碘对甲状腺细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及Bak表达的影响
作者：刘超 段宇 覃又文 刘翠萍 蒋须勤 陈家伟 张忠邦
单位：210029 南京医科大学第一附属医院内分泌科
关键词：
中华内科杂志991017 碘是制造甲状腺激素的主要原料，是调节甲状腺生长与分化功能的重要因子。晚近的研究表明，碘与多种甲状腺疾病的发生、发展与转归密切相关，并在甲状腺细胞的凋亡过程中承担重要角色[1-3]。本研究采用细胞培养方法及Western 印迹技术，研究碘对甲状腺细胞凋亡相关蛋白表达的影响，旨在探讨碘在甲状腺稳态和甲状腺疾病发病机制中的作用和地位。
一、材料与方法
1.甲状腺细胞培养：甲状腺标本取材于良性孤立性甲状腺腺瘤旁正常组织，经胶原酶和双酶消化，于含5%胎牛血清的改良Ham F12培养液中传代培养。
, 百拇医药
2.碘刺激试验：传代细胞于培养皿中孵育48小时后，吸弃培养液，换以不含(空白对照)或含不同浓度NaI的试验液(0～10-4 mol/L)，继续培养72小时。
3.蛋白质提取：细胞总蛋白提取采用溶解法, 即将细胞从培养皿中刮离于PBS中，离心，沉淀，以500 μl溶解缓冲液悬浮，置4℃振摇30分钟，离心取上清，经分光光度剂测定蛋白质含量。样本于-20℃保存。
4.Western印迹：取40 μg蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将胶中蛋白转移至硝酸纤维膜上，后者放置于含5%脱脂奶的TBS-吐温(TBST)缓冲液中过夜，以TBST洗涤后，转移膜先后于第一和第二抗体中,室温孵育各1.5小时，以化学发光法(BCL-Plus系统，Amersham)显示抗原抗体反应信号，并以光密度自动图像分析系统进行反应信号吸光度扫描。
, 百拇医药
A：无NaI对照；B：NaI 10-8 mol/L；C：NaI 10-6mol/L；D：NaI 10-4mol/L
图1 碘对甲状腺细胞Bcl-2蛋白表达的影响
二、结果
在无NaI存在的条件下，甲状腺细胞可以表达Bcl-2及Bak。经吸光度扫描证实，在10-8～10-4 mol/L浓度区间内，NaI剂量依赖性地抑制甲状腺细胞表达Bcl-2蛋白(图1)，但同一浓度范围的NaI显著增强Bak蛋白的表达(图2)。
讨论 细胞凋亡是一种有别于细胞坏死的生理性死亡过程，其在维持组织细胞的正常生长发育和机体的自身稳定等方面发挥举足轻重的作用。越来越多的资料显示，细胞凋亡在甲状腺稳态和甲状腺疾病的发病机制中占重要地位。
, http://www.100md.com
A：无NaI对照；B：NaI 10-8mol/L；C：NaI 10-6mol/L；D：NaI 10-4 mol/L
图2 碘对甲状腺细胞Bak蛋白表达的影响
细胞凋亡受多种因素的调控，其中，Bcl-2基因家族的作用尤为突出。此基因家族包括Bcl-2、Bax、Mcl-1和Bak等，其蛋白产物对细胞凋亡起着促进(Bak、Bax和Bcl-Xs)或抵抗(Bcl-2、Bcl-Xc和Mcl-1)作用，促凋亡蛋白及抗凋亡蛋白所占的相对比例是决定细胞是否走向凋亡的关键因素。
业已证实，碘能够调节甲状腺细胞碘的转运和有机化，影响甲状腺激素的合成与分泌，并抑制甲状腺细胞的生长功能[1]。但有关碘对人甲状腺细胞凋亡的影响尚未见报道。本研究发现，在10-8～10-4 mol/L浓度范围内，NaI能够显著抑制甲状腺细胞表达抗凋亡蛋白Bcl-2，并增加促凋亡蛋白Bak的生成，提示碘可以促进甲状腺细胞凋亡的发生，此结论与动物研究报道一致[2-4]。早在1986年，比利时学者Mahmoud等[3]首次发现，中等剂量的碘制剂可使缺碘甲状腺发生细胞凋亡。不仅如此，碘尚能诱导RFTL-5细胞株进入细胞凋亡过程[2]。可见，碘在甲状腺稳态中发挥十分重要的作用。
, http://www.100md.com
随着全民应用碘盐的逐步强化及普及，我国同世界其他国家一样，甲状腺疾病尤其是自身免疫性甲状腺疾病的发病率呈普遍上升趋势，这已成为广大医务工作者关注的热点问题。文献报道，细胞凋亡是桥本甲状腺炎等甲状腺疾病发生的主要原因之一[5，6]。结合本研究资料，我们认为，碘与细胞凋亡及各种甲状腺疾病之间存在内在关联性，故不加区别地全民食用碘盐值得进一步商榷。
志谢 德国Ruhr大学M. Derwahl教授和M. Broecker博士对本研究予以的支持与协助
本课题受江苏省卫生厅青年科学基金资助
参考文献
[1] Denef JF, Many MC, von den Hove MF. Iodine-induced thyroid inhibition and cell necrosis: two consequences of the same free radical mediated mechanism? Mol Cell Endocrinol, 1996,121: 101-103.
