多种肝外组织内丙型肝炎病毒RNA和抗原表达的研究
作者：严福明 郝飞 赵利斌 顾长海 陈安慎 赵西平 郝连杰
单位：430010 武汉，解放军第161中心医院传染科(严福明、赵利斌、陈安慎)；重庆，第三军医大学西南医院全军传染病专科中心(郝飞、顾长海)；武汉，同济医科大学同济医院临床免疫研究室(赵西平、郝连杰)
关键词：
中华内科杂志991013 我们分别采用原位杂交和链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P)法检测了9例丙型肝炎患者肝外组织内丙型肝炎病毒(HCV) RNA和多种抗原。
一、资料与方法
9例均为1986～1994年收住院的重型肝炎死亡患者。男8例，女1例。年龄25～48岁。经血清学(抗-HCV)、肝组织内HCV RNA和抗原检测证实为HCV感染者，均合并乙型肝炎病毒(HBV)感染。患者肾、心、胰腺、肠(仅5例)、胆囊(仅1例)和肝等共42份标本取自尸解组织存档石蜡块。
, http://www.100md.com
原位杂交和S-P 方法及特异性确证实验设置参照文献[1，2]。主要试剂： Dig-HCV cDNA探针(长145 bp，针对HCV 5′ UTR，同济医科大学同济医院临床免疫研究室提供) ；抗-HCV CP10、抗-HCV NS3、抗-HCV NS5单克隆抗体和S-P法试剂盒及3， 3-二氨基苯联胺(DAB)显色试剂盒[2]。
二、结果
1.特异性确证实验：(1) 原位杂交法：分别以预杂交液替代探针杂交，以RNase预处理后再杂交和以未标记探针杂交，原阳性颗粒均消失；阴性组织对照为阴性。(2)S-P法：阳性对照为阳性结果；阴性组织对照和第一抗体及试剂替代对照均为阴性。
2.肝外组织内HCV RNA和抗原表达情况：9例中6例(66.7%)涉及21份(63.6%) 肝外组织检出HCV抗原，5例(55.6%)涉及9份(27.3%)标本同时检出HCV RNA(表1)。在 21份HCV NS3、NS5和CP10阳性肝外组织中，1种抗原阳性1份(4.8%)，2种同时阳性12份( 57.1%)，3种同时阳性8份(38.1%)。HCV RNA定位于胞浆内或聚集于核膜下；抗原只有胞浆型。心肌细胞(图1,2)，肠腺上皮细胞，胰腺的腺泡细胞、间质细胞和腺导管上皮细胞(图3)，胆囊黏膜窦上皮细胞，肾小管上皮细胞、间质细胞和肾小球(图4)内等均可检出HCV RNA和抗原，但表达阳性细胞数均少。HCV RNA 和抗原表达阳性与组织病变无明确相关性。
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图1 丙型肝炎病毒(HCV)CP10表达阳性颗粒呈棕色，定位于心肌细胞胞浆内，呈均质型(↑指处) S-P法×400
图2 HCV RNA表达阳性颗粒呈紫色(下图同)，定位于心肌细胞胞浆内(↑指处) 原位杂交×400
图3 HCV RNA在胰腺导管上皮细胞内表达(↑指处) 原位杂交×400
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图4 HCV RNA阳性颗粒致密，浓聚于肾小球内(↑指处) 原位杂交×400
表1 各种组织内丙型肝炎病毒RNA和抗原(Ag)检出情况 例号
肝
肾
心
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肠
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注:ND:未检测；*该例胆囊组织内HCV RNA和抗原均阳性
讨论 有学者用聚合酶链反应(PCR) 方法在HCV 感染者肝外组织中检出HCV RNA及其负链[3，4]，因实验不能完全排除来自血液污染，又未对细胞内HCV RNA 定位检测，其结果很难反映肝外组织内HCV感染状况。本实验在HCV感染者肝外多种组织细胞内不仅检出HCV RNA ，还同时检出NS3、NS5和CP10等，表明HCV能感染多种肝外组织，且很可能在其细胞内增殖复制。但未发现HCV RNA 和抗原表达与组织病变有明确相关性，提示HCV对肝外组织可能并不致病， 其感染属一种伴随状态。体内多种组织被感染，使HCV更难以被机体清除；可能作为HCV储存库，被感染肝外组织还为肝组织的反复感染提供病毒来源等，可能为丙型肝炎易慢性化的重要原因之一。本课题受全军医药卫生科研基金资助(编号：98D066)
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参考文献
[1] 赵西平，唐振亚，杨东亮，等.丙型肝炎病毒感染者肝组织中丙型肝炎病毒RNA原位杂交研究.同济医科大学学报， 1997 ，26： 365-367.
[2] 严福明，郝飞，顾长海.重型病毒性肝炎肝组织内丙型肝炎病毒抗原表达的研究.第三军医大学学报，1998，20：412-414.
[3] Okabe M, Fukuda K, Arakawa K, et al. Chronic variant of myocarditis associated with hepatitis C virus infection. Circulation,1997,96:22-24.
[4] Sugiyama K, Kato N, Ikeda M，et al. Hepatitis C virus in pelvic lymph nodes and female reproductive organs. Jpn J Cancer Res, 1997,88:925-927.
