)/身高的平方(m2)。(2)腹部内脏脂肪(VA),腹部皮下脂肪(SA)以及股部皮下脂肪(FA)面积: 用日本岛津SMT-100型核磁共振仪测定,病人取水平仰卧位,腹部扫描平面为L4～L5间, 股部扫描平面为髂棘至膝关节中点处,机配软件进行面积计算。
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2.糖、脂代谢及激素测定：研究对象进行75克葡萄糖耐量试验,并于0、30、60、120及180分钟分别测血胰岛素(放免法)、C肽(放免法)及葡萄糖(酶法);尚定脂代谢谱:总胆固醇(TC,酶法),甘油三脂(TG,酶法),高密度及低密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C及LDL-C,硫酸葡聚糖-锰沉淀法及公式计算)。
三、Lepr基因Gln223Arg变异分析
常规苯酚/氯仿法抽提外周血基因组DNA, 以0.1 μg DNA为模板在反应容积30 μl内进行聚合酶链反应(PCR)扩增,引物分别为[3]:上游引物5'-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATGA-3', 下游引物5'-GCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT-3'(由美国Cyber Syn公司合成),反应条件:94℃预变性5分钟;94℃变性1分钟,55℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,共30循环;最后进一步延伸72℃10分钟, 反应在DNA热循环仪中进行(美国Perkin-Elmer公司480型),扩增产物440 bp,经2%琼脂糖电泳确认扩增结果后,继以限制性内切酶MspI(美国Promega 公司)在37℃酶解PCR 产物12小时,经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(29:1)分离酶解产物片段,电压150 V,1.5小时,溴化乙锭染色后紫外光下观察结果:PCR产物可被MspI 酶解为两个片段300 bp带及140 bp带。Gln223纯合子(AA)电泳带型仅440 bp带; Arg223纯合子(GG)电泳带型为300 bp及140 bp带;Gln223/Arg223杂合子(GA)电泳带型为440 bp带、300 bp带及140 bp带(图1)。
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图1 瘦素受体基因Gln223Arg变异电泳结果 四、统计学分析
以Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性,运用基因计数法计算各组基因频率及等位基因频率。由于AA基因型频率仅为0.011,故将基因型分为G组(GG基因型)及A组(GA及AA基因型),数据以
±s表示，各组间临床变量比较用t检验。运用logistic 回归分析Lepr基因型的独立相关变量及糖尿病合并高血压的独立风险因子, 并计算比数比(odds ratio，OR)及其95%可信限。结 果
一、上海地区汉人Lepr基因Gln223Arg变异(第668位核苷酸A→G变异)的频率分布
在90例正常糖耐量且非肥胖(BMI<25 kg/m2)的上海地区汉人中,GG、GA及AA基因频率分别为0.789、0.200及0.011;G及A等位基因频率分别为0.889及0.111,基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。此与文献报道的日本人频率(G及A等位基因频率分别为0.838及0.162)相近似(P=0.240)[3];而与白种人频率[4](G及A等位基因频率分别为0.390及0.610)及Pima印地安人的频率[5](G及A等位基因频率分别为0.667及0.333)差异具有显著性(P值均为0.000)。
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二、Lepr基因Gln223Arg变异频率与Ⅱ型糖尿病及其合并高血压的关系
在NGT组(193例)中,GG基因型频率为0.767(148例),GA及AA基因型频率为0.233(45例);而在Ⅱ型糖尿病组(166例)中,GG基因型频率为0.795(132例),GA及AA基因型频率为0.205(34例);两组比较差异无显著性(P=0.526),说明Lepr基因Gln223Arg变异与上海地区汉人Ⅱ型糖尿病无显著相关性。但是在Ⅱ型糖尿病组(166例)中发现，Lepr基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病合并高血压相关(P=0.046),进一步按性别分组发现，该基因变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关(P=0.008);而与Ⅱ型糖尿病女性合并高血压无关(P=0.873)。说明在Ⅱ型糖尿病男性合并高血压者中携带A等位基因的频率较高(表1)。
表1 不同性别瘦素受体基因Gln223Arg变异[A→G(nt668)]者高血压合并率比较 组别
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例数
基因型例数
构成比(%)
伴高血压例数
伴高血压率(%)
