在唾液中检测幽门螺杆菌的意义
作者：彭惠 潘国宗 曹世植 赵荣国
单位：100730 中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院消化内科
关键词：
中华内科杂志990308 【摘要】 目的 探讨一种有效的非侵入性幽门螺杆菌(Hp)诊断方法。方法 138/159例各类型胃、十二指肠疾病患者的唾液和胃黏膜, 用空泡毒素基因(vacA)为模板设计的引物行聚合酶链反应(PCR), 其产物行单链构象多态性分析(SSCP)和Southern杂交。结果 胃和唾液Hp的检出率分别是100%和71.7%; Hp的vacA有vacA1和vacA2两种亚型。vacA1可表达VacA蛋白，vacA2不表达VacA蛋白。PCR-SSCP分析显示98%口腔与胃内Hp呈现相同的单链构象。结论 本研究以PCR-SSCP法表明口腔感染可能是Hp的一种主要传播途径, PCR-SSCP法可提供一种非侵入性的Hp检测法，适用于Hp的家族聚集性调查。
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The significance of detection of Helicobacter pylori in saliva PENG Hui, PAN Guozong, CHAO Shizhi, et al. Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To explore noninvasive and effective method to detect Helicobacter pylori(Hp) in saliva. Methods DNAs of saliva and gastric mucosa from 138 and 159 patients of various gastro-duodenal diseases were detected with PCR by use of primers amplifing vacA gene. The products were futher processed for SSCP and Southern blot hybridization. Results The rate of detection of Hp in saliva and gastric mucosa was 71.7% and 100% respectively. vacA1 and vacA2, being the two subtypes of vacA, were recognized in Hp . PCR/SSCP analysis showed a 98% identity of the strains of Hp in the saliva and gastric mucosa. Conclusion Hp could be colonized in saliva and probably transmited orally. The new method may provide noninvasive approach for detection of Hp and could be used in the investigation of family aggregation of Hp infection.
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【Key words】 Helicobacter pylori Saliva
到目前为止，幽门螺杆菌(Hp)的传播方式尚未弄清楚，从国内外一些文献报道，提示口腔可能是Hp 的居住场所之一。据最新国外文献报道，用聚合酶链反应(PCR)法可检测口腔和唾液中的Hp，业已受到重视[1-4]。若能建立一种有效的从唾液中检测Hp的方法，而又能证明唾液中的Hp与胃内的属同一菌株，不仅有利于Hp传播途径的研究, 同时将开辟一种非侵入性的Hp诊断的新方法, 可为Hp的流行病学调查和临床初筛及Hp疗效的评价提供手段。我们以Hp 空泡毒素基因(vacA)信号序列为模板设计的引物行PCR来观察唾液中Hp的检测率，并用单链构象多态性分析(SSCP)法来鉴定唾液和胃内Hp的来源和菌型，以期为探讨Hp的传播方式奠定基础，从而为Hp临床和科研工作提供简便实用的方法。
材料和方法
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一、材料
