胰腺癌患者胰液中K-ras基因突变的检测及其意义
作者：龚晓明 陈元方 陈原稼 陆星华
单位：100730 中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院消化内科
关键词：胰腺肿瘤；胰液；基因，ras
中华内科杂志991008 【摘要】 目的 通过对经逆行胰胆管造影(ERCP)所获胰液的K-ras基因突变检测，以探索胰腺癌诊断的新方法。方法 应用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性的方法检测胰腺良、恶性疾病组织物、胰液上清和细胞的K-ras突变。结果 胰腺癌和胰腺良性疾病标本分别有80%和33%的K-ras突变率。胰液上清检测时，PCR有18%未获得成功，胰腺癌胰液K-ras突变率为71%(15/21)，而胰腺良性疾病无一例有K-ras的突变。用胰液细胞有4% PCR未能获得成功，胰腺癌胰液细胞K-ras的突变率为65%(11/17)，良性疾病中有1例(1/7)检测到K-ras突变。综合上清与细胞的结果，在78%(21/27)的胰腺癌患者的胰液中检测到K-ras突变，明显高于胰腺良性疾病患者的8%(1/13)(P<0.001)。K-ras的突变率与肿瘤的部位及大小无统计学差异。结论 应用胰液检测K-ras突变有助于胰腺癌的诊断。
, 百拇医药
K-ras mutation in pancreatic juice from patients with pancreatic carcinoma
GONG Xiaoming, CHEN Yuanfang, CHEN Yuanjia, et al.
Department of Gastroenterology , Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730
【Abstract】 Objective Pancreatic neoplasm, which is considered as one of the most malignant tumors in humans, is now increasing steadily in frequency. The 5-year-survival rate is less than 5%. In order to detect it in early stage, we tried to analyze K-ras mutation in pancreatic juice collected during ERCP after injection of secretin. Mutation of coden 12 in exon 1 of K-ras gene was reported as high as 90% in pancreatic cancer, but much less in benign pancreatic disease. Methods 47 patients at Peking Union Medical College Hospital between 1994 and 1998 were enrolled. Pancreatic juice collected during ERCP after injection of 100u secretin , was briefly centrifuged and the sediment was resuspended with PBS. Pancreatic juice supernatant and pancreatic cells were stored at -80℃ separately. DNA of the cells and supernatant of the juice were extracted. K-ras point mutation was investigated in the DNA of these supernatant and cells by means of two-stage polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism (PCR/RFLP). Results When the supernatant of the pancreatic juice was used, the PCR successful rate was 82% , K-ras mutation rate of the pancreatic carcinomas was 71% (15/21) compared with 0% (0/7) in benign pancreatic disease (3 chronic pancreatitis, 3 insulinoma and 1 pancreatic cyst). When the centrifuged pancreatic cells were used, the successful rate increased to 96%, sixty-five percent (11/17) of pancreatic carcinomas had K-ras mutation; mutation was also detected in 1/7 of the cases with benign pancreatic diseases (an insulinoma). In total, 78% (21/27) of the cases with pancreatic carcinomas has mutant alleles compared with 8% (1/13) of the benign pancreatic diseases(P<0.001) when pancreatic juice was used to detect K-ras gene point mutation. In terms of the location of the pancreatic cancer, K-ras mutation rate was not statistically different between the head (80%) and the body + tail(75%). The mutation rate did not vary with the size of the tumor. Conclusion Detection of coden 12 of K-ras mutation in pancreatic juice can be used in differentiating pancreatic carcinomas from benign pancreatic diseases. It has high sensitivity and specificity.
