吸烟者血清弹性蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、前胶原Ⅲ肽及丙二醛的检测
作者：陈祥银 程显声 李景周 张蕙莲 华毅 徐希胜 赵青 李清 秦富军 余丽君 李智 李亚辉
单位：100005 北京，中国医学科学院、中国协和医科大学基础医学研究所(陈祥银、张蕙莲、赵青、余丽君)，阜外医院(程显声、华毅、李清、李智、李亚辉)；北京房山第一医院(李景周、徐希胜、秦富军)
关键词：
中华内科杂志990310 【摘要】 目的 探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)的高危因素。方法 采用病例-对照设计方法，对154例吸烟伴和不伴COPD者血清α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、前胶原三肽(PⅢP)、弹性蛋白酶及丙二醛进行检测。结果 吸烟可引起血清 PⅢP明显增加；吸烟伴COPD者血清α1-AT为(16.13±6.43) μmol*min-1*ml-1，明显低于无COPD者[(22.30±7.84) μmol*min-1*ml-1；P<0.01]。结论 提示α1-AT降低在COPD 发病中可能是一重要宿主高危因素，对发现COPD吸烟易感人群可能会有一定意义。
Changes of serum elastase，α1-antitrypsin, procollagen Ⅲ peptide and malonaldehyde in smokers with and without chronic obstructive pulmonary diseases CHEN Xiangyin, CHENG Xiansheng, LI Jingzhou, et al. *Institute of Basic Medical Science, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005
【Abstract】 Objective Serum elastase , α1-antitrypsin (α1-AT),procollagen Ⅲ peptide (PⅢP) and malonaldehyde (MDA) were studied in smokers with and without chronic obstructive pulmonary disease (COPD) to explore the roles of these factors in COPD induced by smoking. Methods A design of 154-pair case-control study was used. α1-AT, MDA and PⅢP were determined with colorimetric method, fluo-spectrophotometric method and radio-immunological assay, respectively, in non-smoker control and smokers with and without COPD . Results Serum PⅢP content was increased in smokers and α1-AT decreased significantly in patients with COPD. Conclusion Decreased α1-AT may be a susceptible factor in the development of COPD caused by smoking.
【Key words】 Lung diseases , obstructive Smoking
慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病率高，危害大。吸烟是COPD发病的重要因素[1]，但其机制仍不十分清楚。本研究对吸烟伴和不伴COPD患者血清弹性蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、前胶原三肽(PⅢP)和丙二醛(MDA)进行检测，并与正常对照进行比较，为探讨COPD的高危因素，实施积极干预提供实验依据。
对象与方法
一、对象