, http://www.100md.com
[2] Smerdely P, Pitsiavas V, Boyages SC. Evidence that the inhibitory effects of iodide on the thyroid cell proliferation are due to arrest of the cell cycle at G0G1 and G2M phases. Endocrinology, 1993,133:2881-2888.
[3] Mahmoud I, Colin I, Many MC,et al. Direct toxic effect of iodide in excess on iodine-deficient thyroid glands: epithelial necrosis and inflammation association with lipofuscin accumulation. Exp Mol Pathol, 1986,44:259-271.
, 百拇医药
[4] Golstein J, Dumont JE. Cytotoxic effects of iodide on thyroid cells: difference between rat thyroid FRTL-5 cell and primary dog thyrocyte responsiveness. J Endocrinol Invest, 1996,19:119-126.
[5] Hammoud LJ, Lowdell MW, Cerrano PG, et al. Analysis of apoptosis in relation to tissue destruction associated with Hashimoto's autoimmune thyroiditis. J Pathol,1997,182:138-144.
[6] Mitsiades N, Poulaki V, Kotoula V, et al. Fas/Fas ligand up-regulation and Bcl-2 down-regulation may be significant in the pathogenesis of Hashimoto's thyroiditis. J Clin Endocrinol Metab,1998,83:2199-2203.
(收稿：1998-10-20 修回：1999-04-23), 百拇医药
单位：210029 南京医科大学第一附属医院内分泌科
关键词：
中华内科杂志991017 碘是制造甲状腺激素的主要原料，是调节甲状腺生长与分化功能的重要因子。晚近的研究表明，碘与多种甲状腺疾病的发生、发展与转归密切相关，并在甲状腺细胞的凋亡过程中承担重要角色[1-3]。本研究采用细胞培养方法及Western 印迹技术，研究碘对甲状腺细胞凋亡相关蛋白表达的影响，旨在探讨碘在甲状腺稳态和甲状腺疾病发病机制中的作用和地位。
一、材料与方法
1.甲状腺细胞培养：甲状腺标本取材于良性孤立性甲状腺腺瘤旁正常组织，经胶原酶和双酶消化，于含5%胎牛血清的改良Ham F12培养液中传代培养。
, 百拇医药
2.碘刺激试验：传代细胞于培养皿中孵育48小时后，吸弃培养液，换以不含(空白对照)或含不同浓度NaI的试验液(0～10-4 mol/L)，继续培养72小时。
3.蛋白质提取：细胞总蛋白提取采用溶解法, 即将细胞从培养皿中刮离于PBS中，离心，沉淀，以500 μl溶解缓冲液悬浮，置4℃振摇30分钟，离心取上清，经分光光度剂测定蛋白质含量。样本于-20℃保存。
4.Western印迹：取40 μg蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将胶中蛋白转移至硝酸纤维膜上，后者放置于含5%脱脂奶的TBS-吐温(TBST)缓冲液中过夜，以TBST洗涤后，转移膜先后于第一和第二抗体中,室温孵育各1.5小时，以化学发光法(BCL-Plus系统，Amersham)显示抗原抗体反应信号，并以光密度自动图像分析系统进行反应信号吸光度扫描。
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A：无NaI对照；B：NaI 10-8 mol/L；C：NaI 10-6mol/L；D：NaI 10-4mol/L
图1 碘对甲状腺细胞Bcl-2蛋白表达的影响
二、结果
在无NaI存在的条件下，甲状腺细胞可以表达Bcl-2及Bak。经吸光度扫描证实，在10-8～10-4 mol/L浓度区间内，NaI剂量依赖性地抑制甲状腺细胞表达Bcl-2蛋白(图1)，但同一浓度范围的NaI显著增强Bak蛋白的表达(图2)。
讨论 细胞凋亡是一种有别于细胞坏死的生理性死亡过程，其在维持组织细胞的正常生长发育和机体的自身稳定等方面发挥举足轻重的作用。越来越多的资料显示，细胞凋亡在甲状腺稳态和甲状腺疾病的发病机制中占重要地位。