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【Key words】 Pancreatic neoplasms Pancreatic juice Gene, ras
胰腺癌是一高度恶性的肿瘤，其5年生存率低于5%，近年来其患病率有明显的上升迹象。提高其早期发现率，能够使大部分患者获得手术切除而提高其生存率。现认为K-ras基因是与胰腺癌高度相关的癌基因，其第一外显子12密码子的点突变在胰腺癌组织中高达90%[1]，但在胰腺良性疾病中少有突变，因此可能有助于胰腺癌的诊断。本研究旨在探讨检测胰液K-ras基因突变来诊断胰腺癌的可能性。
材料与方法
一、 标本来源与病例选择
胰腺手术标本组织来自北京协和医院外科手术切除之胰腺组织，均经病理确诊，计有胰腺癌10例、胰腺其他恶性肿瘤1例、胰腺良性疾病3例、正常胰腺4例。胰液标本取自北京协和医院1994～1998年门诊接受逆行胰胆管造影(ERCP)患者，计有胰腺癌28例、胰腺良性疾病13例，病例包括病理确诊者及临床诊断者，后者的入组标准如下。
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1.胰腺癌：(1)至少有如下2项以上的影像学支持：①B超提示胰腺有低密度区、胰管扩张以及胆总管和胆囊肿大；②CT提示胰腺局部增大和占位性病变；③ERCP提示胰管或胆管的截然中断、断端变钝、管壁僵硬不规则或有双管征；④选择性腹腔动脉血管造影有胰腺内肿瘤血管征或胰外血管受侵(有血管的狭窄、中断)；⑤经皮肝穿刺胆道造影(PTC)示有胆总管的偏心狭窄或阻塞；⑥超声内镜示有胰腺区低密度占位性病变；⑦核磁共振胰胆管造影(MRCP)示有胰管或胆总管的狭窄、扩张或有占位性病变。(2)手术中探查扪及实性肿物加至少1条影像学证据。
2.慢性胰腺炎：(1)至少有如下2项以上的影像学支持：①B超提示胰腺有胰腺钙化、胰管结石、胰腺假性囊肿；②CT提示胰腺有胰腺钙化、胰管结石、胰腺假性囊肿；③ERCP显示有胰管扭曲、扩张、囊性扩张；④MRCP示有胰管或胆总管的狭窄、扩张、变形；⑤超声内镜提示有胰管扩张、变形；(2)有以上1项影像学依据加1项胰腺外分泌功能检查的异常(其中包括：①Secretin试验阳性；②大便脂肪定量阳性；③ BT-PABA试验重复2次明显不正常)。(3)有1项的影像学依据加典型的胰腺炎临床表现，如反复急性胰腺炎病史、反复的脂肪泻、糖尿病史、长期饮酒史和反复的进餐后上腹痛史。
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二、胰液的收集
常规ERCP术时，行胰胆管造影后，于静脉内注入100 U促胰泌素，利用胰管内插管(Cannula PR-10Q-1， 直径2.2 mm)收集此后10分钟内的胰液。经1 000 r/min离心10分钟，吸出胰液上清，用PBS重悬离心的细胞，重复离心弃去PBS，将胰液上清与离心细胞分别保存于-80℃。
三、DNA的提取
胰腺组织DNA用常规酚氯仿法[2]。胰液DNA提取如下：取0.4 ml胰液，融开后，加入等体积的DNA抽提液[10 mmol/L Tris.HCl (pH 8.0)、1 mmol/L EDTA (pH 8.0)、150 mmol/L NaCl2、5% SDS](若为胰液离心细胞，则加0.8 ml的DNA抽提液)。混匀后，置37℃恒温水浴1小时，加入蛋白酶K至终浓度100～200 mg/L，53～60℃恒温水浴振荡过夜。平衡酚、酚氯仿、氯仿各萃取1遍。离心后上清用醋酸氨和无水乙醇沉淀，干燥，双蒸水溶解保存。
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四、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测
每组检测均以已确定有K-ras 12密码子突变的人胰腺癌细胞株Pu-Pan-1细胞为阳性对照，正常胰腺组织为阴性对照，并设无模板空白对照。采用富集性PCR-RFLP的分析方法[3]。此方法需经2次PCR及2次酶切。PCR反应体系组成：40 μl反应总体积，dNTP 0.156 mmol/L，PCR buffer 1×(KCl 50 mmol/L， Tris.HCl 10 mmol/L， Tron.X-100 0.1%)，MgCl2 1.88 mmol/L, DMSO 7.5%, KR5 3.125×10-7mol/L, KR32或KR31 3.125×10-7mol/L, Taq酶2 U。PCR引物为：KR5(sense)-5′ACTGAATAT-AAACTTGTGGTAGTTGGAC*CT3′；KR3-1(antisense)-5′TCAAAGAATGGTCCTGG*ACC3′；KR3-2(antisense)-5′TGCACCAGTAATATGCATAT3′(*为错配碱基)。酶切条件为40 μl PCR产物加0.5 μl BstN1(Biolabs公司)，60℃酶切2小时。第1次PCR 取5～8 μl DNA用作模板，KR5及KR31为引物，PCR参数为94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟，循环20次，最后72℃、4分钟。第1次酶切后取2 μl酶切产物用作第2次PCR的模板，PCR条件同前，惟循环次数增为35次，第2次酶切后取20～25 μl产物作2%琼脂糖凝胶电泳分析。
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五、统计学处理
采用四格表卡方计算P值。
结果
1.胰腺手术标本中K-ras检测结果：胰腺癌和胰腺良性疾病标本分别有80%和33%的K-ras突变率(表1)。