G组与A组比较
G组
A组
G组
A组
G组
A组
G组
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A组
χ2
P值
NGT组
193
148
45
76.7
23.3
26
4
17.6
8.9
, 百拇医药
1.980
0.239
男性
84
66
18
78.6
21.4
12
3
18.2
16.7
0.022
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0.887
女性
109
82
27
75.2
24.8
14
1
17.2
3.7
3.059
0.110
, 百拇医药
Ⅱ型DM组
166
132
34
79.5
20.5
35
15
26.5
44.1
3.979
0.046
男性
, 百拇医药
75
61
14
81.3
18.7
15
9
24.6
64.3
6.523
0.008
女性
91
, 百拇医药
71
20
78.0
22.0
20
6
28.3
30.0
0.026
0.873
注：NGT：糖耐量正常；DM：糖尿病
三、Lepr基因Gln223Arg变异的基因型与各临床变量的关系
, 百拇医药
在NGT组(193例)中,无论是总组还是按性别分组，Lepr基因Gln223Arg变异与BMI、血压(收缩压及舒张压)、血糖(空腹及糖负荷2小时)、血C肽(空腹及糖负荷2小时)、血脂水平(TC、TG、HDL-C及LDL-C)及局部体脂分布参数(VA、SA及FA)均无相关性。但在Ⅱ型糖尿病组(166例)中发现，Lepr基因Gln223Arg变异与收缩压相关(P=0.0310),携带A等位基因的Ⅱ型糖尿病病人具有较高的收缩压; 同时发现该基因变异与舒张压亦有相关趋势(P=0.0627)。进一步按性别分组发现该基因变异与Ⅱ型糖尿病男性收缩压及舒张压均显著相关(P值分别为0.0026及0.0084 );而与Ⅱ型糖尿病女性收缩压及舒张压不相关(P值分别为0.7680及0.7235，表2)。
表2 瘦素受体基因Gln223Arg变异基因型与Ⅱ型糖尿病各临床变量的关系
Ⅱ型糖尿病总组(166例)
, 百拇医药 Ⅱ型糖尿病男性组(75例)
Ⅱ型糖尿病女性组(91例)
G组(132例)
A组(34例)
P值
G组(61例)
A组(14例)
P值
G组(71例)
A组(20例)
P值
年龄(岁)
, 百拇医药
56.22±9.88
56.94±8.91
0.6991
58.85±9.74
58.71±9.59
0.5199
55.67±10.02
55.70±8.43
0.9922
BMI(kg/m2)
26.77±3.72
, 百拇医药
26.72±3.53
0.9533
26.34±3.05
26.06±3.06
0.7591
27.13±4.19
27.19±3.84
0.9571
收缩压(mmHg)
136.79±18.91
145.15±23.11
0.0310
, 百拇医药
135.17±18.17
152.86±22.63
0.0026
138.22±19.57
139.75±22.39
0.7680
舒张压(mmHg)
85.60±10.52
89.65±13.31
0.0627
86.30±10.25
, http://www.100md.com 94.86±12.01
0.0084
84.97±10.79
86.00±13.24
0.7235
HDL-C
(mmol/L)
1.18±0.38
1.16±0.34
0.7729
1.14±0.38
1.08±0.28
, 百拇医药
0.5641
1.20±0.38
1.21±0.38
0.9738
LDL-C
(mmol/L)
3.69±1.49
3.84±1.57
0.6296
3.74±1.65
3.40±1.31
0.4724
, 百拇医药
3.66±1.35
4.14±1.69
0.1837
TG(mmol/L)
1.83±1.35
2.05±1.34
0.3798
1.86±1.63
1.92±0.84
0.8892
1.80±1.06
2.15±1.62
, 百拇医药
0.2552
TC(mmol/L)
5.59±1.48
5.71±1.44
0.6744
5.59±1.58
5.24±1.33
0.4351
5.59±1.39
6.03±1.44
0.2040
空腹血糖
, 百拇医药
(mmol/L)
7.16±2.08
7.50±2.56
0.4143
7.42±2.27
7.42±2.89
0.9921
6.93±1.89
7.56±2.39
0.2163
2h血糖
(mmol/L)
, 百拇医药
12.97±4.75
13.77±4.81
0.3824
13.16±4.94
14.78±4.07
0.2607
12.08±4.61
13.07±5.05
0.8253
空腹C肽
(μg/L)
2.64±1.30
, 百拇医药
2.79±1.35
0.5455
2.62±1.35
2.26±0.95
0.3436
2.66±1.27
3.17±1.48
0.1285
2hC肽(μg/L)
8.07±3.99
7.96±3.62
0.8828
, http://www.100md.com
6.73±3.30
6.66±3.39
0.9479
9.23±4.18
8.87±3.58
0.7284
SA(cm2)
193.19±77.67
195.77±66.21
0.8589
145.19±39.71
, http://www.100md.com 152.19±49.59
