大鼠重症肌无力中枢受损时白细胞介素-1的变化
作者：刘绪宏 李柱一 刘煜 唐丽君 游国雄
单位：710038 西安，第四军医大学唐都医院神经内科(第一作者现在江苏省扬州市江苏武警总队医院，225003)
关键词：重症肌无力；白细胞介素-1；大鼠
中华内科杂志991004 【摘要】 目的 探讨重症肌无力(MG)患者中枢神经系统损害与白细胞介素(IL)-1之间的关系。方法 将MG患者血中提取的IgG注入大鼠脑室系统，建立大鼠中枢神经系统受损模型，然后观察模型大鼠脑、胸腺、血清IL-1水平的变化。结果 脑室内注入IgG后第1周起，脑、胸腺及血清中IL-1水平升高，其中脑组织上升最为明显，第2周末达高峰；而在胸腺及血中上升则相对缓慢，第3周末时仍在缓慢上升。结论 大鼠中枢神经系统受损MG模型脑、胸腺及血中IL-1水平显著升高，表明其在MG患者中枢神经系统损害过程中可能起重要作用。
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Changes of the interleukin-1 in dysfunction of central nervous system in myasthenia gravis
LIU Xuhong*, LI Zhuyi, LIU Yu，et al.
*Department of Neurology, The Armied Police′s Hospital of Siangsn Troops, Jiangsu, Yangzhou 225003
【Abstract】 Objective Recent studies have demonstrated that acetylcholine receptor antibodies (AChRab) present in the serum of the patients with myasthenia gravis (MG) not only block acetylcholine transmission at the neuromuscular junction, but also cause dysfunction of central nervous system (CNS). The mechanism remains unclear. In the present study the concentration of interleukin-1 in the brain, thymus and blood was investigated to reveal the mechanism of CNS dysfunction in MG. Methods The concentration of interleukin-1 in brain, thymus and blood was detected after establishing the experimental MG model of central nervous system dysfunction induced by injection of AChRab purified from MG sera into the rat cerebral ventricular system. Results Interleukin-1 level in brain, thymus and blood started to increase one week after injection of AChRab. The level of interleukin-1 in brain tissue showed a very significant increase, as compared to that in thymus and blood till the end of 2 weeks after injection, where as in thymus and blood the increasing rate was relatively slow. Conclusion It is concluded that interleulin-1 increased in rat brain, thymus and blood may play an important role in generating dysfunction of CNS in MG.
, 百拇医药
【Key words】 Myasthenia gravis Interleukin-1 Rat
重症肌无力(MG)患者体内存在细胞因子网络失衡。细胞因子白细胞介素(IL)-1与MG有着极为密切的关系。研究发现在诱导MG模型过程中有T细胞分泌的细胞因子参与[1-3]。MG患者乙酰胆碱受体抗体(AChRab)的病理作用除累及神经肌接头处乙酰胆碱受体(AChR)外，还可波及到中枢神经系统[4]。目前尚未阐明MG患者AChRab引起中枢神经系统损害的机制，也未能明确AChRab引起中枢神经系统损害的过程中是否有细胞因子参与。为此我们用大鼠脑室内注入MG患者AChRab的方法，建立中枢神经系统受损的MG模型，观察其中枢神经系统和外周IL-1的变化及其相互关系。
材料和方法
一、中枢神经系统损害的大鼠MG模型
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1.提取IgG：取3例临床症状典型，血AChRab阳性的全身型MG患者血清各10 ml，用硫酸氨盐析法和Protein G亲和层析法提取IgG。另取2例健康人血清各10 ml，提取IgG，作正常对照，方法同上。
2.动物分组：成年雄性SD大鼠56只，体重200～250 g，购自第四军医大学动物中心。随机分为空白对照组8只和健康对照组及实验组各24只。
3.大鼠脑室内注入IgG[5]：将提取的25 μl MG患者IgG缓慢注入脑室系统，隔日1次，共3次。健康对照组，大鼠脑室内注入正常人IgG，方法同上。空白对照组，不作任何处理。
二、标本留取和检测
脑室内注入IgG后，分别在第1、2、3周末(各8只)留取标本。戊巴比妥经腹腔麻醉后，迅速暴露心脏，留取2 ml血标本。然后，经主动脉插管，用200 ml生理盐水快速冲洗，取脑组织及胸腺，称湿重，匀浆(组织∶生理盐水=0.5 g∶1 ml)，离心，取上清，冻存待测。用IL-1放免试剂盒(北方生物技术研究所产品)测定实验组、健康对照组及空白对照组脑、胸腺和血中的IL-1水平。
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三、统计处理
计量资料以
±s表示；组间比较用t检验。
结果
侧脑室内注入IgG后，第2周起实验组大鼠出现摄食量明显减少，体重下降(平均15 g)，动作迟缓、笨拙，行走不稳，呼吸频率加快、动度减弱，对巴比妥类药物耐受性差等MG模型样症状。而健康对照组则无上述症状，反而在第3周时体重平均增加75 g，与空白对照组比较，体重增加值相同。
