急性脑梗死脑脊液中髓鞘素抗体分泌细胞的检测
作者：王维治 王化冰 李雅丽
单位：150086 哈尔滨医科大学附属第二医院神经科(王维治、王化冰)；牡丹江市第一医院神经科(李雅丽)
关键词：
中华内科杂志991014 早已发现约10%急性脑梗死患者可检出脑脊液寡克隆带而血清中缺如，16%急性脑梗死患者脑脊液IgG指数增高，指示IgG鞘内合成[1]。我们采用酶联免疫斑技术检测了急性脑梗死和其他神经疾病(OND)患者外周血及脑脊液中髓鞘素碱性蛋白(MBP)、髓鞘素结合糖蛋白(MAG)和含脂质蛋白(PLP)抗体分泌细胞。
一、对象和方法
1.研究对象：(1) 急性脑梗死组：颈内动脉AIC患者44例，均为基底节区和侧脑室旁脑梗死，最大病灶层面面积小于15 cm2，除外大面积及腔隙性梗死。男32例，女12例，年龄37～89岁，平均68岁。由神经科医师根据临床症状体征及CT诊断。发病4周内采取外周血和脑脊液，脑脊液单个核细胞(MNC)增多(>5×106/L)3例，寡克隆带阳性3例，IgG指数增高(>0.70) 2例(均认真询问病史排除合并免疫性疾病的可能)。指示血脑屏障损伤的脑脊液与血清白蛋白比值(CSF-Alb/S-Alb)增高9例[1]。(2) OND组：26例，男11例，女15例，年龄44～77岁，平均60岁。包括紧张型头痛13例、偏侧面肌痉挛5例、脊柱骨关节病4例和多发性神经病、单发性神经病、三叉神经痛及核上性眼肌麻痹各1例。脑脊液MNC数、CSF-Alb/S-Alb比值和IgG指数均正常，无寡克隆带。
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2.脑脊液和外周血的MNC分离：腰穿采集脑脊液15 ml，200 g离心10分钟，分离的MNC再以Iscove改良Dulbecco培养液(Flow Laboratories, UK)洗涤后离心，用200 μl加有2 mmol L-谷氨酰胺、抗生素、10% (v/v)胎牛血清(Gibco, UK)的Iscove培养液重悬，MNC数调至(5～10)×104细胞/ml。用淋巴细胞分层液分离外周血MNC，用加FCS的培养液调整MNC数至1×106细胞/ml。
3.抗原制备：MBP、PLP和MAG均从正常人脑髓鞘素中提取。MBP纯度经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，显示在24 kDa处的单一条带。PLP纯化亦经SDS-PAGE，并用Western印迹法和大鼠抗MBP多克隆抗血清验证，证实PLP毫不混杂MBP。MAG的提取物再经琼脂糖CL-6B柱提纯，纯度经SDS-PAGE验证在100 kDa处有单一条带，用结合于100 kDa单一条带的MAG IgM抗体阳性患者血清经Western印迹证实。
, 百拇医药
4.ELISPOT法检测MBP、PLP和MAG抗体分泌细胞：在硝酸纤维膜微量板(Millipore Co, USA)上，每孔包被100 μl浓度10 μg/ml的MBP、MAG或PLP抗原4℃过夜，洗板并用未灭活5% FCS封闭纤维膜上未与抗原结合的剩余位点，每孔加100 μl含1×105 PB-MNC或(5～10)×103 CSF-MNC，外周血取双份检测。微量板置于37℃、7% CO2孵箱过夜，将1/500稀释生物素化山羊抗人IgG、IgA和IgM (Sigma)加入适当孔中。室温孵育4小时，洗板后与稀释的亲合素-生物素过氧化物酶复合物室温孵育1小时，洗板后加底物3-氨基9-乙基卡巴唑和H2O2，显示红褐色斑点后用流水洗板终止反应。每个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞，由不知被检对象临床诊断的专人在解剖显微镜下读板。斑点形成可被抑制分泌作用的莫能菌素抑制，或被放线菌酮促进合成，证明形成的斑点是抗体主动分泌的结果，而非嗜细胞性抗体脱落。结果以每105 MNC含有斑点数表示。双份孔间变异<10%。
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5.统计学方法：实验数据用Mann-Whitney′s U检测处理。
二、结果
1.外周血IgG、IgA、IgM表型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞：约2/3急性脑梗死患者外周血MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞阳性，以IgG型为主，此三类IgG抗体分泌细胞均值分别为3、2.2和2.9个/105 MNC。21例同时检测了PB中此三类IgG抗体分泌细胞，7例有3种、9例有2种、3例有1种抗体分泌细胞，2例全无。急性脑梗死患者外周血此三类的IgA、IgM抗体分泌细胞数较少，出现频率低。OND对照组外周血MBP、MAG和PLP的IgG、IgA、IgM抗体分泌细胞数均值低于AIC组，但差异无显著性。
2.CSF-IgG型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞：急性脑梗死患者CSF此三类IgG抗体分泌细胞较OND组显著增高(表1)，且为外周血同类细胞的80、150和130倍。OND组CSF此三类细胞也高于外周血，但仅是18、12和25倍。
, 百拇医药