1.胃黏膜: 标本来自北京协和医院行胃镜的159例患者，Hp(+)149例，男性92例，女性57例，年龄为22～78岁，平均50岁。慢性胃炎30例，十二指肠溃疡(DU)30例，胃溃疡(GU)25例，复合性溃疡(DU+GU)17例，萎缩性胃炎25例，胃癌22例；Hp(-)10例，条件与阳性组基本相似。组织学银染和(或)快速尿素酶试验(RUT)阳性即为Hp阳性。国际标准菌株11639和11637均由中国预防医学科学院流行病研究所陈晶晶研究员惠赠。
2.唾液标本[4]：138例病人于清晨做胃镜前收集唾液。用1%的枸橼酸刺激唾液分泌后，吩咐患者将唾液直接吐到清洁的容器中，其中内含消化缓冲液(1 mol/l Tris、0.5 mol/l EDTA 、10%十二烷基肌氨酸钠)和RN酶，共收集1～2 ml唾液，充分混匀后置于-70℃备用。
二、方法
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1.模板DNA的提取程序[1-6]：采用常规酚：氯仿：异戊醇提取法。唾液：用1 ml唾液加50 μl唾液消化缓冲液充分混匀, 37℃水浴30分钟后，加入12 μl蛋白酶K 55℃消化2～3小时。然后加入饱和酚600 μl，4℃下8 000 r/min离心15分钟。小心吸出上清液于1.5 ml Eppendof管中，并加入60 μl醋酸钠和600 μl冰异丙醇，颠倒混匀至DNA絮状沉淀出现为止。快速吸出沉淀物于1.5 ml的 Eppendof管中，用70%乙醇洗2次，吸上清液弃之，待乙醇完全挥发后用500～800 μl TE缓冲液溶解，-20℃储存备用。
2.PCR反应[7]: 在50 μl PCR反应体系中，依次加入DNA模板4.0 μl, 引物0.5 μmol/l, dNTPs各200 μmol/L(Boehringer Mannheim), 10×PCR缓冲液5.0 μl，Tag聚合酶(Promega)0.5 U，上覆100 μl矿物油。另设不含DNA模板的反应体系为阴性对照。反应条件为94℃变性1分钟, 59℃退火1分钟, 72℃延伸1分钟，反应35个循环；循环结束后72℃保温5分钟。扩增产物在1.0%～1.5%琼脂糖胶上电泳鉴定。PCR引物为5'- ATGGAAATACAACAAACACAC-3' 和5'-CTACTTGAATGCGCCCAAC-3'，上海生工(sangon)合成。
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3.PCR-SSCP分析[8]：vacA PCR产物8 μl 与变性液(98%甲酰胺及0.01%溴酚蓝8 μl)在95℃变性5分钟后，迅速置于冰浴中，在4℃、110 V的10%聚丙烯酰胺胶中电泳3小时左右。待指示剂泳至胶尾时，在0.1%硝酸银溶液(含1.5%甲醛)中染色45分钟, 用3% NaOH溶液(含1.5%甲醛)显色后即可鉴定。
三、统计学处理
均采用卡方检验。
结 果
一、Hp vacA两种亚型在口腔和胃内的特点
我们用Hp 的vacA信号序列为模板设计的引物对唾液和胃黏膜行PCR扩增来探讨口腔是否是Hp的寄居场所。唾液和胃Hp的检出率分别为71.7%和100%; 10例Hp阴性的胃黏膜均未检测到Hp。vacA的两种亚型片段vacA1和vacA2, 在胃黏膜各占76.5%(114/149) 和23.5%(35/149), 每个胃黏膜仅能扩增出一种产物(图1)。而此两种片段在唾液中各占52.9% (73/138)和18.8%(26/138)(图2)。如果以胃黏膜Hp的vacA1检出率为100%, 在唾液中Hp的vacA1的检出率可达70.9%(73/103); 同样，如果以胃黏膜Hp的vacA2检出率为100%, 在唾液中Hp的vacA2的检出率可达74.3%(26/35)。表明此引物的PCR对胃内Hp检测的敏感性和特异性高，并可在口腔中获得较高的Hp检测率，且与Hp的vacA亚型无显著相关。
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M pBR322/HinfI 1阴性对照 2 阳性对照 3、4、5 胃黏膜标本
图1 胃黏膜聚合酶链反应产物的电泳图
M DNA标准参照物 1 阴性对照 2、3 阳性对照(11637，11639)
4、5，6、7，8、9，10、11 各来自于同一病人，奇数为唾液标本，偶数为胃黏膜标本
图2 唾液和胃黏膜聚合酶链反应产物的电泳图
二、Hp vacA为模板设计的引物的PCR-SSCP分析在鉴别口腔和胃Hp的意义