0.6023
233.96±79.31
226.28±59.60
0.6889
VA(cm2)
101.38±41.14
112.23±52.37
0.1978
104.10±36.06
117.01±47.88
, 百拇医药
0.2609
99.5±45.19
108.89±56.26
0.4177
FA(cm2)
76.59±33.37
78.26±30.85
0.7913
53.11±8.91
52.06±15.72
0.8478
, 百拇医药 96.76±29.73
96.61±24.97
0.9832
注：BMI：体重指数；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；SA：腹部皮下脂肪面积；VA：腹部内脏脂肪面积；FA：股部皮下脂肪面积；1 mm Hg=0.133 kPa 四、Ⅱ型糖尿病男性中Lepr基因Gln223Arg变异与高血压关系的logistic回归分析
在Ⅱ型糖尿病男性(75例)中,以高血压为因变量(非高血压为0,高血压为1),以表2内其他临床变量及Lepr基因型为自变量进行logistic回归分析(自变量剔除基准P>0.100),结果显示，参与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的独立相关变量为LDL-C(P=0.0705),BMI(P=0.0639)及Lepr基因Gln223Arg变异(P=0.0031),携带A等位基因的Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的比数比为2.825(95%可信为1.418、5.627)。再以Lepr基因型为因变量,以收缩压及舒张压为自变量进行logistic回归分析显示，收缩压与Lepr基因Gln223Arg变异相关(P=0.0054)。
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讨 论
自1996年Considine等[6]首次报道，Lepr基因Gln223Arg变异以来,该基因变异与疾病相关性研究仅见Behn等[7]报道与非洲裔美国人早发Ⅱ型糖尿病相关; Tuomi等[8]报道与芬兰白种人Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平相关。我们的初步研究表明:(1)通过不同性别Ⅱ型糖尿病不同Lepr基因Gln223Arg变异的高血压合并频率比较，发现该基因变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关。(2)通过Lepr基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病各临床变量比较发现该基因变异与Ⅱ型糖尿病男性的收缩压及舒张压相关。(3)运用logistic回归分析再次证实，Lepr基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病男性收缩压相关,且该基因变异是Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的独立风险因子。据此本研究表明，Lepr基因Gln223Arg变异与上海地区汉族人Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关,且主要表现与收缩压相关。携带A等位基因的Ⅱ型糖尿病男性其高血压发病的风险是携带其他基因型个体的2.825倍。
, 百拇医药
鉴于目前国际上对Lepr基因的研究方始起步, 对该基因的各种拼接异型的生物学功能尚未完全明确,对Lepr基因变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的相关机制，根据目前对Lepr基因的认识推测有以下可能:(1)瘦素通过与其受体结合而发挥生物学效应,Dunbar等[9]研究发现，瘦素能增加大鼠的交感神经兴奋性且能升高动脉压,Lepr基因Gln223Arg变异可能使瘦素经Lepr信号传导的功能增强而致血压升高。(2)Lepr基因Gln223Arg变异位于瘦素受体的胞外区[10],而Lepr基因具有多种拼接异型,有的拼接异型如e拼接异型无穿膜及胞内区,其生物学功能尚不明确,因此Lepr基因Gln223Arg变异亦可能通过其他Lepr生物学机制致血压增高,此尚待进一步研究证实。但是,无论是通过何种机制,均可能受与性别差异有关的生物学因素修饰，以致该基因变异对血压的影响仅表现于男性。
本课题受国家自然科学基金(39800069)、上海市医学领先专业重点学科基金(96-III-004)、上海市科委“科技启明星计划”(97QB14021)资助
, 百拇医药
参考文献
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, 百拇医药
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9 Dunbar JC,Hu Y,Lu H,et al. Intracerebroventicular leptin increases lumbar and renal sympathetic nerve activity and blood pressure in normal rats. Diabetes, 1997,46:2040-2049.