3.20例急性脑梗死患者CSF-MNC数可检测2～3种髓鞘素IgG抗体分泌细胞，其中2例同时检测三类抗体分泌细胞，3种均阳性1例，仅MBP-IgG细胞阳性1例；18例随机检查了两种髓鞘素IgG抗体分泌细胞，14例2种均阳性，2例1种阳性，2例皆阴性。
讨论 本组结果表明急性脑梗死与OND患者外周血均有MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞，以IgG表型为主。急性脑梗死患者CSF此三类IgG抗体分泌细胞显著高于OND组，为外周血同类细胞水平80～150倍。说明此类抗体分泌细胞是非特异性的，可发生于不同的疾病；急性脑梗死患者可呈现2～3种髓鞘素抗体分泌细胞，指示这类抗体反应是多特异性的，而且在与CNS病变紧邻的脑脊液中反应强烈。
表1 两组患者脑脊液中髓鞘素碱性蛋白、髓鞘素结合
糖蛋白和含脂质蛋白IgG型抗体分泌细胞比较 组别
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例数
IgG抗体分泌细胞
抗MBP
抗-MAG
抗PLP
急性脑梗死组
44
范围
0～14000
0～1640
0～2000
均数(标准差)
239(398)
, http://www.100md.com
329(542)
373(542)
中位数
75
91
100
阳性例数/检查例数
17/21
19/24
16/18
对照组
26
范围
, 百拇医药
0～175
0～70
0～170
均数(标准差)
40(70)
19(30)
33(59)
中位数
0
0
0
阳性例数/检查例数
4/9
, http://www.100md.com
3/9
3/9
P值
<0.05
<0.01
<0.01
注：抗MBP：髓鞘素碱性蛋白抗体；抗-MAG：髓鞘素结合糖蛋白抗体；抗PLP：含脂质蛋白抗体
我们曾检测急性脑梗死患者MBP和PLP反应性γ-干扰素(IFN-γ)分泌性T细胞，脑脊液中该类细胞约为外周血的100倍[2]。IFN-γ是一种促炎症性细胞因子，主要由Th1样细胞和巨噬细胞产生，其多效性作用包括促进B细胞成熟和抗体产生[3]。以上结果显示急性脑梗死急性缺血损伤可继发对髓鞘素抗原的B细胞和T细胞自身免疫反应上调，脑脊液中呈显著增高趋势。而且，本组急性脑梗死患者CSF-MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞达到了多发性硬化患者水平[4]，但此类反应增高的免疫病理意义还不清楚。
, 百拇医药
近年来大量研究强调，炎性反应是缺血性脑损伤病理生理的组成部分。卒中动物模型证明大脑中动脉闭塞性急性脑梗死发生数小时内，嗜中性白细胞和T淋巴细胞即在病灶附近积聚[5]。脑脊液中促炎症性细胞因子如白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8和粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子在卒中后24小时至2天增高[6]。卒中动物模型应用免疫抑制性转移生长因子的治疗试验已显示在减少脑梗死面积方面有较好作用。因此，应重视急性脑梗死免疫病理机制及治疗对策的研究。
本课题为国家自然科学基金资助项目(编号：39070360)
参考文献
[1] 王维治, 周延凯. 急性脑血管病脑脊液免疫球蛋白系列指标的变化. 中华神经精神科杂志, 1985, 18:90-92.
[2] Wang WZ, Olsson T, Kostulas V, et al. Myelin antigen reactive T cells in cerebrovascular diseases. Clin Exp Immunol, 1992, 88:157-162.
, http://www.100md.com
[3] Sidman CL, Marshall JD, Schultz LD, et al. Gamma-interferon is one of several direct B cell-maturing lymphokines. Nature, 1984, 309:801-804.
[4] Link H, Baig S, Olsson O, et al. Persistent anti-myelin basic protein IgG antibody response in multiple sclerosis cerebrospinal fluid. J Neuroimmunol, 1990, 28:237-248.
[5] Schroeter M, Jander S, Witte OW, et al. Local immune responses in the rat cerebral cortex after middle cerebral artery occlusion. J Neuroimmunol, 1994, 55:195-203.
[6] Tarkowski E, Rosengren L, Blomstrand C, et al. Intrathecal release of pro- and anti-inflammatory cytokines during stroke. Clin Exp Immunol, 1997, 11:492-499.