为了鉴别不同来源的Hp，探讨口腔和胃黏膜Hp是否属同一来源，我们采用PCR-SSCP分析法来鉴别Hp vacA基因多态性。PCR产物vacA1和vacA2,在相同条件下不同次的实验中呈现相同的单链构象, 表明重复性好。SSCP有8种单链构象(A-H)，用PCR-SSCP分析表明，这8种构象分别为A-5.9%(9/153)、B-45.7% (70/153)、C-14.4% (22/153)、D-5.9% (9/153)、E-6.5% (10/153)、F-2.0% (3/153)、G-14.4% (22/153)和H-5.2%(8/153)。对99例口腔和胃的SSCP分析发现绝大多数(98%) Hp呈现相同的单链构象 ，仅2例口腔和胃Hp呈现不同的单链构象(图3)。提示口腔与胃内Hp属同一来源的可能性大，经口传播可能是Hp的主要传播方式。
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1、2，3、4，5、6，7、8各来自于同一病人，奇数为唾液标本，偶数为胃黏膜本，其中5、6的单链构象不同
图3 胃和唾液中Hp的PCR-SSCP分析图谱
讨 论
目前，Hp的传播方式多认为可能经口-口、粪-口，甚至水源等途径传播[1-4，9，10]。口腔是否是Hp的生存场所是Hp的一个研究热点。由于口腔是对外开放的一个器官，平时常有细菌寄居，加之Hp培养条件苛刻，牙垢或唾液中Hp的培养率很低，不适于临床和科研工作。随着分子生物学的发展，PCR法以特异性和敏感性好、可在唾液中检测Hp展露头角，尤其是新近有人报道用16sRNA设计的引物对唾液中Hp的检出率可达84%左右[4]，使许多学者对PCR法检测口腔中的Hp倍感兴趣[1-4]。 但因操作方法、引物设计的差异等原因, 多未能获得满意结果，且唾液中Hp的检出率不一致(30%～84%), 多数报道其检出率较低。我们首次采用以Hp的毒力因子vacA为模板设计的引物来对唾液中Hp进行检测，避免了某些特异类型的Hp如L型Hp因产尿素酶能力的削弱或丧失而导致的假阴性。加之，本PCR法特异性高, 不失为一种方便实用的非侵入性Hp检测法。本PCR法的两种片段是以vacA基因的特殊部位为模板设计的引物检出之结果。259 bp的vacA1源于可表达VacA蛋白的60190菌株的信号序列；286 bp的vacA2源于不表达VacA蛋白的Tx30a菌株的信号序列[7，11]。通过简单的PCR法可将Hp初步分为两种类型，且唾液中Hp的vacA亚型与胃黏膜相比之比率基本一致。此外，欲获得高效的唾液Hp检出率，需适当的、足量唾液标本，并直接将唾液吐入消化缓冲液中，提取DNA时采用全部唾液优于常规离心沉淀法。另外，因为唾液中含有许多杂菌和各种物质，均可能干扰PCR反应，故对DNA模板的纯度要求较高。
, 百拇医药
SSCP分析作为鉴别DNA序列差异的一种方法，已开始运用于Hp基因多态性的鉴别。从许多文献报道，Hp基因有较大的变异性。本研究中PCR产物小于300 bp, 可运用SSCP法来鉴别Hp vacA信号序列的差异性，从而借此将不同来源的Hp区分开来[11，12]。PCR-SSCP分析可产生8种不同的单链构象，表明Hp vacA信号序列存在普遍差异。其中B型单链构相最多，占45.7%，80.0%的DU、70.6%的复合性溃疡和36.3%的胃癌的单链构象属B型。但本组的病例较少，尚不足以仅从Hp vacA信号序列的单链构象上作出它与疾病关系的结论。不过本组绝大多数病例 (98%)唾液和胃的Hp为同一单链构象，且唾液和胃Hp的vacA亚型多一致，又表明口腔和胃内Hp很有可能多为同一菌株，从而提示口腔可能是Hp的寄居环境之一，经口传播可能是Hp的主要传播途径之一。而2例患者唾液和胃黏膜Hp不是同一单链构象的原因尚不清楚, 或许此类型在日后将发展成为多株Hp菌株感染，这点有待于进一步的观察和证实。
我们认为, 口-口可能是Hp的主要传播方式之一, 且本法可从口腔中获得较高的Hp检出率，为临床提供了一种非侵入性的Hp诊断法。 结合SSCP分析，本法有可能适用于Hp的家族聚集性调查。但本法的假阴性率还太高，目前还不足以作为临床流行病学调查和抗Hp治疗后追踪评价的手段。
, 百拇医药
本课题部分资金由葛兰素基金资助
参考文献
1 Mapstone NP, Lynch DA, Lewis FA, et al. Identification of Helicobacter pylori DNA in the mouths and stomachs of patients with gastritis using PCR. J Clin Pathol, 1993, 46: 540-543.