2.胰液中K-ras突变检测结果：(1)PCR成功率：在34例胰液上清的检测中，有6例PCR未能成功地扩出条带；26例胰液细胞检测中，有1例未能成功地扩出条带。(2)K-ras突变：胰腺癌胰液K-ras突变率为71%(图1，表2)；胰液离心细胞的K-ras突阳性对照Pu-Pan-1胰腺癌细胞中出现的143 kb条带为K-ras突变型(泳道3)。泳道4、5、6为3例胰腺癌患者的胰液上清标本，泳道7为一壶腹腺瘤患者的手术标本，泳道8为Marker pBR322/Hinf1变率为65%(图2，表3)。在同时检测上清与离心细胞的11例中，8例上清与细胞的突变情况一致，3例不一致(2例胰液上清为突变型K-ras，胰液细胞为野生型K-ras，1例为上清野生型、细胞突变型K-ras)。在同时检测了胰液与肿瘤标本的3例中，K-ras突变结果完全一致。
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表1 K-ras在手术标本中的检测情况 分 类
野生型
突变型
总例数
阳性率
(%)
胰腺癌
2
8
10
80
腺癌
1
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7
8
-
囊腺癌
0
1
1
-
类型未定
1
0
1
-
其他胰腺恶性肿瘤
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1
0
1
0
胰腺良性疾病
2
1
3
1/3
慢性胰腺炎
1
0
1
-
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胰岛细胞瘤
1
1
2
-
正常胰腺
4
0
4
0
表2 K-ras在胰腺疾病胰液上清中的检测情况 分 类
野生型
突变型
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总例数
阳性率
(%)
胰腺癌
6
15
21
71
病理确诊病例
3
10
13
-
腺癌
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3
7
10
-
囊腺癌
0
1
1
-
类型未定
0
2
2
-
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临床诊断病例
3
5
8
-
胰腺良性疾病
7
0
7
0
慢性胰腺炎
3
0
4
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-
胰岛细胞瘤
3
0
3
-
胰头囊肿
1
0
1
图1 胰液上清K-ras突变的检测
综合胰液上清及胰液细胞检测的结果，K-ras在胰腺良、恶性疾病胰液中突变率为78%，特异性为92%。胰腺良性疾病K-ras的突变率为8%，两组间差异有显著性(P<0.001，χ2=17.4+)。
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图2 胰液细胞K-ras突变的检测
表3 K-ras在胰腺疾病胰液离心细胞中的检测情况 分类
野生型
突变型
总例数
阳性率(%)
胰腺癌(总计)
6
11
17
65
病理确诊病例
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3
7
10
-
腺癌
2
5
7
-
类型未定
1
2
3
-
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临床诊断病例
3
4
7
-
胰腺良性疾病
6
1
7
1/7
慢性胰腺炎
3
0
3
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-
胰岛细胞瘤
2
1
3
-
胰腺囊肿
1
0
1
-
3.K-ras突变率与肿瘤部位、大小的关系：综合胰液K-ras检测及标本K-ras检测的结果，计算了K-ras基因在胰头和胰体尾的突变分别为81%(17/21)和69%(9/13)，两者差异无显著性 (P=0.43, χ2=0.61)。肿瘤<5 cm者突变率为80%(8/10)，>5 cm者为75%(9/12)，两者差异无显著性。本组病例中<2 cm的早期胰腺癌仅1例，未作统计分析。
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4.K-ras与CA19-9的相关性：同组患者CA19-9用于胰腺癌诊断的敏感性为83%，特异性为70%。依照CA19-9正常、异常，K-ras突变、野生将患者分为4组(表4)。K-ras突变与CA19-9异常的符合率为62.5%。如以CA19-9、K-ras其中1项异常作为诊断指标，其敏感性将增加为96%，特异性为60%。
表4 CA19-9与K-ras突变的相关性 分组
CA19-9异常
CA19-9正常
K-ras突变
K-ras野生
K-ras突变
K-ras野生
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胰腺癌组
15
5
3
1
胰腺良性疾病组
0
3
1
6
讨论
1.K-ras与肿瘤的关系：ras基因最初是在NIH/3T3细胞的转化实验中被发现的，转导了ras基因的NIH/3T3细胞能发生转化，从而确定了其癌基因的地位。进一步的研究发现ras基因在多数肿瘤中有突变[1]。这种突变能导致保守区氨基酸序列改变，产生持续性刺激信号，导致细胞的持续生长。
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在胰腺癌常有K-ras基因突变，且几乎都集中于第一外显子的12密码子。K-ras 12密码子的野生型为GGT，突变型常见为GAT、GTT、CGT 3种，此3种突变类型占所有突变类型的60%～100%。文献中报道的胰腺癌K-ras突变率在75%～95%。由于其突变集中于一个位点，这就为我们检测其K-ras基因的突变提供了方便。
2.K-ras在胰腺癌早期诊断中的意义：由于胰腺癌诊断上的困难，近些年在国际上已尝试利用各种标本K-ras突变的检测来摸索胰腺癌诊断的新手段，包括胰腺细针穿刺组织、胰液、十二指肠引流液等，所获得的K-ras突变率在45%～100%不等。利用胰液来检测K-ras突变是研究热点之一。经ERCP获取胰液检测K-ras基因的点突变，可能对胰腺癌的诊断有所帮助。