(收稿：1998-12-30 修回：1999-04-29), 百拇医药
单位：150086 哈尔滨医科大学附属第二医院神经科(王维治、王化冰)；牡丹江市第一医院神经科(李雅丽)
关键词：
中华内科杂志991014 早已发现约10%急性脑梗死患者可检出脑脊液寡克隆带而血清中缺如，16%急性脑梗死患者脑脊液IgG指数增高，指示IgG鞘内合成[1]。我们采用酶联免疫斑技术检测了急性脑梗死和其他神经疾病(OND)患者外周血及脑脊液中髓鞘素碱性蛋白(MBP)、髓鞘素结合糖蛋白(MAG)和含脂质蛋白(PLP)抗体分泌细胞。
一、对象和方法
1.研究对象：(1) 急性脑梗死组：颈内动脉AIC患者44例，均为基底节区和侧脑室旁脑梗死，最大病灶层面面积小于15 cm2，除外大面积及腔隙性梗死。男32例，女12例，年龄37～89岁，平均68岁。由神经科医师根据临床症状体征及CT诊断。发病4周内采取外周血和脑脊液，脑脊液单个核细胞(MNC)增多(>5×106/L)3例，寡克隆带阳性3例，IgG指数增高(>0.70) 2例(均认真询问病史排除合并免疫性疾病的可能)。指示血脑屏障损伤的脑脊液与血清白蛋白比值(CSF-Alb/S-Alb)增高9例[1]。(2) OND组：26例，男11例，女15例，年龄44～77岁，平均60岁。包括紧张型头痛13例、偏侧面肌痉挛5例、脊柱骨关节病4例和多发性神经病、单发性神经病、三叉神经痛及核上性眼肌麻痹各1例。脑脊液MNC数、CSF-Alb/S-Alb比值和IgG指数均正常，无寡克隆带。
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2.脑脊液和外周血的MNC分离：腰穿采集脑脊液15 ml，200 g离心10分钟，分离的MNC再以Iscove改良Dulbecco培养液(Flow Laboratories, UK)洗涤后离心，用200 μl加有2 mmol L-谷氨酰胺、抗生素、10% (v/v)胎牛血清(Gibco, UK)的Iscove培养液重悬，MNC数调至(5～10)×104细胞/ml。用淋巴细胞分层液分离外周血MNC，用加FCS的培养液调整MNC数至1×106细胞/ml。
3.抗原制备：MBP、PLP和MAG均从正常人脑髓鞘素中提取。MBP纯度经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，显示在24 kDa处的单一条带。PLP纯化亦经SDS-PAGE，并用Western印迹法和大鼠抗MBP多克隆抗血清验证，证实PLP毫不混杂MBP。MAG的提取物再经琼脂糖CL-6B柱提纯，纯度经SDS-PAGE验证在100 kDa处有单一条带，用结合于100 kDa单一条带的MAG IgM抗体阳性患者血清经Western印迹证实。
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4.ELISPOT法检测MBP、PLP和MAG抗体分泌细胞：在硝酸纤维膜微量板(Millipore Co, USA)上，每孔包被100 μl浓度10 μg/ml的MBP、MAG或PLP抗原4℃过夜，洗板并用未灭活5% FCS封闭纤维膜上未与抗原结合的剩余位点，每孔加100 μl含1×105 PB-MNC或(5～10)×103 CSF-MNC，外周血取双份检测。微量板置于37℃、7% CO2孵箱过夜，将1/500稀释生物素化山羊抗人IgG、IgA和IgM (Sigma)加入适当孔中。室温孵育4小时，洗板后与稀释的亲合素-生物素过氧化物酶复合物室温孵育1小时，洗板后加底物3-氨基9-乙基卡巴唑和H2O2，显示红褐色斑点后用流水洗板终止反应。每个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞，由不知被检对象临床诊断的专人在解剖显微镜下读板。斑点形成可被抑制分泌作用的莫能菌素抑制，或被放线菌酮促进合成，证明形成的斑点是抗体主动分泌的结果，而非嗜细胞性抗体脱落。结果以每105 MNC含有斑点数表示。双份孔间变异<10%。
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5.统计学方法：实验数据用Mann-Whitney′s U检测处理。
二、结果
1.外周血IgG、IgA、IgM表型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞：约2/3急性脑梗死患者外周血MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞阳性，以IgG型为主，此三类IgG抗体分泌细胞均值分别为3、2.2和2.9个/105 MNC。21例同时检测了PB中此三类IgG抗体分泌细胞，7例有3种、9例有2种、3例有1种抗体分泌细胞，2例全无。急性脑梗死患者外周血此三类的IgA、IgM抗体分泌细胞数较少，出现频率低。OND对照组外周血MBP、MAG和PLP的IgG、IgA、IgM抗体分泌细胞数均值低于AIC组，但差异无显著性。
2.CSF-IgG型MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞：急性脑梗死患者CSF此三类IgG抗体分泌细胞较OND组显著增高(表1)，且为外周血同类细胞的80、150和130倍。OND组CSF此三类细胞也高于外周血，但仅是18、12和25倍。
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3.20例急性脑梗死患者CSF-MNC数可检测2～3种髓鞘素IgG抗体分泌细胞，其中2例同时检测三类抗体分泌细胞，3种均阳性1例，仅MBP-IgG细胞阳性1例；18例随机检查了两种髓鞘素IgG抗体分泌细胞，14例2种均阳性，2例1种阳性，2例皆阴性。
