苏林酸对大肠腺癌HT-29细胞增殖的影响及其机制的研究
作者：杨正兵 欧阳钦 魏于全 刘小青 雷松
单位：杨正兵、欧阳钦、刘小青 610041 成都，华西医科大学附属第一医院消化科，魏于全、雷松 肿瘤生物治疗中心
关键词：
中华内科杂志990413 大肠肿瘤是常见的消化道肿瘤，严重危害人类健康。近年流行病学研究发现，经常服用非甾体抗炎药(NSAIDs)者，大肠肿瘤患病率下降近50%[1]。动物试验表明NSAIDs可预防致癌剂所诱发的肠道肿瘤的发生[2]；临床上，NSAIDs中的苏林酸可使家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者的肠道息肉消退[3]，但其机制尚不清楚。本研究目的在于观察苏林酸对培养的结肠腺癌HT-29细胞增殖的影响，并探讨其可能的作用机制。
一、方法
, 百拇医药
1.苏林酸对HT-29细胞形态的影响：按每孔1×105将细胞接种在24孔平板中，37℃、体积分数为5% CO2条件下孵育24小时后换液并加入苏林酸，每12小时观察细胞的形态变化。
2.苏林酸对HT-29细胞增殖的影响：按每孔1×103将细胞接种在96孔平板中，24小时换液后加入苏林酸，使其终浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L。设不加苏林酸和不种细胞的对照。分别培养24、48和72小时，每个浓度每个时点均种3孔，按MTT法测其吸光度(A)值，求其平均值，计算抑制率。
3.苏林酸对HT-29细胞周期的影响：取处理组和对照组细胞，PBS洗3次，加70%冷乙醇4℃过夜，离心后加入含RNase的PI染料，半小时后用上流式细胞仪检测。
4.苏林酸对HT-29细胞的促凋亡作用：(1)分别收集5×106个漂浮和贴壁细胞，常规提取DNA，在1.8%琼脂糖凝胶上40 V电泳2～3小时。(2)收集苏林酸处理后的细胞，制作超薄切片，透射电镜观察照相。
, 百拇医药
5.统计学分析：苏林酸对细胞增殖的影响用平均A值±标准差表示，采用t检验，对细胞周期比例和凋亡发生率的影响用χ2检验。
二、结果
1.对HT-29细胞形态的影响：苏林酸处理后的HT-29细胞失去其正常的梭形或多角形，出现伪足回缩、变圆、变小，部分脱落漂浮于培养液中，时间越长、剂量越大、上述表现越明显，漂浮细胞越多。
2.对HT-29细胞增殖的影响：见表1。苏林酸对HT-29细胞的抑制作用呈时间剂量依赖性，且差异有显著性。
表1 苏林酸对HT-29细胞的生长抑制作用 苏林酸浓度
(mmol/L)
抑制率(%)
, 百拇医药
24小时
48小时
72小时
0.3
5.4±2.7*
9.8±6.7*
16.0±2.6*
0.6
8.9±1.5*
25.3±4.2*
38.0±2.1**
, 百拇医药
0.9
15.4±1.6**
45.1±4.9**
62.3±2.1**
1.2
32.4±2.7**
71.3±3.2**
92.2±1.0**
注：与对照组相比，* P<0.05，** P<0.01
, http://www.100md.com
3.对HT-29细胞周期的影响：见表2。苏林酸可使G0/G1期细胞比例增高，使S期细胞比例降低，具有剂量和时间依赖性，且差异有显著性。
表2 不同浓度苏林酸(mmol/L)对HT-29细胞周期的影响 细胞周期
24小时
48小时
0
0.3
0.6*
0.9*
1.2**
, 百拇医药
0
0.3**
0.6**
0.9**
1.2**
G0/G1
27.3
53.4
55.1
58.2
63.4
, 百拇医药
32.5
56.9
60.8
65.4
70.5
S
42.3
31.2
32.2
31.1
26.2
43.1
26.9
, 百拇医药
21.1
16.9
11.3
G2/M2
20.4
15.5
12.7
10.6
10.4
24.4
16.2
18.1
, http://www.100md.com 18.1
18.2
注：与对照组相比，* P<0.05，** P<0.01
4.对HT-29细胞的促凋亡作用：(1)DNA电泳显示，贴壁细胞无DNA降解，漂浮细胞DNA降解为180～200 bp成倍数的DNA片段，呈典型梯状电泳图谱。(2)透射电镜观察发现经苏林酸处理的细胞出现染色质浓缩成细小团块聚集于核膜处，并可见胞膜下陷包裹核碎孔及细胞器的凋亡小体。
讨论 NSAIDs影响细胞周期的机制尚不清楚，Goldberg等[4]发现：NSAIDs可抑制HT-29细胞表达cdc2、cdc4、cyclin以及磷酸化的Rb(pRb),增强p21WAF-1/CIPL的表达，同时降低突变型p53表达水平，上述蛋白因子参与细胞周期调控，在细胞周期中起重要作用。上述改变阻止细胞进入S期，使其停滞在G0/G1期。
, 百拇医药
NSAIDs诱导结肠癌细胞凋亡的机制尚不确切。Tsujii和DuBios[5]将环氧化物酶2(COX2)基因转染鼠肠上皮细胞，使其表达过量的COX2蛋白。结果转染细胞TGFβ2受体表达受抑，而bcl-2表达增强，对丁酸钠诱导的凋亡抵抗性明显增强，而NSAIDs可逆转上述表型改变。Boolbol等[6]发现APC杂合突变鼠肠黏膜中COX2及前列腺素E2 (PGE2) 水平明显高于无突变鼠，且肠上皮细胞凋亡亦下降27%～47%。经NSAIDs处理后，COX2及PGE2水平降为正常，凋亡亦恢复到无突变鼠水平。表明COX2过表达和PGE2高水平与凋亡受抑有关，同时也表明APC突变与COX2过表达及PGE2高水平有关。有人发现苏林酸代谢物可明显促进非突变APC的表达，但也有学者发现，NSAIDs诱导结肠癌细胞凋亡并不能完全用抑制COX的作用来解释。
, 百拇医药