我们的结果表明，在胰腺癌患者的胰液中K-ras基因有较高的突变率，具有较高的敏感性(78%)与特异性(92%)，与在胰腺癌手术标本中检测到的K-ras突变情况类似，说明其可以反映患者肿瘤组织的基因突变，因而具有诊断价值。该结果与国外文献中的报道基本一致[4，5]，说明胰液K-ras基因突变可以作为胰腺癌诊断的辅助手段。
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由于本组患者中无早期胰腺癌，因而尚不能说明胰液中K-ras基因突变的检测对于胰腺癌是否有早期诊断价值。但根据其他作者的研究，K-ras的突变发生在胰腺癌形成的早期。Lemoine等[6]通过亚硝胺诱发仓鼠胰腺癌的模型发现，在26%的胰腺导管细胞增生、46%的胰管乳头状增生、76%的胰腺原位癌和80%胰腺的浸润癌标本中，均有K-ras 12密码子突变，由此认为12密码子突变是胰腺癌发生过程中的早期事件。尸检材料表明胰腺导管细胞增生、原位癌远比有临床表现的胰腺癌常见，不少胰腺癌患者生前往往无任何症状,因此K-ras突变可能预示着潜在的早期胰腺癌，这也就是K-ras基因突变的早期诊断价值之所在。近年来Wakabayashi等[7]报道1例经手术证实的胰腺体尾部癌患者，3年前ERCP仅显示主胰管极轻度狭窄而不足以诊断为胰腺癌，但其胰液中已检测到K-ras 12密码子突变，6个月前胰液K-ras仍呈突变型，因此胰液K-ras基因突变早于影像学表现。
3.其他胰腺疾病中K-ras基因突变：本研究还发现：分别在2例胰岛细胞瘤(均已经病理证实)的手术标本和胰液中发现有K-ras的突变。目前有关胰岛细胞肿瘤的K-ras基因研究大多未能检出突变，但由于例数过少，尚不能得出有说服力的结论。1996年的1项研究发现：6例恶性胰岛细胞瘤有4例发现K-ras突变，8例良性胰岛细胞瘤中2例有K-ras突变。K-ras突变者的p53蛋白、c-myc、肿瘤坏死因子-α也有高表达[8]。
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我们未发现慢性胰腺炎有K-ras突变，因而K-ras突变对于胰腺炎和胰腺癌的鉴别可能有帮助，但尚不能认为它是一个可靠标准。以往文献报道少数慢性胰腺炎有K-ras突变，个别报道突变率甚至高达37%[9]。对于慢性胰腺炎患者的K-ras突变目前尚有不同解释，部分作者认为这可能提示潜在肿瘤的发生，因而可作为胰腺癌的高危因素，但尚需通过长期追随来证明。有作者对20例有K-ras突变的慢性胰腺炎患者作了平均4年的随访，并未发现有发展为胰腺癌的病例，因此慢性胰腺炎K-ras突变的临床意义尚需进一步探讨。
参考文献
[1] Bos JL. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res, 1989, 49:4682-4689.
[2] 真核基因组DNA的分析和克隆.见：J. Sambrook, EF. Fritsch, T. Maniatis,主编. 分子克隆实验指南. 第2版, 北京：科学出版社,1992.464-467.
, http://www.100md.com
[3] Kahn SM, Jiang W, Culbertson TA, et al. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via “enriched” PCR amplification. Oncogene, 1991,6:1079-1983.
[4] Miki H, Matsumoto S, Harada H， et al. Detection of c-Ki-ras point mutation from pancreatic juice. A useful diagnostic approach for pancreatic carcinoma. Int J Pancreatol, 1993,14:145-148.
[5] Berthelemy P, Bouisson M, Escourrou J ，et al. Identification of K-ras mutations in pancreatic juice in the early diagnosis of pancreatic cancer. Ann Intern Med, 1995,123:188-191.
, 百拇医药
[6] Lemoine NR, Jain S, Hughes CM, et al. Ki-ras oncogene activation in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology, 1992,102:230-236.
[7] Wakabayashi T, Sawabu N, Watanabe H, et al. Detection of K-ras point mutation at codon 12 in pure pancreatic juice collected 3 years and 6 months before the clinical diagnosis of pancreatic cancer. Am J Gastroenterol, 1996,91:1848-1851.
[8] Pavelic K, Hrascan R, Kapitanovic S, et al. Molecular genetics of malignant insulinoma. Anticancer Res, 1996,16:1707-1717.
[9] Furuya N, Kawa S, Akamatsu T, et al. Long-term follow-up of patients with chronic pancreatitis and K-ras gene mutation detected in pancreatic juice. Gastroenterology, 1997,113:593-598.