(收稿：1999-01-04 修回：1999-04-13), 百拇医药
单位：430010 武汉，解放军第161中心医院传染科(严福明、赵利斌、陈安慎)；重庆，第三军医大学西南医院全军传染病专科中心(郝飞、顾长海)；武汉，同济医科大学同济医院临床免疫研究室(赵西平、郝连杰)
关键词：
中华内科杂志991013 我们分别采用原位杂交和链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P)法检测了9例丙型肝炎患者肝外组织内丙型肝炎病毒(HCV) RNA和多种抗原。
一、资料与方法
9例均为1986～1994年收住院的重型肝炎死亡患者。男8例，女1例。年龄25～48岁。经血清学(抗-HCV)、肝组织内HCV RNA和抗原检测证实为HCV感染者，均合并乙型肝炎病毒(HBV)感染。患者肾、心、胰腺、肠(仅5例)、胆囊(仅1例)和肝等共42份标本取自尸解组织存档石蜡块。
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原位杂交和S-P 方法及特异性确证实验设置参照文献[1，2]。主要试剂： Dig-HCV cDNA探针(长145 bp，针对HCV 5′ UTR，同济医科大学同济医院临床免疫研究室提供) ；抗-HCV CP10、抗-HCV NS3、抗-HCV NS5单克隆抗体和S-P法试剂盒及3， 3-二氨基苯联胺(DAB)显色试剂盒[2]。
二、结果
1.特异性确证实验：(1) 原位杂交法：分别以预杂交液替代探针杂交，以RNase预处理后再杂交和以未标记探针杂交，原阳性颗粒均消失；阴性组织对照为阴性。(2)S-P法：阳性对照为阳性结果；阴性组织对照和第一抗体及试剂替代对照均为阴性。
2.肝外组织内HCV RNA和抗原表达情况：9例中6例(66.7%)涉及21份(63.6%) 肝外组织检出HCV抗原，5例(55.6%)涉及9份(27.3%)标本同时检出HCV RNA(表1)。在 21份HCV NS3、NS5和CP10阳性肝外组织中，1种抗原阳性1份(4.8%)，2种同时阳性12份( 57.1%)，3种同时阳性8份(38.1%)。HCV RNA定位于胞浆内或聚集于核膜下；抗原只有胞浆型。心肌细胞(图1,2)，肠腺上皮细胞，胰腺的腺泡细胞、间质细胞和腺导管上皮细胞(图3)，胆囊黏膜窦上皮细胞，肾小管上皮细胞、间质细胞和肾小球(图4)内等均可检出HCV RNA和抗原，但表达阳性细胞数均少。HCV RNA 和抗原表达阳性与组织病变无明确相关性。
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图1 丙型肝炎病毒(HCV)CP10表达阳性颗粒呈棕色，定位于心肌细胞胞浆内，呈均质型(↑指处) S-P法×400
图2 HCV RNA表达阳性颗粒呈紫色(下图同)，定位于心肌细胞胞浆内(↑指处) 原位杂交×400
图3 HCV RNA在胰腺导管上皮细胞内表达(↑指处) 原位杂交×400
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图4 HCV RNA阳性颗粒致密，浓聚于肾小球内(↑指处) 原位杂交×400
表1 各种组织内丙型肝炎病毒RNA和抗原(Ag)检出情况 例号
肝
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注:ND:未检测；*该例胆囊组织内HCV RNA和抗原均阳性
讨论 有学者用聚合酶链反应(PCR) 方法在HCV 感染者肝外组织中检出HCV RNA及其负链[3，4]，因实验不能完全排除来自血液污染，又未对细胞内HCV RNA 定位检测，其结果很难反映肝外组织内HCV感染状况。本实验在HCV感染者肝外多种组织细胞内不仅检出HCV RNA ，还同时检出NS3、NS5和CP10等，表明HCV能感染多种肝外组织，且很可能在其细胞内增殖复制。但未发现HCV RNA 和抗原表达与组织病变有明确相关性，提示HCV对肝外组织可能并不致病， 其感染属一种伴随状态。体内多种组织被感染，使HCV更难以被机体清除；可能作为HCV储存库，被感染肝外组织还为肝组织的反复感染提供病毒来源等，可能为丙型肝炎易慢性化的重要原因之一。本课题受全军医药卫生科研基金资助(编号：98D066)
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参考文献
[1] 赵西平，唐振亚，杨东亮，等.丙型肝炎病毒感染者肝组织中丙型肝炎病毒RNA原位杂交研究.同济医科大学学报， 1997 ，26： 365-367.
[2] 严福明，郝飞，顾长海.重型病毒性肝炎肝组织内丙型肝炎病毒抗原表达的研究.第三军医大学学报，1998，20：412-414.
[3] Okabe M, Fukuda K, Arakawa K, et al. Chronic variant of myocarditis associated with hepatitis C virus infection. Circulation,1997,96:22-24.
[4] Sugiyama K, Kato N, Ikeda M，et al. Hepatitis C virus in pelvic lymph nodes and female reproductive organs. Jpn J Cancer Res, 1997,88:925-927.
(收稿：1999-01-04 修回：1999-04-13), 百拇医药