尽管引起上述改变的机制有待进一步阐明，但上述研究结果提示：诱导细胞凋亡和使细胞生长停滞在GO/G1期可能为苏林酸能有效防治大肠肿瘤的作用机制。随着其作用机制的进一步阐明，NSAIDs可望成为防治大肠肿瘤的有效药物之一。
参考文献
1 Heath CW Jr, Thun MJ, Greenberg ER, et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and human cancer. Report of an interdisciplinary research workshop. Cancer Res , 1994, 54: 2885-2888.
2 Rao CV, Rivenson A, Simi B, et al. Chemoprevention of colon carcinogenesis by sulindac, a nonsteriodal anti-inflammatory agent. Cancer Res, 1995,55: 1464-1472.
, 百拇医药
3 Giardello FM, Hamicton SR, Krash AJ, et al. Treatment of colonic rectal adenomas with sulindac in familial adenomatous polyposis. N Engl J Med , 1993, 328: 1313-1316.
4 Goldberg Y, Nassif II, Piffas A, et al. The anti-proliferative effect of sulindac and sulindac sulfide on HT-29 colon cancer cells: alteration in tumor suppressor and cell cycle-regulatory proteins. Oncogene, 1996,12: 893-901.
5 Tsujii M, DuBios RN. Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase 2. Cell , 1995, 83: 493-501.
6 Boolbol SK, Dannenberg AJ, Chadburn A, et al. Cyclooxygenase-2 overexpression and tumor formation are blocked by sulindac in a murine model of familial adenomatous polyposis. Cancer Res , 1996,56: 2556-2560.
(收稿：1998-01-15 修回：1998-11-30), 百拇医药
单位：杨正兵、欧阳钦、刘小青 610041 成都，华西医科大学附属第一医院消化科，魏于全、雷松 肿瘤生物治疗中心
关键词：
中华内科杂志990413 大肠肿瘤是常见的消化道肿瘤，严重危害人类健康。近年流行病学研究发现，经常服用非甾体抗炎药(NSAIDs)者，大肠肿瘤患病率下降近50%[1]。动物试验表明NSAIDs可预防致癌剂所诱发的肠道肿瘤的发生[2]；临床上，NSAIDs中的苏林酸可使家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者的肠道息肉消退[3]，但其机制尚不清楚。本研究目的在于观察苏林酸对培养的结肠腺癌HT-29细胞增殖的影响，并探讨其可能的作用机制。
一、方法
, 百拇医药
1.苏林酸对HT-29细胞形态的影响：按每孔1×105将细胞接种在24孔平板中，37℃、体积分数为5% CO2条件下孵育24小时后换液并加入苏林酸，每12小时观察细胞的形态变化。
2.苏林酸对HT-29细胞增殖的影响：按每孔1×103将细胞接种在96孔平板中，24小时换液后加入苏林酸，使其终浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L。设不加苏林酸和不种细胞的对照。分别培养24、48和72小时，每个浓度每个时点均种3孔，按MTT法测其吸光度(A)值，求其平均值，计算抑制率。
3.苏林酸对HT-29细胞周期的影响：取处理组和对照组细胞，PBS洗3次，加70%冷乙醇4℃过夜，离心后加入含RNase的PI染料，半小时后用上流式细胞仪检测。
4.苏林酸对HT-29细胞的促凋亡作用：(1)分别收集5×106个漂浮和贴壁细胞，常规提取DNA，在1.8%琼脂糖凝胶上40 V电泳2～3小时。(2)收集苏林酸处理后的细胞，制作超薄切片，透射电镜观察照相。
, 百拇医药
5.统计学分析：苏林酸对细胞增殖的影响用平均A值±标准差表示，采用t检验，对细胞周期比例和凋亡发生率的影响用χ2检验。
二、结果
1.对HT-29细胞形态的影响：苏林酸处理后的HT-29细胞失去其正常的梭形或多角形，出现伪足回缩、变圆、变小，部分脱落漂浮于培养液中，时间越长、剂量越大、上述表现越明显，漂浮细胞越多。
2.对HT-29细胞增殖的影响：见表1。苏林酸对HT-29细胞的抑制作用呈时间剂量依赖性，且差异有显著性。
表1 苏林酸对HT-29细胞的生长抑制作用 苏林酸浓度
(mmol/L)
抑制率(%)
, 百拇医药
24小时
48小时
72小时
0.3
5.4±2.7*
9.8±6.7*
16.0±2.6*
0.6
8.9±1.5*
25.3±4.2*
38.0±2.1**
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0.9
15.4±1.6**
45.1±4.9**
62.3±2.1**
1.2
32.4±2.7**
71.3±3.2**
92.2±1.0**
注：与对照组相比，* P<0.05，** P<0.01