(收稿：1999-03-24 修回：1999-07-10), 百拇医药
单位：100730 中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院消化内科
关键词：胰腺肿瘤；胰液；基因，ras
中华内科杂志991008 【摘要】 目的 通过对经逆行胰胆管造影(ERCP)所获胰液的K-ras基因突变检测，以探索胰腺癌诊断的新方法。方法 应用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性的方法检测胰腺良、恶性疾病组织物、胰液上清和细胞的K-ras突变。结果 胰腺癌和胰腺良性疾病标本分别有80%和33%的K-ras突变率。胰液上清检测时，PCR有18%未获得成功，胰腺癌胰液K-ras突变率为71%(15/21)，而胰腺良性疾病无一例有K-ras的突变。用胰液细胞有4% PCR未能获得成功，胰腺癌胰液细胞K-ras的突变率为65%(11/17)，良性疾病中有1例(1/7)检测到K-ras突变。综合上清与细胞的结果，在78%(21/27)的胰腺癌患者的胰液中检测到K-ras突变，明显高于胰腺良性疾病患者的8%(1/13)(P<0.001)。K-ras的突变率与肿瘤的部位及大小无统计学差异。结论 应用胰液检测K-ras突变有助于胰腺癌的诊断。
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K-ras mutation in pancreatic juice from patients with pancreatic carcinoma
GONG Xiaoming, CHEN Yuanfang, CHEN Yuanjia, et al.
Department of Gastroenterology , Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730
【Abstract】 Objective Pancreatic neoplasm, which is considered as one of the most malignant tumors in humans, is now increasing steadily in frequency. The 5-year-survival rate is less than 5%. In order to detect it in early stage, we tried to analyze K-ras mutation in pancreatic juice collected during ERCP after injection of secretin. Mutation of coden 12 in exon 1 of K-ras gene was reported as high as 90% in pancreatic cancer, but much less in benign pancreatic disease. Methods 47 patients at Peking Union Medical College Hospital between 1994 and 1998 were enrolled. Pancreatic juice collected during ERCP after injection of 100u secretin , was briefly centrifuged and the sediment was resuspended with PBS. Pancreatic juice supernatant and pancreatic cells were stored at -80℃ separately. DNA of the cells and supernatant of the juice were extracted. K-ras point mutation was investigated in the DNA of these supernatant and cells by means of two-stage polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism (PCR/RFLP). Results When the supernatant of the pancreatic juice was used, the PCR successful rate was 82% , K-ras mutation rate of the pancreatic carcinomas was 71% (15/21) compared with 0% (0/7) in benign pancreatic disease (3 chronic pancreatitis, 3 insulinoma and 1 pancreatic cyst). When the centrifuged pancreatic cells were used, the successful rate increased to 96%, sixty-five percent (11/17) of pancreatic carcinomas had K-ras mutation; mutation was also detected in 1/7 of the cases with benign pancreatic diseases (an insulinoma). In total, 78% (21/27) of the cases with pancreatic carcinomas has mutant alleles compared with 8% (1/13) of the benign pancreatic diseases(P<0.001) when pancreatic juice was used to detect K-ras gene point mutation. In terms of the location of the pancreatic cancer, K-ras mutation rate was not statistically different between the head (80%) and the body + tail(75%). The mutation rate did not vary with the size of the tumor. Conclusion Detection of coden 12 of K-ras mutation in pancreatic juice can be used in differentiating pancreatic carcinomas from benign pancreatic diseases. It has high sensitivity and specificity.