10 Fong TM,Huang RR,Tota MR,et al.Localization of leptin binding domain in the leptin receptor.Mol Pharmacol, 1998,53:234-240.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-10-19), http://www.100md.com
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关键词：
中华内科杂志990309 【摘要】 目的 研究瘦素受体基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病代谢紊乱及其合并高血压的关系。方法 运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法测定无亲缘关系，且有完整临床资料的359例上海地区汉人的瘦素受体基因Gln223Arg变异的基因型(包括193例糖耐量正常者及166例Ⅱ型糖尿病患者)。局部体脂分布参数由核磁共振仪测定。结果 Ⅱ型糖尿病不同性别、不同瘦素受体基因Gln223Arg变异的高血压合并频率比较发现,瘦素受体基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关(P=0.008)。“A”等位基因与Ⅱ型糖尿病男性较高的收缩压(P=0.0026)及舒张压(P=0.0084)相关。logistic回归分析证实，该基因变异是Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的独立风险因子(P=0.0031),且主要与收缩压相关(P=0.0054)。携带“A”等位基因的Ⅱ型糖尿病男性其高血压发生的比数比(OR)为2.825(95%可信限为1.418、5.627)。结论 瘦素受体基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关,且主要表现与收缩压相关。
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Association of Gln223Arg variant in leptin receptor gene with metabolic abnormalities and hypertension in type Ⅱ diabetes mellitus in Shanghai “Han” population ZHENG Yiman, XIANG Kunsan, ZHANG Rong,et al. Department of Endocrinology and Metabolism, Laboratory of Medical Genetics, Shanghai Sixth People′s Hospital,Shanghai 200233
【Abstract】 Objective To investigate the association of Gln223Arg variant in leptin receptor gene with metabolic abnormalities and hypertension in type Ⅱ diabetes mellitus. Methods The genotypes of Gln223Arg variant in leptin receptor gene were determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms (PCR-RFLP) assay in 359 unrelated subjects of Shanghai “Han” population (including 193 subjects with normal glucose tolerance and 166 type Ⅱ diabetic patients). The clinical data were also analyzed. The parameters for regional adipose tissue distribution were measured by magnetic resonance imaging (MRI). Results Significant difference of genotype frequency of Gln223Arg variant in leptin receptor gene was observed between hypertensive and normotensive type Ⅱ diabetic male patients (P=0.008). “A” allele was associated with increased systolic blood pressure (P=0.0026) and diastolic blood pressure (P=0.0084) in type Ⅱ diabetic male paitents. Logistic regression analysis showed that this gene variant was an independent risk factor of type Ⅱ diabetic male patients accompanied with hypertension (P=0.0031),and it was associated with elevation of systolic blood pressure (P=0.0054) . The odds ratio of hypertension in type Ⅱ diabetic male patients with “A” allele was 2.825 (95% CI 1.418,5.627). Conclusion Gln223Arg variant in leptin receptor gene is associated with hypertension in type Ⅱ diabetic male patients, especially with elevation of systolic blood pressure.