吸烟伴COPD组：按病例-对照设计方法,从数据库中随机抽取154例吸烟(吸烟指数≥300)伴COPD患者[1秒钟用力呼气容积占用力肺活量比值(FEV1%)<70%]，男137例，女17例，年龄40～69岁，平均(54.0±7.3)岁，FEV1%为45.3%～69.9%[(62.6±6.4)%]。吸烟无COPD组：在相同年龄(±3岁)、同性别、同居住地及同吸烟量人中，按1∶1配以154例单纯吸烟(吸烟指数≥300)无COPD者(FEV1%≥75%)作对照，男137例，女17例，年龄为40～69岁,平均(53.5±7.3)岁，FEV1%为75.5%～92.7%[(79.7±3.6)%]。肺功能用Collins-Steadwell冲水式肺量计测量。两组均排除其他心肺疾病。正常对照组23例，男14例，女9例，年龄42～69岁，平均(51.0±6.8)岁，FEV1%为75.7%～89.8%[(82.1±4.6)%]。
二、方法
静脉取血20 ml左右，分离血清，-80℃冰冻，待测。
1.α1-AT的测定方法：于样品测定管中加入1mmol/L 苯甲酰-精氨酸-硝基苯胺(Sigma公司产品)2.5 ml，血清-胰蛋白酶混合液0.5ml,置37℃水浴中反应10分钟，加30%冰醋酸0.5ml终止反应；标准管用清蛋白-胰蛋白酶液0.5 ml,其余同样品管。空白对照管，在终止反应后加血清-胰蛋白酶混合液0.5 ml;以空白对照管为对照，400 nm比色。
2.PⅢP的测定方法：购买人Ⅲ型前胶原(HPC Ⅲ)药盒(重庆肿瘤研究所)，参照试剂盒方法进行。分别于标准管及样品管中加入不同浓度的标准品100 μl及血清样品100 μl；再加入HPCⅢ抗体200 μl，4℃放置24小时;加入125I-HPCⅢ 100 μl, 4℃放置6小时;加分离剂200 μl，室温放置30分钟，3 500 r/min离心20分钟，弃上清；测沉淀放射性。以半对数纸作图，计算PⅢP含量。
3.MDA的测定方法：50 μl血清+10%三氯醋酸4 ml，混匀，3 000 r/min离心15分钟，弃上清，沉淀加1 ml双蒸水及0.5%硫代巴比妥酸钠(Sigma公司产品)-1%冰醋酸1 ml，沸水中1小时，冷却，加5 ml正丁醇，3 000 r/min离心15分钟，取上层液，在荧光分光光度计上比色，波长515～553 nm。以四乙氧基丙烷作标准，测定MDA。
4.弹性蛋白酶的测定方法： (1)制作琼脂糖板：称取弹性蛋白80 mg,SDS 20 mg,NaN3 50 mg,琼脂糖2 g,加0.05 mol/L Tris溶液100 ml，于沸水中溶解，冷却至60～70℃，铺板，每板5 ml;置4℃冰箱中，待凝固后打孔，孔径4 mm。(2)于孔中加入胰弹性蛋白酶标准或待测血清样品10 μl，置37℃恒温箱反应24小时，分别测定溶斑直径，绘制标准曲线，计算弹性蛋白酶活性。
三、统计学方法
所有数据以
±s表示，组间比较用t检验。结 果
一、血清α1-AT的测定结果
正常对照组α1-AT为(20.75±8.85) μmol*min-1*ml-1，吸烟无COPD组为(22.30±7.84) μmol*min-1*ml-1，与正常对照组相比，无明显变化；吸烟伴COPD组为(16.13±6.43) μmol*min-1*ml-1，明显低于吸烟无COPD组(t=7.542，P<0.01)及正常对照组(t=2.418，P<0.05)。可见，吸烟无COPD者α1-AT无明显变化，但吸烟伴COPD者α1-AT明显降低。
二、血清PⅢP的测定结果
正常对照组PⅢP为(114.4±30.5) μg/L，吸烟无COPD组为(141.0±36.4) μg/L，明显高于正常对照组(t=2.375，P<0.05)；吸烟伴COPD者为(138.4±27.3) μg/L，明显高于正常对照组(t=3.571，P<0.001)，但与吸烟无COPD组相比，无明显变化。可见吸烟可引起PⅢP增加，但PⅢP增加与是否伴有COPD无明显关系。
三、血清MDA的测定结果
正常对照组MDA为每毫升血清(6.04±2.45) nmol，吸烟无COPD组为每毫升血清(6.31±2.97) nmol，吸烟伴COPD组为每毫升血清(6.66±3.33) nmol，三组间MDA无明显差别。
四、血清弹性蛋白酶活性的测定结果
三组血清弹性蛋白酶活性均很低，每毫升血清<0.05 U。三组间无明显差异。
讨 论
COPD是一种以慢性气流受限为特征的慢性呼吸系疾病，主要包括慢性支气管炎和肺气肿。根据我们的资料，其患病率占我国>15岁人口的3.00%[2]，且病残率高。COPD的发病机制尚不十分清楚，但大量流行病学调查资料表明，吸烟是COPD发病的主要环境因素，在国外约占90%以上，我国为71.6%[3]。可见，戒烟对防治COPD十分重要。戒烟对烟民来说，并非易事，即使是经过专门戒烟训练的人，最终成功者仅10%。文献报道，仅10%～15%吸烟者才会发生COPD[4]，他们被称为 “易感人群”。如果能在广大的吸烟者中把易感者筛选出来，有针对地进行戒烟宣教或劝告将会收到事半功倍的效果。