2 Nguyen AM, Engstrand L, Genta RM, et al. Detection of Helicobacter pylori in dental plaque by reverse transcription polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1993,31:783-787.
, 百拇医药
3 Jiang C, Li C, Ha T, et al. Comparison of PCR, PCR-based southern blot hybridization and nested PCR assay for detection of Helicobacter pylori and in saliva . Gastroenterology ，1997, 112: A161.
4 Li C, Ha T, Ferguson DA, et al. A newly developed PCR assay of H.pylori in gastric biopsy, saliva, and feces. Evidence of high prevalence of H. pylori in saliva support oral transmission. Dig Dis Sci , 1996, 41: 2142-2149.
5 徐智民, 周殿元, 潘令嘉,等. 幽门螺杆菌长丝体的变异及返祖. 现代消化及内镜杂志, 1996, 1: 201-205.
, http://www.100md.com
6 Nilius M, Strohle A, Bode G, et al. Coccoid like forms (CLF) of Helicobacter pylori. Enzyme activity and antigenicity. Int J Med Microbiol Virol Parssitol Infect Dis, 1993,280: 259-272.
7 Atherton JC, Coa P, Peek RM Jr, et al. Mosaicism in vacuolation cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J Biol Chem, 1995, 270: 17771-17777.
8 王蔚红, 胡伏莲, 贾博琦,等. 用PCR-SSCP分析区分不同来源的幽门螺杆菌. 中华消化杂志, 1995, 15: 109-114.
, http://www.100md.com
9 Hulten K, Han SW, El-Zaatari FA, et al. Detection of Helicobacter pylori in peruian water sources by two PCR assays based on indepent genes. Gastroenterology， 1995, 108: A118.
10 Banatvala N, Abdi Y, Clements L, et al. Helicobacter pylori infection in dentists—a case-control study. Scand J Infect Dis, 1995, 27: 149-151.
11 Cover TL, Tummuru MK, Cao P, et al. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains. J Biol Chem ，1994, 269: 10566-10573.
12 Owen RJ, Bickley J, Costas M, et al. Genomic variation in Helicabacter pylori: application to identification of strains . Scand J Gastroenterol Suppl ,1991, 181:43-50.
(收稿：1998-05-11 修回：1998-09-15), 百拇医药
单位：100730 中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院消化内科
关键词：
中华内科杂志990308 【摘要】 目的 探讨一种有效的非侵入性幽门螺杆菌(Hp)诊断方法。方法 138/159例各类型胃、十二指肠疾病患者的唾液和胃黏膜, 用空泡毒素基因(vacA)为模板设计的引物行聚合酶链反应(PCR), 其产物行单链构象多态性分析(SSCP)和Southern杂交。结果 胃和唾液Hp的检出率分别是100%和71.7%; Hp的vacA有vacA1和vacA2两种亚型。vacA1可表达VacA蛋白，vacA2不表达VacA蛋白。PCR-SSCP分析显示98%口腔与胃内Hp呈现相同的单链构象。结论 本研究以PCR-SSCP法表明口腔感染可能是Hp的一种主要传播途径, PCR-SSCP法可提供一种非侵入性的Hp检测法，适用于Hp的家族聚集性调查。
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The significance of detection of Helicobacter pylori in saliva PENG Hui, PAN Guozong, CHAO Shizhi, et al. Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To explore noninvasive and effective method to detect Helicobacter pylori(Hp) in saliva. Methods DNAs of saliva and gastric mucosa from 138 and 159 patients of various gastro-duodenal diseases were detected with PCR by use of primers amplifing vacA gene. The products were futher processed for SSCP and Southern blot hybridization. Results The rate of detection of Hp in saliva and gastric mucosa was 71.7% and 100% respectively. vacA1 and vacA2, being the two subtypes of vacA, were recognized in Hp . PCR/SSCP analysis showed a 98% identity of the strains of Hp in the saliva and gastric mucosa. Conclusion Hp could be colonized in saliva and probably transmited orally. The new method may provide noninvasive approach for detection of Hp and could be used in the investigation of family aggregation of Hp infection.