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【Key words】 Diabetes mellitus, non-insulin dependent Hypertension Gene Receptor, leptin
自1994年瘦素(leptin)基因被定位克隆以来,在体脂及能量代谢的分子调控机制研究领域取得了突破性进展[1]。瘦素受体(leptin receptor,Lepr)作为瘦素调节机体摄食及能量代谢的信号传递中介备受关注。Lepr属细胞因子受体超家族，编码基因位于1p31,转录后已知有5种(a～e)拼接异型(spliced isoform)。除e拼接异型外,其余4种均含有单一跨膜结构,通过Janus激酶-信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription proteins,STATs)途径促进细胞内基因的转录,参与体脂恒定的调节[2]。肥胖、Ⅱ型糖尿病、高血压及脂质代谢紊乱是一类具有共同遗传背景的复杂病,它们常相伴发生,称之为“多发代谢综合征”(multiple metabolic syndrome)或“X综合征”。目前国际上对Lepr基因与疾病的关系研究刚刚起步,以下就该基因与中国人Ⅱ型糖尿病相关代谢紊乱的关系进行研究。
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对象与方法
一、研究对象
359例无亲缘关系的上海地区汉族人,据1997年美国糖尿病学会(ADA)推荐的糖尿病诊断及分型标准分组：(1)糖耐量正常组(NGT):193例,男84例,女109例,年龄(53.0±11.7)岁,体重指数(BMI)为(25.61±4.33) kg/m2;(2)Ⅱ型糖尿病组(Ⅱ型DM):166例,男75例,女91例,年龄(56.4±9.7)岁,BMI(26.76±3.67)kg/m2。各组尚根据1995年WHO标准以BMI 25 kg/m2作为切割点分为正常体重组及超重组。高血压按WHO诊断标准。
二、临床资料
1.体脂含量与分布：(1)BMI：脱鞋及穿内衣测身高及体重,BMI=体重(kg)/身高的平方(m2)。(2)腹部内脏脂肪(VA),腹部皮下脂肪(SA)以及股部皮下脂肪(FA)面积: 用日本岛津SMT-100型核磁共振仪测定,病人取水平仰卧位,腹部扫描平面为L4～L5间, 股部扫描平面为髂棘至膝关节中点处,机配软件进行面积计算。
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2.糖、脂代谢及激素测定：研究对象进行75克葡萄糖耐量试验,并于0、30、60、120及180分钟分别测血胰岛素(放免法)、C肽(放免法)及葡萄糖(酶法);尚定脂代谢谱:总胆固醇(TC,酶法),甘油三脂(TG,酶法),高密度及低密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C及LDL-C,硫酸葡聚糖-锰沉淀法及公式计算)。
三、Lepr基因Gln223Arg变异分析
常规苯酚/氯仿法抽提外周血基因组DNA, 以0.1 μg DNA为模板在反应容积30 μl内进行聚合酶链反应(PCR)扩增,引物分别为[3]:上游引物5'-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATGA-3', 下游引物5'-GCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT-3'(由美国Cyber Syn公司合成),反应条件:94℃预变性5分钟;94℃变性1分钟,55℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,共30循环;最后进一步延伸72℃10分钟, 反应在DNA热循环仪中进行(美国Perkin-Elmer公司480型),扩增产物440 bp,经2%琼脂糖电泳确认扩增结果后,继以限制性内切酶MspI(美国Promega 公司)在37℃酶解PCR 产物12小时,经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(29:1)分离酶解产物片段,电压150 V,1.5小时,溴化乙锭染色后紫外光下观察结果:PCR产物可被MspI 酶解为两个片段300 bp带及140 bp带。Gln223纯合子(AA)电泳带型仅440 bp带; Arg223纯合子(GG)电泳带型为300 bp及140 bp带;Gln223/Arg223杂合子(GA)电泳带型为440 bp带、300 bp带及140 bp带(图1)。
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图1 瘦素受体基因Gln223Arg变异电泳结果 四、统计学分析
以Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性,运用基因计数法计算各组基因频率及等位基因频率。由于AA基因型频率仅为0.011,故将基因型分为G组(GG基因型)及A组(GA及AA基因型),数据以
±s表示，各组间临床变量比较用t检验。运用logistic 回归分析Lepr基因型的独立相关变量及糖尿病合并高血压的独立风险因子, 并计算比数比(odds ratio，OR)及其95%可信限。结 果一、上海地区汉人Lepr基因Gln223Arg变异(第668位核苷酸A→G变异)的频率分布
在90例正常糖耐量且非肥胖(BMI<25 kg/m2)的上海地区汉人中,GG、GA及AA基因频率分别为0.789、0.200及0.011;G及A等位基因频率分别为0.889及0.111,基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。此与文献报道的日本人频率(G及A等位基因频率分别为0.838及0.162)相近似(P=0.240)[3];而与白种人频率[4](G及A等位基因频率分别为0.390及0.610)及Pima印地安人的频率[5](G及A等位基因频率分别为0.667及0.333)差异具有显著性(P值均为0.000)。