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3.对HT-29细胞周期的影响：见表2。苏林酸可使G0/G1期细胞比例增高，使S期细胞比例降低，具有剂量和时间依赖性，且差异有显著性。
表2 不同浓度苏林酸(mmol/L)对HT-29细胞周期的影响 细胞周期
24小时
48小时
0
0.3
0.6*
0.9*
1.2**
, 百拇医药
0
0.3**
0.6**
0.9**
1.2**
G0/G1
27.3
53.4
55.1
58.2
63.4
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32.5
56.9
60.8
65.4
70.5
S
42.3
31.2
32.2
31.1
26.2
43.1
26.9
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21.1
16.9
11.3
G2/M2
20.4
15.5
12.7
10.6
10.4
24.4
16.2
18.1
, http://www.100md.com 18.1
18.2
注：与对照组相比，* P<0.05，** P<0.01
4.对HT-29细胞的促凋亡作用：(1)DNA电泳显示，贴壁细胞无DNA降解，漂浮细胞DNA降解为180～200 bp成倍数的DNA片段，呈典型梯状电泳图谱。(2)透射电镜观察发现经苏林酸处理的细胞出现染色质浓缩成细小团块聚集于核膜处，并可见胞膜下陷包裹核碎孔及细胞器的凋亡小体。
讨论 NSAIDs影响细胞周期的机制尚不清楚，Goldberg等[4]发现：NSAIDs可抑制HT-29细胞表达cdc2、cdc4、cyclin以及磷酸化的Rb(pRb),增强p21WAF-1/CIPL的表达，同时降低突变型p53表达水平，上述蛋白因子参与细胞周期调控，在细胞周期中起重要作用。上述改变阻止细胞进入S期，使其停滞在G0/G1期。
, 百拇医药
NSAIDs诱导结肠癌细胞凋亡的机制尚不确切。Tsujii和DuBios[5]将环氧化物酶2(COX2)基因转染鼠肠上皮细胞，使其表达过量的COX2蛋白。结果转染细胞TGFβ2受体表达受抑，而bcl-2表达增强，对丁酸钠诱导的凋亡抵抗性明显增强，而NSAIDs可逆转上述表型改变。Boolbol等[6]发现APC杂合突变鼠肠黏膜中COX2及前列腺素E2 (PGE2) 水平明显高于无突变鼠，且肠上皮细胞凋亡亦下降27%～47%。经NSAIDs处理后，COX2及PGE2水平降为正常，凋亡亦恢复到无突变鼠水平。表明COX2过表达和PGE2高水平与凋亡受抑有关，同时也表明APC突变与COX2过表达及PGE2高水平有关。有人发现苏林酸代谢物可明显促进非突变APC的表达，但也有学者发现，NSAIDs诱导结肠癌细胞凋亡并不能完全用抑制COX的作用来解释。
, 百拇医药
尽管引起上述改变的机制有待进一步阐明，但上述研究结果提示：诱导细胞凋亡和使细胞生长停滞在GO/G1期可能为苏林酸能有效防治大肠肿瘤的作用机制。随着其作用机制的进一步阐明，NSAIDs可望成为防治大肠肿瘤的有效药物之一。
参考文献
1 Heath CW Jr, Thun MJ, Greenberg ER, et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and human cancer. Report of an interdisciplinary research workshop. Cancer Res , 1994, 54: 2885-2888.
2 Rao CV, Rivenson A, Simi B, et al. Chemoprevention of colon carcinogenesis by sulindac, a nonsteriodal anti-inflammatory agent. Cancer Res, 1995,55: 1464-1472.
, 百拇医药
3 Giardello FM, Hamicton SR, Krash AJ, et al. Treatment of colonic rectal adenomas with sulindac in familial adenomatous polyposis. N Engl J Med , 1993, 328: 1313-1316.
4 Goldberg Y, Nassif II, Piffas A, et al. The anti-proliferative effect of sulindac and sulindac sulfide on HT-29 colon cancer cells: alteration in tumor suppressor and cell cycle-regulatory proteins. Oncogene, 1996,12: 893-901.
5 Tsujii M, DuBios RN. Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase 2. Cell , 1995, 83: 493-501.
6 Boolbol SK, Dannenberg AJ, Chadburn A, et al. Cyclooxygenase-2 overexpression and tumor formation are blocked by sulindac in a murine model of familial adenomatous polyposis. Cancer Res , 1996,56: 2556-2560.
(收稿：1998-01-15 修回：1998-11-30), 百拇医药