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【Key words】 Helicobacter pylori Saliva
到目前为止，幽门螺杆菌(Hp)的传播方式尚未弄清楚，从国内外一些文献报道，提示口腔可能是Hp 的居住场所之一。据最新国外文献报道，用聚合酶链反应(PCR)法可检测口腔和唾液中的Hp，业已受到重视[1-4]。若能建立一种有效的从唾液中检测Hp的方法，而又能证明唾液中的Hp与胃内的属同一菌株，不仅有利于Hp传播途径的研究, 同时将开辟一种非侵入性的Hp诊断的新方法, 可为Hp的流行病学调查和临床初筛及Hp疗效的评价提供手段。我们以Hp 空泡毒素基因(vacA)信号序列为模板设计的引物行PCR来观察唾液中Hp的检测率，并用单链构象多态性分析(SSCP)法来鉴定唾液和胃内Hp的来源和菌型，以期为探讨Hp的传播方式奠定基础，从而为Hp临床和科研工作提供简便实用的方法。
材料和方法
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一、材料
1.胃黏膜: 标本来自北京协和医院行胃镜的159例患者，Hp(+)149例，男性92例，女性57例，年龄为22～78岁，平均50岁。慢性胃炎30例，十二指肠溃疡(DU)30例，胃溃疡(GU)25例，复合性溃疡(DU+GU)17例，萎缩性胃炎25例，胃癌22例；Hp(-)10例，条件与阳性组基本相似。组织学银染和(或)快速尿素酶试验(RUT)阳性即为Hp阳性。国际标准菌株11639和11637均由中国预防医学科学院流行病研究所陈晶晶研究员惠赠。
2.唾液标本[4]：138例病人于清晨做胃镜前收集唾液。用1%的枸橼酸刺激唾液分泌后，吩咐患者将唾液直接吐到清洁的容器中，其中内含消化缓冲液(1 mol/l Tris、0.5 mol/l EDTA 、10%十二烷基肌氨酸钠)和RN酶，共收集1～2 ml唾液，充分混匀后置于-70℃备用。
二、方法
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1.模板DNA的提取程序[1-6]：采用常规酚：氯仿：异戊醇提取法。唾液：用1 ml唾液加50 μl唾液消化缓冲液充分混匀, 37℃水浴30分钟后，加入12 μl蛋白酶K 55℃消化2～3小时。然后加入饱和酚600 μl，4℃下8 000 r/min离心15分钟。小心吸出上清液于1.5 ml Eppendof管中，并加入60 μl醋酸钠和600 μl冰异丙醇，颠倒混匀至DNA絮状沉淀出现为止。快速吸出沉淀物于1.5 ml的 Eppendof管中，用70%乙醇洗2次，吸上清液弃之，待乙醇完全挥发后用500～800 μl TE缓冲液溶解，-20℃储存备用。
2.PCR反应[7]: 在50 μl PCR反应体系中，依次加入DNA模板4.0 μl, 引物0.5 μmol/l, dNTPs各200 μmol/L(Boehringer Mannheim), 10×PCR缓冲液5.0 μl，Tag聚合酶(Promega)0.5 U，上覆100 μl矿物油。另设不含DNA模板的反应体系为阴性对照。反应条件为94℃变性1分钟, 59℃退火1分钟, 72℃延伸1分钟，反应35个循环；循环结束后72℃保温5分钟。扩增产物在1.0%～1.5%琼脂糖胶上电泳鉴定。PCR引物为5'- ATGGAAATACAACAAACACAC-3' 和5'-CTACTTGAATGCGCCCAAC-3'，上海生工(sangon)合成。
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3.PCR-SSCP分析[8]：vacA PCR产物8 μl 与变性液(98%甲酰胺及0.01%溴酚蓝8 μl)在95℃变性5分钟后，迅速置于冰浴中，在4℃、110 V的10%聚丙烯酰胺胶中电泳3小时左右。待指示剂泳至胶尾时，在0.1%硝酸银溶液(含1.5%甲醛)中染色45分钟, 用3% NaOH溶液(含1.5%甲醛)显色后即可鉴定。
三、统计学处理
均采用卡方检验。
结 果
一、Hp vacA两种亚型在口腔和胃内的特点
我们用Hp 的vacA信号序列为模板设计的引物对唾液和胃黏膜行PCR扩增来探讨口腔是否是Hp的寄居场所。唾液和胃Hp的检出率分别为71.7%和100%; 10例Hp阴性的胃黏膜均未检测到Hp。vacA的两种亚型片段vacA1和vacA2, 在胃黏膜各占76.5%(114/149) 和23.5%(35/149), 每个胃黏膜仅能扩增出一种产物(图1)。而此两种片段在唾液中各占52.9% (73/138)和18.8%(26/138)(图2)。如果以胃黏膜Hp的vacA1检出率为100%, 在唾液中Hp的vacA1的检出率可达70.9%(73/103); 同样，如果以胃黏膜Hp的vacA2检出率为100%, 在唾液中Hp的vacA2的检出率可达74.3%(26/35)。表明此引物的PCR对胃内Hp检测的敏感性和特异性高，并可在口腔中获得较高的Hp检测率，且与Hp的vacA亚型无显著相关。