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【Key words】 Pancreatic neoplasms Pancreatic juice Gene, ras
胰腺癌是一高度恶性的肿瘤，其5年生存率低于5%，近年来其患病率有明显的上升迹象。提高其早期发现率，能够使大部分患者获得手术切除而提高其生存率。现认为K-ras基因是与胰腺癌高度相关的癌基因，其第一外显子12密码子的点突变在胰腺癌组织中高达90%[1]，但在胰腺良性疾病中少有突变，因此可能有助于胰腺癌的诊断。本研究旨在探讨检测胰液K-ras基因突变来诊断胰腺癌的可能性。
材料与方法
一、 标本来源与病例选择
胰腺手术标本组织来自北京协和医院外科手术切除之胰腺组织，均经病理确诊，计有胰腺癌10例、胰腺其他恶性肿瘤1例、胰腺良性疾病3例、正常胰腺4例。胰液标本取自北京协和医院1994～1998年门诊接受逆行胰胆管造影(ERCP)患者，计有胰腺癌28例、胰腺良性疾病13例，病例包括病理确诊者及临床诊断者，后者的入组标准如下。
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1.胰腺癌：(1)至少有如下2项以上的影像学支持：①B超提示胰腺有低密度区、胰管扩张以及胆总管和胆囊肿大；②CT提示胰腺局部增大和占位性病变；③ERCP提示胰管或胆管的截然中断、断端变钝、管壁僵硬不规则或有双管征；④选择性腹腔动脉血管造影有胰腺内肿瘤血管征或胰外血管受侵(有血管的狭窄、中断)；⑤经皮肝穿刺胆道造影(PTC)示有胆总管的偏心狭窄或阻塞；⑥超声内镜示有胰腺区低密度占位性病变；⑦核磁共振胰胆管造影(MRCP)示有胰管或胆总管的狭窄、扩张或有占位性病变。(2)手术中探查扪及实性肿物加至少1条影像学证据。
2.慢性胰腺炎：(1)至少有如下2项以上的影像学支持：①B超提示胰腺有胰腺钙化、胰管结石、胰腺假性囊肿；②CT提示胰腺有胰腺钙化、胰管结石、胰腺假性囊肿；③ERCP显示有胰管扭曲、扩张、囊性扩张；④MRCP示有胰管或胆总管的狭窄、扩张、变形；⑤超声内镜提示有胰管扩张、变形；(2)有以上1项影像学依据加1项胰腺外分泌功能检查的异常(其中包括：①Secretin试验阳性；②大便脂肪定量阳性；③ BT-PABA试验重复2次明显不正常)。(3)有1项的影像学依据加典型的胰腺炎临床表现，如反复急性胰腺炎病史、反复的脂肪泻、糖尿病史、长期饮酒史和反复的进餐后上腹痛史。
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二、胰液的收集
常规ERCP术时，行胰胆管造影后，于静脉内注入100 U促胰泌素，利用胰管内插管(Cannula PR-10Q-1， 直径2.2 mm)收集此后10分钟内的胰液。经1 000 r/min离心10分钟，吸出胰液上清，用PBS重悬离心的细胞，重复离心弃去PBS，将胰液上清与离心细胞分别保存于-80℃。
三、DNA的提取
胰腺组织DNA用常规酚氯仿法[2]。胰液DNA提取如下：取0.4 ml胰液，融开后，加入等体积的DNA抽提液[10 mmol/L Tris.HCl (pH 8.0)、1 mmol/L EDTA (pH 8.0)、150 mmol/L NaCl2、5% SDS](若为胰液离心细胞，则加0.8 ml的DNA抽提液)。混匀后，置37℃恒温水浴1小时，加入蛋白酶K至终浓度100～200 mg/L，53～60℃恒温水浴振荡过夜。平衡酚、酚氯仿、氯仿各萃取1遍。离心后上清用醋酸氨和无水乙醇沉淀，干燥，双蒸水溶解保存。
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四、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测
每组检测均以已确定有K-ras 12密码子突变的人胰腺癌细胞株Pu-Pan-1细胞为阳性对照，正常胰腺组织为阴性对照，并设无模板空白对照。采用富集性PCR-RFLP的分析方法[3]。此方法需经2次PCR及2次酶切。PCR反应体系组成：40 μl反应总体积，dNTP 0.156 mmol/L，PCR buffer 1×(KCl 50 mmol/L， Tris.HCl 10 mmol/L， Tron.X-100 0.1%)，MgCl2 1.88 mmol/L, DMSO 7.5%, KR5 3.125×10-7mol/L, KR32或KR31 3.125×10-7mol/L, Taq酶2 U。PCR引物为：KR5(sense)-5′ACTGAATAT-AAACTTGTGGTAGTTGGAC*CT3′；KR3-1(antisense)-5′TCAAAGAATGGTCCTGG*ACC3′；KR3-2(antisense)-5′TGCACCAGTAATATGCATAT3′(*为错配碱基)。酶切条件为40 μl PCR产物加0.5 μl BstN1(Biolabs公司)，60℃酶切2小时。第1次PCR 取5～8 μl DNA用作模板，KR5及KR31为引物，PCR参数为94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟，循环20次，最后72℃、4分钟。第1次酶切后取2 μl酶切产物用作第2次PCR的模板，PCR条件同前，惟循环次数增为35次，第2次酶切后取20～25 μl产物作2%琼脂糖凝胶电泳分析。
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五、统计学处理
采用四格表卡方计算P值。
结果
1.胰腺手术标本中K-ras检测结果：胰腺癌和胰腺良性疾病标本分别有80%和33%的K-ras突变率(表1)。
2.胰液中K-ras突变检测结果：(1)PCR成功率：在34例胰液上清的检测中，有6例PCR未能成功地扩出条带；26例胰液细胞检测中，有1例未能成功地扩出条带。(2)K-ras突变：胰腺癌胰液K-ras突变率为71%(图1，表2)；胰液离心细胞的K-ras突阳性对照Pu-Pan-1胰腺癌细胞中出现的143 kb条带为K-ras突变型(泳道3)。泳道4、5、6为3例胰腺癌患者的胰液上清标本，泳道7为一壶腹腺瘤患者的手术标本，泳道8为Marker pBR322/Hinf1变率为65%(图2，表3)。在同时检测上清与离心细胞的11例中，8例上清与细胞的突变情况一致，3例不一致(2例胰液上清为突变型K-ras，胰液细胞为野生型K-ras，1例为上清野生型、细胞突变型K-ras)。在同时检测了胰液与肿瘤标本的3例中，K-ras突变结果完全一致。