讨论 本组结果表明急性脑梗死与OND患者外周血均有MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞，以IgG表型为主。急性脑梗死患者CSF此三类IgG抗体分泌细胞显著高于OND组，为外周血同类细胞水平80～150倍。说明此类抗体分泌细胞是非特异性的，可发生于不同的疾病；急性脑梗死患者可呈现2～3种髓鞘素抗体分泌细胞，指示这类抗体反应是多特异性的，而且在与CNS病变紧邻的脑脊液中反应强烈。
表1 两组患者脑脊液中髓鞘素碱性蛋白、髓鞘素结合
糖蛋白和含脂质蛋白IgG型抗体分泌细胞比较 组别
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例数
IgG抗体分泌细胞
抗MBP
抗-MAG
抗PLP
急性脑梗死组
44
范围
0～14000
0～1640
0～2000
均数(标准差)
239(398)
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329(542)
373(542)
中位数
75
91
100
阳性例数/检查例数
17/21
19/24
16/18
对照组
26
范围
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0～175
0～70
0～170
均数(标准差)
40(70)
19(30)
33(59)
中位数
0
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0
阳性例数/检查例数
4/9
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3/9
3/9
P值
<0.05
<0.01
<0.01
注：抗MBP：髓鞘素碱性蛋白抗体；抗-MAG：髓鞘素结合糖蛋白抗体；抗PLP：含脂质蛋白抗体
我们曾检测急性脑梗死患者MBP和PLP反应性γ-干扰素(IFN-γ)分泌性T细胞，脑脊液中该类细胞约为外周血的100倍[2]。IFN-γ是一种促炎症性细胞因子，主要由Th1样细胞和巨噬细胞产生，其多效性作用包括促进B细胞成熟和抗体产生[3]。以上结果显示急性脑梗死急性缺血损伤可继发对髓鞘素抗原的B细胞和T细胞自身免疫反应上调，脑脊液中呈显著增高趋势。而且，本组急性脑梗死患者CSF-MBP、MAG和PLP抗体分泌细胞达到了多发性硬化患者水平[4]，但此类反应增高的免疫病理意义还不清楚。
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近年来大量研究强调，炎性反应是缺血性脑损伤病理生理的组成部分。卒中动物模型证明大脑中动脉闭塞性急性脑梗死发生数小时内，嗜中性白细胞和T淋巴细胞即在病灶附近积聚[5]。脑脊液中促炎症性细胞因子如白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8和粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子在卒中后24小时至2天增高[6]。卒中动物模型应用免疫抑制性转移生长因子的治疗试验已显示在减少脑梗死面积方面有较好作用。因此，应重视急性脑梗死免疫病理机制及治疗对策的研究。
本课题为国家自然科学基金资助项目(编号：39070360)
参考文献
[1] 王维治, 周延凯. 急性脑血管病脑脊液免疫球蛋白系列指标的变化. 中华神经精神科杂志, 1985, 18:90-92.
[2] Wang WZ, Olsson T, Kostulas V, et al. Myelin antigen reactive T cells in cerebrovascular diseases. Clin Exp Immunol, 1992, 88:157-162.
, http://www.100md.com
[3] Sidman CL, Marshall JD, Schultz LD, et al. Gamma-interferon is one of several direct B cell-maturing lymphokines. Nature, 1984, 309:801-804.
[4] Link H, Baig S, Olsson O, et al. Persistent anti-myelin basic protein IgG antibody response in multiple sclerosis cerebrospinal fluid. J Neuroimmunol, 1990, 28:237-248.
[5] Schroeter M, Jander S, Witte OW, et al. Local immune responses in the rat cerebral cortex after middle cerebral artery occlusion. J Neuroimmunol, 1994, 55:195-203.
[6] Tarkowski E, Rosengren L, Blomstrand C, et al. Intrathecal release of pro- and anti-inflammatory cytokines during stroke. Clin Exp Immunol, 1997, 11:492-499.
(收稿：1998-12-30 修回：1999-04-29), 百拇医药