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M pBR322/HinfI 1阴性对照 2 阳性对照 3、4、5 胃黏膜标本
图1 胃黏膜聚合酶链反应产物的电泳图
M DNA标准参照物 1 阴性对照 2、3 阳性对照(11637，11639)
4、5，6、7，8、9，10、11 各来自于同一病人，奇数为唾液标本，偶数为胃黏膜标本
图2 唾液和胃黏膜聚合酶链反应产物的电泳图
二、Hp vacA为模板设计的引物的PCR-SSCP分析在鉴别口腔和胃Hp的意义
为了鉴别不同来源的Hp，探讨口腔和胃黏膜Hp是否属同一来源，我们采用PCR-SSCP分析法来鉴别Hp vacA基因多态性。PCR产物vacA1和vacA2,在相同条件下不同次的实验中呈现相同的单链构象, 表明重复性好。SSCP有8种单链构象(A-H)，用PCR-SSCP分析表明，这8种构象分别为A-5.9%(9/153)、B-45.7% (70/153)、C-14.4% (22/153)、D-5.9% (9/153)、E-6.5% (10/153)、F-2.0% (3/153)、G-14.4% (22/153)和H-5.2%(8/153)。对99例口腔和胃的SSCP分析发现绝大多数(98%) Hp呈现相同的单链构象 ，仅2例口腔和胃Hp呈现不同的单链构象(图3)。提示口腔与胃内Hp属同一来源的可能性大，经口传播可能是Hp的主要传播方式。
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1、2，3、4，5、6，7、8各来自于同一病人，奇数为唾液标本，偶数为胃黏膜本，其中5、6的单链构象不同
图3 胃和唾液中Hp的PCR-SSCP分析图谱
讨 论
目前，Hp的传播方式多认为可能经口-口、粪-口，甚至水源等途径传播[1-4，9，10]。口腔是否是Hp的生存场所是Hp的一个研究热点。由于口腔是对外开放的一个器官，平时常有细菌寄居，加之Hp培养条件苛刻，牙垢或唾液中Hp的培养率很低，不适于临床和科研工作。随着分子生物学的发展，PCR法以特异性和敏感性好、可在唾液中检测Hp展露头角，尤其是新近有人报道用16sRNA设计的引物对唾液中Hp的检出率可达84%左右[4]，使许多学者对PCR法检测口腔中的Hp倍感兴趣[1-4]。 但因操作方法、引物设计的差异等原因, 多未能获得满意结果，且唾液中Hp的检出率不一致(30%～84%), 多数报道其检出率较低。我们首次采用以Hp的毒力因子vacA为模板设计的引物来对唾液中Hp进行检测，避免了某些特异类型的Hp如L型Hp因产尿素酶能力的削弱或丧失而导致的假阴性。加之，本PCR法特异性高, 不失为一种方便实用的非侵入性Hp检测法。本PCR法的两种片段是以vacA基因的特殊部位为模板设计的引物检出之结果。259 bp的vacA1源于可表达VacA蛋白的60190菌株的信号序列；286 bp的vacA2源于不表达VacA蛋白的Tx30a菌株的信号序列[7，11]。通过简单的PCR法可将Hp初步分为两种类型，且唾液中Hp的vacA亚型与胃黏膜相比之比率基本一致。此外，欲获得高效的唾液Hp检出率，需适当的、足量唾液标本，并直接将唾液吐入消化缓冲液中，提取DNA时采用全部唾液优于常规离心沉淀法。另外，因为唾液中含有许多杂菌和各种物质，均可能干扰PCR反应，故对DNA模板的纯度要求较高。
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SSCP分析作为鉴别DNA序列差异的一种方法，已开始运用于Hp基因多态性的鉴别。从许多文献报道，Hp基因有较大的变异性。本研究中PCR产物小于300 bp, 可运用SSCP法来鉴别Hp vacA信号序列的差异性，从而借此将不同来源的Hp区分开来[11，12]。PCR-SSCP分析可产生8种不同的单链构象，表明Hp vacA信号序列存在普遍差异。其中B型单链构相最多，占45.7%，80.0%的DU、70.6%的复合性溃疡和36.3%的胃癌的单链构象属B型。但本组的病例较少，尚不足以仅从Hp vacA信号序列的单链构象上作出它与疾病关系的结论。不过本组绝大多数病例 (98%)唾液和胃的Hp为同一单链构象，且唾液和胃Hp的vacA亚型多一致，又表明口腔和胃内Hp很有可能多为同一菌株，从而提示口腔可能是Hp的寄居环境之一，经口传播可能是Hp的主要传播途径之一。而2例患者唾液和胃黏膜Hp不是同一单链构象的原因尚不清楚, 或许此类型在日后将发展成为多株Hp菌株感染，这点有待于进一步的观察和证实。
我们认为, 口-口可能是Hp的主要传播方式之一, 且本法可从口腔中获得较高的Hp检出率，为临床提供了一种非侵入性的Hp诊断法。 结合SSCP分析，本法有可能适用于Hp的家族聚集性调查。但本法的假阴性率还太高，目前还不足以作为临床流行病学调查和抗Hp治疗后追踪评价的手段。