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二、Lepr基因Gln223Arg变异频率与Ⅱ型糖尿病及其合并高血压的关系
在NGT组(193例)中,GG基因型频率为0.767(148例),GA及AA基因型频率为0.233(45例);而在Ⅱ型糖尿病组(166例)中,GG基因型频率为0.795(132例),GA及AA基因型频率为0.205(34例);两组比较差异无显著性(P=0.526),说明Lepr基因Gln223Arg变异与上海地区汉人Ⅱ型糖尿病无显著相关性。但是在Ⅱ型糖尿病组(166例)中发现，Lepr基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病合并高血压相关(P=0.046),进一步按性别分组发现，该基因变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关(P=0.008);而与Ⅱ型糖尿病女性合并高血压无关(P=0.873)。说明在Ⅱ型糖尿病男性合并高血压者中携带A等位基因的频率较高(表1)。
表1 不同性别瘦素受体基因Gln223Arg变异[A→G(nt668)]者高血压合并率比较 组别
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例数
基因型例数
构成比(%)
伴高血压例数
伴高血压率(%)
G组与A组比较
G组
A组
G组
A组
G组
A组
G组
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A组
χ2
P值
NGT组
193
148
45
76.7
23.3
26
4
17.6
8.9
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1.980
0.239
男性
84
66
18
78.6
21.4
12
3
18.2
16.7
0.022
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0.887
女性
109
82
27
75.2
24.8
14
1
17.2
3.7
3.059
0.110
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Ⅱ型DM组
166
132
34
79.5
20.5
35
15
26.5
44.1
3.979
0.046
男性
, 百拇医药
75
61
14
81.3
18.7
15
9
24.6
64.3
6.523
0.008
女性
91
, 百拇医药
71
20
78.0
22.0
20
6
28.3
30.0
0.026
0.873
注：NGT：糖耐量正常；DM：糖尿病
三、Lepr基因Gln223Arg变异的基因型与各临床变量的关系
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在NGT组(193例)中,无论是总组还是按性别分组，Lepr基因Gln223Arg变异与BMI、血压(收缩压及舒张压)、血糖(空腹及糖负荷2小时)、血C肽(空腹及糖负荷2小时)、血脂水平(TC、TG、HDL-C及LDL-C)及局部体脂分布参数(VA、SA及FA)均无相关性。但在Ⅱ型糖尿病组(166例)中发现，Lepr基因Gln223Arg变异与收缩压相关(P=0.0310),携带A等位基因的Ⅱ型糖尿病病人具有较高的收缩压; 同时发现该基因变异与舒张压亦有相关趋势(P=0.0627)。进一步按性别分组发现该基因变异与Ⅱ型糖尿病男性收缩压及舒张压均显著相关(P值分别为0.0026及0.0084 );而与Ⅱ型糖尿病女性收缩压及舒张压不相关(P值分别为0.7680及0.7235，表2)。
表2 瘦素受体基因Gln223Arg变异基因型与Ⅱ型糖尿病各临床变量的关系
Ⅱ型糖尿病总组(166例)
, 百拇医药 Ⅱ型糖尿病男性组(75例)
Ⅱ型糖尿病女性组(91例)
G组(132例)
A组(34例)
P值
G组(61例)
A组(14例)
P值
G组(71例)
A组(20例)
P值
年龄(岁)
, 百拇医药
56.22±9.88
56.94±8.91
0.6991
58.85±9.74
58.71±9.59
0.5199
55.67±10.02
55.70±8.43
0.9922
BMI(kg/m2)
26.77±3.72
, 百拇医药
26.72±3.53
0.9533
26.34±3.05
26.06±3.06
0.7591
27.13±4.19
27.19±3.84
0.9571
收缩压(mmHg)
136.79±18.91
145.15±23.11
0.0310
, 百拇医药
135.17±18.17
152.86±22.63
0.0026
138.22±19.57
139.75±22.39
0.7680
舒张压(mmHg)
85.60±10.52
89.65±13.31
0.0627
86.30±10.25
, http://www.100md.com 94.86±12.01
0.0084
84.97±10.79
86.00±13.24
0.7235
HDL-C
(mmol/L)
1.18±0.38
1.16±0.34
0.7729
1.14±0.38
1.08±0.28
, 百拇医药
0.5641
1.20±0.38
1.21±0.38
0.9738
LDL-C
(mmol/L)
3.69±1.49
3.84±1.57
0.6296
3.74±1.65
3.40±1.31
0.4724
, 百拇医药
3.66±1.35
4.14±1.69
0.1837
TG(mmol/L)
1.83±1.35
2.05±1.34
0.3798
1.86±1.63
1.92±0.84
0.8892
1.80±1.06
2.15±1.62
, 百拇医药
0.2552
TC(mmol/L)
5.59±1.48
5.71±1.44
0.6744
5.59±1.58
5.24±1.33
0.4351
5.59±1.39
6.03±1.44
0.2040
空腹血糖