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A：无NaI对照；B：NaI 10-8mol/L；C：NaI 10-6mol/L；D：NaI 10-4 mol/L
图2 碘对甲状腺细胞Bak蛋白表达的影响
细胞凋亡受多种因素的调控，其中，Bcl-2基因家族的作用尤为突出。此基因家族包括Bcl-2、Bax、Mcl-1和Bak等，其蛋白产物对细胞凋亡起着促进(Bak、Bax和Bcl-Xs)或抵抗(Bcl-2、Bcl-Xc和Mcl-1)作用，促凋亡蛋白及抗凋亡蛋白所占的相对比例是决定细胞是否走向凋亡的关键因素。
业已证实，碘能够调节甲状腺细胞碘的转运和有机化，影响甲状腺激素的合成与分泌，并抑制甲状腺细胞的生长功能[1]。但有关碘对人甲状腺细胞凋亡的影响尚未见报道。本研究发现，在10-8～10-4 mol/L浓度范围内，NaI能够显著抑制甲状腺细胞表达抗凋亡蛋白Bcl-2，并增加促凋亡蛋白Bak的生成，提示碘可以促进甲状腺细胞凋亡的发生，此结论与动物研究报道一致[2-4]。早在1986年，比利时学者Mahmoud等[3]首次发现，中等剂量的碘制剂可使缺碘甲状腺发生细胞凋亡。不仅如此，碘尚能诱导RFTL-5细胞株进入细胞凋亡过程[2]。可见，碘在甲状腺稳态中发挥十分重要的作用。
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随着全民应用碘盐的逐步强化及普及，我国同世界其他国家一样，甲状腺疾病尤其是自身免疫性甲状腺疾病的发病率呈普遍上升趋势，这已成为广大医务工作者关注的热点问题。文献报道，细胞凋亡是桥本甲状腺炎等甲状腺疾病发生的主要原因之一[5，6]。结合本研究资料，我们认为，碘与细胞凋亡及各种甲状腺疾病之间存在内在关联性，故不加区别地全民食用碘盐值得进一步商榷。
志谢 德国Ruhr大学M. Derwahl教授和M. Broecker博士对本研究予以的支持与协助
本课题受江苏省卫生厅青年科学基金资助
参考文献
[1] Denef JF, Many MC, von den Hove MF. Iodine-induced thyroid inhibition and cell necrosis: two consequences of the same free radical mediated mechanism? Mol Cell Endocrinol, 1996,121: 101-103.
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[2] Smerdely P, Pitsiavas V, Boyages SC. Evidence that the inhibitory effects of iodide on the thyroid cell proliferation are due to arrest of the cell cycle at G0G1 and G2M phases. Endocrinology, 1993,133:2881-2888.
[3] Mahmoud I, Colin I, Many MC,et al. Direct toxic effect of iodide in excess on iodine-deficient thyroid glands: epithelial necrosis and inflammation association with lipofuscin accumulation. Exp Mol Pathol, 1986,44:259-271.
, 百拇医药
[4] Golstein J, Dumont JE. Cytotoxic effects of iodide on thyroid cells: difference between rat thyroid FRTL-5 cell and primary dog thyrocyte responsiveness. J Endocrinol Invest, 1996,19:119-126.
[5] Hammoud LJ, Lowdell MW, Cerrano PG, et al. Analysis of apoptosis in relation to tissue destruction associated with Hashimoto's autoimmune thyroiditis. J Pathol,1997,182:138-144.
[6] Mitsiades N, Poulaki V, Kotoula V, et al. Fas/Fas ligand up-regulation and Bcl-2 down-regulation may be significant in the pathogenesis of Hashimoto's thyroiditis. J Clin Endocrinol Metab,1998,83:2199-2203.
(收稿：1998-10-20 修回：1999-04-23), 百拇医药