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本课题部分资金由葛兰素基金资助
参考文献
1 Mapstone NP, Lynch DA, Lewis FA, et al. Identification of Helicobacter pylori DNA in the mouths and stomachs of patients with gastritis using PCR. J Clin Pathol, 1993, 46: 540-543.
2 Nguyen AM, Engstrand L, Genta RM, et al. Detection of Helicobacter pylori in dental plaque by reverse transcription polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1993,31:783-787.
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3 Jiang C, Li C, Ha T, et al. Comparison of PCR, PCR-based southern blot hybridization and nested PCR assay for detection of Helicobacter pylori and in saliva . Gastroenterology ，1997, 112: A161.
4 Li C, Ha T, Ferguson DA, et al. A newly developed PCR assay of H.pylori in gastric biopsy, saliva, and feces. Evidence of high prevalence of H. pylori in saliva support oral transmission. Dig Dis Sci , 1996, 41: 2142-2149.
5 徐智民, 周殿元, 潘令嘉,等. 幽门螺杆菌长丝体的变异及返祖. 现代消化及内镜杂志, 1996, 1: 201-205.
, http://www.100md.com
6 Nilius M, Strohle A, Bode G, et al. Coccoid like forms (CLF) of Helicobacter pylori. Enzyme activity and antigenicity. Int J Med Microbiol Virol Parssitol Infect Dis, 1993,280: 259-272.
7 Atherton JC, Coa P, Peek RM Jr, et al. Mosaicism in vacuolation cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J Biol Chem, 1995, 270: 17771-17777.
8 王蔚红, 胡伏莲, 贾博琦,等. 用PCR-SSCP分析区分不同来源的幽门螺杆菌. 中华消化杂志, 1995, 15: 109-114.
, http://www.100md.com
9 Hulten K, Han SW, El-Zaatari FA, et al. Detection of Helicobacter pylori in peruian water sources by two PCR assays based on indepent genes. Gastroenterology， 1995, 108: A118.
10 Banatvala N, Abdi Y, Clements L, et al. Helicobacter pylori infection in dentists—a case-control study. Scand J Infect Dis, 1995, 27: 149-151.
11 Cover TL, Tummuru MK, Cao P, et al. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains. J Biol Chem ，1994, 269: 10566-10573.
12 Owen RJ, Bickley J, Costas M, et al. Genomic variation in Helicabacter pylori: application to identification of strains . Scand J Gastroenterol Suppl ,1991, 181:43-50.
(收稿：1998-05-11 修回：1998-09-15), 百拇医药