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表1 K-ras在手术标本中的检测情况 分 类
野生型
突变型
总例数
阳性率
(%)
胰腺癌
2
8
10
80
腺癌
1
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7
8
-
囊腺癌
0
1
1
-
类型未定
1
0
1
-
其他胰腺恶性肿瘤
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1
0
1
0
胰腺良性疾病
2
1
3
1/3
慢性胰腺炎
1
0
1
-
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胰岛细胞瘤
1
1
2
-
正常胰腺
4
0
4
0
表2 K-ras在胰腺疾病胰液上清中的检测情况 分 类
野生型
突变型
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总例数
阳性率
(%)
胰腺癌
6
15
21
71
病理确诊病例
3
10
13
-
腺癌
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3
7
10
-
囊腺癌
0
1
1
-
类型未定
0
2
2
-
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临床诊断病例
3
5
8
-
胰腺良性疾病
7
0
7
0
慢性胰腺炎
3
0
4
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-
胰岛细胞瘤
3
0
3
-
胰头囊肿
1
0
1
图1 胰液上清K-ras突变的检测
综合胰液上清及胰液细胞检测的结果，K-ras在胰腺良、恶性疾病胰液中突变率为78%，特异性为92%。胰腺良性疾病K-ras的突变率为8%，两组间差异有显著性(P<0.001，χ2=17.4+)。
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图2 胰液细胞K-ras突变的检测
表3 K-ras在胰腺疾病胰液离心细胞中的检测情况 分类
野生型
突变型
总例数
阳性率(%)
胰腺癌(总计)
6
11
17
65
病理确诊病例
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3
7
10
-
腺癌
2
5
7
-
类型未定
1
2
3
-
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临床诊断病例
3
4
7
-
胰腺良性疾病
6
1
7
1/7
慢性胰腺炎
3
0
3
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-
胰岛细胞瘤
2
1
3
-
胰腺囊肿
1
0
1
-
3.K-ras突变率与肿瘤部位、大小的关系：综合胰液K-ras检测及标本K-ras检测的结果，计算了K-ras基因在胰头和胰体尾的突变分别为81%(17/21)和69%(9/13)，两者差异无显著性 (P=0.43, χ2=0.61)。肿瘤<5 cm者突变率为80%(8/10)，>5 cm者为75%(9/12)，两者差异无显著性。本组病例中<2 cm的早期胰腺癌仅1例，未作统计分析。
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4.K-ras与CA19-9的相关性：同组患者CA19-9用于胰腺癌诊断的敏感性为83%，特异性为70%。依照CA19-9正常、异常，K-ras突变、野生将患者分为4组(表4)。K-ras突变与CA19-9异常的符合率为62.5%。如以CA19-9、K-ras其中1项异常作为诊断指标，其敏感性将增加为96%，特异性为60%。
表4 CA19-9与K-ras突变的相关性 分组
CA19-9异常
CA19-9正常
K-ras突变
K-ras野生
K-ras突变
K-ras野生
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胰腺癌组
15
5
3
1
胰腺良性疾病组
0
3
1
6
讨论
1.K-ras与肿瘤的关系：ras基因最初是在NIH/3T3细胞的转化实验中被发现的，转导了ras基因的NIH/3T3细胞能发生转化，从而确定了其癌基因的地位。进一步的研究发现ras基因在多数肿瘤中有突变[1]。这种突变能导致保守区氨基酸序列改变，产生持续性刺激信号，导致细胞的持续生长。
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在胰腺癌常有K-ras基因突变，且几乎都集中于第一外显子的12密码子。K-ras 12密码子的野生型为GGT，突变型常见为GAT、GTT、CGT 3种，此3种突变类型占所有突变类型的60%～100%。文献中报道的胰腺癌K-ras突变率在75%～95%。由于其突变集中于一个位点，这就为我们检测其K-ras基因的突变提供了方便。
2.K-ras在胰腺癌早期诊断中的意义：由于胰腺癌诊断上的困难，近些年在国际上已尝试利用各种标本K-ras突变的检测来摸索胰腺癌诊断的新手段，包括胰腺细针穿刺组织、胰液、十二指肠引流液等，所获得的K-ras突变率在45%～100%不等。利用胰液来检测K-ras突变是研究热点之一。经ERCP获取胰液检测K-ras基因的点突变，可能对胰腺癌的诊断有所帮助。