弹性蛋白酶-抗蛋白酶失衡学说在COPD发病学中的作用已为人们所熟知[5]。各种理化、生物因子可激活肺泡巨噬细胞和中性粒细胞释放血清弹性蛋白酶，该酶分解弹性蛋白等间质成分，引起肺组织破坏，形成肺气肿[6]。给动物气管内滴注胰血清弹性蛋白酶，可成功复制肺气肿模型，也表明该酶在COPD发病中的作用。本研究未能满意地测得血清弹性蛋白酶活性(<0.05 U/ml)，可能提示该酶释放后很快被抗蛋白酶结合而失活，或与检测方法敏感性不够有关。
抗蛋白酶主要有三种，其中最重要的是α1-AT，主要产生于肝脏。在西方国家已明确α1-AT缺乏是COPD的重要宿主因素，而我国一直未被证实。本研究结果表明，吸烟伴COPD者，α1-AT活性明显降低，并与单纯吸烟无COPD者有明显差别，提示α1-AT降低可能是COPD的一个宿主易感因素。α1-AT降低一般认为可能与以下因素有关：(1)遗传；(2)烟雾中含有氧化剂可直接灭活α1-AT[7]；(3)肺泡巨噬细胞和中性粒细胞活化，产生的活性氧自由基使α1-AT失活，弹性蛋白酶与α1-AT结合等。吸烟伴有COPD患者，α1-AT降低的其他机制值得探讨。
PⅢP测定可用以反映组织胶原代谢情况。本研究测得吸烟者(无论是否伴发COPD)血清PⅢP含量明显增加，可能提示烟雾刺激对胶原合成有刺激作用，即胶原合成活跃。国内董碧蓉等[8]的资料也表明，COPD患者血清PⅢP增加。
MDA是脂质过氧化产物。MDA增加可能与吸烟活化中性粒细胞、产生活性氧自由基增多有关。本研究未测得吸烟者(无论是否伴发COPD)血清MDA含量明显变化。作者在另一项动物实验中曾观察到烟雾刺激3个月使金黄地鼠血清MDA明显增高。这种差异的原因有待探讨。
以上结果不仅对了解吸烟者导致COPD的发病机制有所帮助，并可能对发现COPD 吸烟易感人群提供参考。
本课题为九*五攻关课题(96-906-02-03)
参考文献
1 Higgins M. Risk factors associated with chronic obstructive lung disease. Ann N Y Acad Sci， 1991，624:7 -17.
2 程显声，李景周，张珍祥，等.慢性阻塞性肺疾病、肺心病人群防治的研究基线资料分析. 中华结核和呼吸杂志，1998，21：749-752.
3 Tames P. Preventing chronic obstructive pulmonary disease. Lung Respiration, 1992，9:10-13.
4 Jaime WF, Jose LM. Early diagnosis of pulmonary emphysema in smokers. In: Weinbaum G, Giles RE, Krell RD, eds. Pulmonary emphysema. The rationale for therapeutic intervention. New York:Academy Sciences, 1991.363-364.
5 Luisetti M, Piccioni PD, Donnetta, et al. Protease-antiprotease imbalance: local evaluation with bronchoalveolar lavage .Respiration, 1992, 59 Suppl 1:24-27.
6 Linden M, Rasmussen JB, Piitulainen E, et al . Airway inflammation in smokers with nonobstructive and obstructive chronic bronchitis. Am Rev Respir Dis, 1993,48:1226-1232.
7 Wallaert B,Gressier B,Marquette CH,et al. Inactivation of alpha 1-proteinase inhibitors by alveolar inflammatory cells from smoking patients with or without emphysema. Am Rev Respir Dis ,1993， 147 (6 Pt 1):1537-1543.
8 董碧蓉，周静，王曾礼.慢性阻塞性肺疾病患者胶原成份改变的临床意义.中华结核和呼吸杂志，1995，18：301-302.
(收稿：1998-01-16 修回：1998-06-15)