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(mmol/L)
7.16±2.08
7.50±2.56
0.4143
7.42±2.27
7.42±2.89
0.9921
6.93±1.89
7.56±2.39
0.2163
2h血糖
(mmol/L)
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12.97±4.75
13.77±4.81
0.3824
13.16±4.94
14.78±4.07
0.2607
12.08±4.61
13.07±5.05
0.8253
空腹C肽
(μg/L)
2.64±1.30
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2.79±1.35
0.5455
2.62±1.35
2.26±0.95
0.3436
2.66±1.27
3.17±1.48
0.1285
2hC肽(μg/L)
8.07±3.99
7.96±3.62
0.8828
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6.73±3.30
6.66±3.39
0.9479
9.23±4.18
8.87±3.58
0.7284
SA(cm2)
193.19±77.67
195.77±66.21
0.8589
145.19±39.71
, http://www.100md.com 152.19±49.59
0.6023
233.96±79.31
226.28±59.60
0.6889
VA(cm2)
101.38±41.14
112.23±52.37
0.1978
104.10±36.06
117.01±47.88
, 百拇医药
0.2609
99.5±45.19
108.89±56.26
0.4177
FA(cm2)
76.59±33.37
78.26±30.85
0.7913
53.11±8.91
52.06±15.72
0.8478
, 百拇医药 96.76±29.73
96.61±24.97
0.9832
注：BMI：体重指数；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；SA：腹部皮下脂肪面积；VA：腹部内脏脂肪面积；FA：股部皮下脂肪面积；1 mm Hg=0.133 kPa 四、Ⅱ型糖尿病男性中Lepr基因Gln223Arg变异与高血压关系的logistic回归分析
在Ⅱ型糖尿病男性(75例)中,以高血压为因变量(非高血压为0,高血压为1),以表2内其他临床变量及Lepr基因型为自变量进行logistic回归分析(自变量剔除基准P>0.100),结果显示，参与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的独立相关变量为LDL-C(P=0.0705),BMI(P=0.0639)及Lepr基因Gln223Arg变异(P=0.0031),携带A等位基因的Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的比数比为2.825(95%可信为1.418、5.627)。再以Lepr基因型为因变量,以收缩压及舒张压为自变量进行logistic回归分析显示，收缩压与Lepr基因Gln223Arg变异相关(P=0.0054)。
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讨 论
自1996年Considine等[6]首次报道，Lepr基因Gln223Arg变异以来,该基因变异与疾病相关性研究仅见Behn等[7]报道与非洲裔美国人早发Ⅱ型糖尿病相关; Tuomi等[8]报道与芬兰白种人Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平相关。我们的初步研究表明:(1)通过不同性别Ⅱ型糖尿病不同Lepr基因Gln223Arg变异的高血压合并频率比较，发现该基因变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关。(2)通过Lepr基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病各临床变量比较发现该基因变异与Ⅱ型糖尿病男性的收缩压及舒张压相关。(3)运用logistic回归分析再次证实，Lepr基因Gln223Arg变异与Ⅱ型糖尿病男性收缩压相关,且该基因变异是Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的独立风险因子。据此本研究表明，Lepr基因Gln223Arg变异与上海地区汉族人Ⅱ型糖尿病男性合并高血压相关,且主要表现与收缩压相关。携带A等位基因的Ⅱ型糖尿病男性其高血压发病的风险是携带其他基因型个体的2.825倍。
, 百拇医药
鉴于目前国际上对Lepr基因的研究方始起步, 对该基因的各种拼接异型的生物学功能尚未完全明确,对Lepr基因变异与Ⅱ型糖尿病男性合并高血压的相关机制，根据目前对Lepr基因的认识推测有以下可能:(1)瘦素通过与其受体结合而发挥生物学效应,Dunbar等[9]研究发现，瘦素能增加大鼠的交感神经兴奋性且能升高动脉压,Lepr基因Gln223Arg变异可能使瘦素经Lepr信号传导的功能增强而致血压升高。(2)Lepr基因Gln223Arg变异位于瘦素受体的胞外区[10],而Lepr基因具有多种拼接异型,有的拼接异型如e拼接异型无穿膜及胞内区,其生物学功能尚不明确,因此Lepr基因Gln223Arg变异亦可能通过其他Lepr生物学机制致血压增高,此尚待进一步研究证实。但是,无论是通过何种机制,均可能受与性别差异有关的生物学因素修饰，以致该基因变异对血压的影响仅表现于男性。
本课题受国家自然科学基金(39800069)、上海市医学领先专业重点学科基金(96-III-004)、上海市科委“科技启明星计划”(97QB14021)资助
, 百拇医药
参考文献
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(收稿：1998-04-13 修回：1998-10-19), http://www.100md.com