我们的结果表明，在胰腺癌患者的胰液中K-ras基因有较高的突变率，具有较高的敏感性(78%)与特异性(92%)，与在胰腺癌手术标本中检测到的K-ras突变情况类似，说明其可以反映患者肿瘤组织的基因突变，因而具有诊断价值。该结果与国外文献中的报道基本一致[4，5]，说明胰液K-ras基因突变可以作为胰腺癌诊断的辅助手段。
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由于本组患者中无早期胰腺癌，因而尚不能说明胰液中K-ras基因突变的检测对于胰腺癌是否有早期诊断价值。但根据其他作者的研究，K-ras的突变发生在胰腺癌形成的早期。Lemoine等[6]通过亚硝胺诱发仓鼠胰腺癌的模型发现，在26%的胰腺导管细胞增生、46%的胰管乳头状增生、76%的胰腺原位癌和80%胰腺的浸润癌标本中，均有K-ras 12密码子突变，由此认为12密码子突变是胰腺癌发生过程中的早期事件。尸检材料表明胰腺导管细胞增生、原位癌远比有临床表现的胰腺癌常见，不少胰腺癌患者生前往往无任何症状,因此K-ras突变可能预示着潜在的早期胰腺癌，这也就是K-ras基因突变的早期诊断价值之所在。近年来Wakabayashi等[7]报道1例经手术证实的胰腺体尾部癌患者，3年前ERCP仅显示主胰管极轻度狭窄而不足以诊断为胰腺癌，但其胰液中已检测到K-ras 12密码子突变，6个月前胰液K-ras仍呈突变型，因此胰液K-ras基因突变早于影像学表现。
3.其他胰腺疾病中K-ras基因突变：本研究还发现：分别在2例胰岛细胞瘤(均已经病理证实)的手术标本和胰液中发现有K-ras的突变。目前有关胰岛细胞肿瘤的K-ras基因研究大多未能检出突变，但由于例数过少，尚不能得出有说服力的结论。1996年的1项研究发现：6例恶性胰岛细胞瘤有4例发现K-ras突变，8例良性胰岛细胞瘤中2例有K-ras突变。K-ras突变者的p53蛋白、c-myc、肿瘤坏死因子-α也有高表达[8]。
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我们未发现慢性胰腺炎有K-ras突变，因而K-ras突变对于胰腺炎和胰腺癌的鉴别可能有帮助，但尚不能认为它是一个可靠标准。以往文献报道少数慢性胰腺炎有K-ras突变，个别报道突变率甚至高达37%[9]。对于慢性胰腺炎患者的K-ras突变目前尚有不同解释，部分作者认为这可能提示潜在肿瘤的发生，因而可作为胰腺癌的高危因素，但尚需通过长期追随来证明。有作者对20例有K-ras突变的慢性胰腺炎患者作了平均4年的随访，并未发现有发展为胰腺癌的病例，因此慢性胰腺炎K-ras突变的临床意义尚需进一步探讨。
参考文献
[1] Bos JL. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res, 1989, 49:4682-4689.
[2] 真核基因组DNA的分析和克隆.见：J. Sambrook, EF. Fritsch, T. Maniatis,主编. 分子克隆实验指南. 第2版, 北京：科学出版社,1992.464-467.
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[3] Kahn SM, Jiang W, Culbertson TA, et al. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via “enriched” PCR amplification. Oncogene, 1991,6:1079-1983.
[4] Miki H, Matsumoto S, Harada H， et al. Detection of c-Ki-ras point mutation from pancreatic juice. A useful diagnostic approach for pancreatic carcinoma. Int J Pancreatol, 1993,14:145-148.
[5] Berthelemy P, Bouisson M, Escourrou J ，et al. Identification of K-ras mutations in pancreatic juice in the early diagnosis of pancreatic cancer. Ann Intern Med, 1995,123:188-191.
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[6] Lemoine NR, Jain S, Hughes CM, et al. Ki-ras oncogene activation in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology, 1992,102:230-236.
[7] Wakabayashi T, Sawabu N, Watanabe H, et al. Detection of K-ras point mutation at codon 12 in pure pancreatic juice collected 3 years and 6 months before the clinical diagnosis of pancreatic cancer. Am J Gastroenterol, 1996,91:1848-1851.
[8] Pavelic K, Hrascan R, Kapitanovic S, et al. Molecular genetics of malignant insulinoma. Anticancer Res, 1996,16:1707-1717.
[9] Furuya N, Kawa S, Akamatsu T, et al. Long-term follow-up of patients with chronic pancreatitis and K-ras gene mutation detected in pancreatic juice. Gastroenterology, 1997,113:593-598.
(收稿：1999-03-24 修回：1999-07-10), 百拇医药