实验组脑室内注入IgG第2周末，脑、胸腺及外周血中IL-1水平均显著增高，与健康对照组比较，差异具有显著或极显著性，而健康对照组上述各部位IL-1水平无明显变化，与空白对照组比较差异无显著性(表1)。
表1 实验组及对照组脑、胸腺、血清白细胞介素IL-1水平(ng/L,±s) 组别
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例数
脑
胸腺
血清
空白对照组
8
97.50±24.30
107.50±26 .00
127.50±36.70
健康对照组
24
91.25±30.40
122.50±17.52
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135.00±35.88
实验组
24
196.25±40.88**
189.60±46.70**
174.50±31.35*
注:与健康对照组比较，*P<0.05,**P<0.01 脑室内注入MG患者IgG时间与IL-1变化：第1周末脑、胸腺及血中IL-1水平开始升高，第2周末时脑组织达高峰，第3周开始下降；而在胸腺及血中IL-1变化较缓慢，至第3周末时仍在缓慢升高。
讨论
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一、大鼠中枢神经系统受损时IL-1的来源
本项研究发现，脑室内注入MG患者IgG后，脑组织中IL-1水平上升时间与大鼠出现MG模型样症状时间同步。另外，从实验组脑及外周IL-1上升时间、峰值及幅度看，脑组织中的IL-1产生于中枢神经系统，而不是来自于外周血。脑组织中IL-1升高可能是继发于MG患者IgG(内含AChRab)与神经-AChR之间的免疫结合反应。神经-AChR和肌-AChR同属于AChR-门控-离子通道基因家族，两者的α亚单位氨基酸序列高度同源；且形态学研究结果表明MG患者AChRab可与中枢神经-AChR免疫交叉结合[5]。另外，已有研究证实中枢神经系统内血管内皮细胞、小胶质细胞、星形细胞和神经细胞均能合成IL-1；也有研究发现在鼠海马、嗅球、小脑、大脑皮质、下丘脑、延髓等许多部位存在IL-1受体及其mRNA表达[6]。把MG患者AChRab与大鼠中枢神经-AChR之间的免疫结合反应分布部位与IL-1受体分布的部位作一比较发现，两者在中枢神经系统许多部位分布一致，如大脑皮层、下丘脑、脑干颅神经运动核团、脊髓前角等[5]。此外，外周血中的IL-1很难通过血脑屏障。有人将IL-1注入外周血，结果发现只有0.1%进入脑内。因此，推测注入脑室的MG患者IgG(AChRab)与神经AChR免疫交叉结合，致神经AChR结构、功能变化，间接引起IL-1水平升高。
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二、IL-1在中枢神经系统中的作用
中枢神经系统内IL-1升高可致实验动物出现典型的慢波睡眠和皮质脑电同步化，探究行为减少及抑制摄食、体重下降[7]；还可使传入神经传导速度延迟，并影响Ca2+通道及动作电位的产生。有人将IL-1注入脑室发现，海马区乙酰胆碱转移酶活性急剧下降，说明IL-1可通过降低海马胆碱能神经元合成ACh水平来影响其功能状态[8]。也有研究发现，中枢神经系统内高浓度的IL-1对胆碱能神经元具有兴奋毒性作用，致神经元死亡[9]。据此推测本实验中大鼠出现体重减轻、摄食量减少等MG模型样症状，与AChRab和神经AChR结合引起神经AChR功能障碍及IL-1的过多释放有关，即两者可能均起重要作用。
三、MG患者IgG致中枢神经系统损害时脑组织IL-1与外周IL-1变化之间的关系
目前MG与细胞因子关系研究主要集中在外周血单核细胞和胸腺，而尚未研究MG患者中枢神经系统损害时细胞因子的变化[2]。此项研究发现，侧脑室内注入MG患者IgG(AChRab)后，大鼠中枢神经系统内IL-1升高的同时，胸腺及外周血中IL-1水平也有相应增加，其机制不甚清楚。推测有下列两种可能：(1)注入脑室内的MG患者IgG通过影响下丘脑-垂体-肾上腺轴功能，间接影响周围免疫器官功能，引起周围IL-1水平升高。Weidenfeld等[10]先把MG患者IgG注入鼠脑室系统，然后研究其对HPA功能的影响，发现鼠促肾上腺皮质激素分泌量明显下降，证明中枢神经系统内的MG患者IgG可影响神经-内分泌功能。(2)IL-1的神经递质、调质样作用。外周免疫器官受胆碱能神经元支配。中枢神经系统中的AChRab与IL-1，两者协同影响中枢神经系统胆碱能系统可间接影响胆碱能神经元对外周免疫器官的调节作用(如胸腺等)，继发外周IL-1水平升高。
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综上我们认为注入脑室内的MG患者IgG致中枢神经系统损害的同时，还可使脑、胸腺及周围血IL-1水平升高，表明IL-1参与MG患者中枢神经系统损害过程。
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39670264)
参考文献
[1] Huang D, Pirskanen R，Hjelmstrom P, et al. Polymorphisms in IL-1beta and IL-1 receptor antagonist genes are associated with myasthenia gravis. J Neuroimmunol, 1998,81:76-81.
[2] Zhang GX, Navikas V, Link H. Cytokines and the pathogenesis of myasthenia gravis. Muscle Nerve,1997,20:543-551.
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[3] 王炜,肖保国,吕传真. 重症肌无力患者骨髓、胸腺及外周血中IFN-γ、IL-4 分泌细胞检测.上海免疫杂志, 1997,17:376-377.
[4] 许贤豪. 重症肌无力研究新进展. 中华神经科杂志,1997, 30:67-69.
[5] 李柱一, 丘晓飞 ,鞠躬, 等. 重症肌无力中枢神经系统受损模型. 中华神经科杂志, 1997,30:218-222.
[6] Takao T, Tracey DE,Mitchell WM, et al. Interleukin-1 receptors in mouse brain:characterization and neuronal localization. Endocrinology,1990,127:3070-3078.
[7] Pousset F. Cytokines and the brain. Eur Cytokine Netw,1993,4:57-61.
, 百拇医药
[8] 要航, 王福庄. 细胞因子对中枢神经系统海马区的作用.生理科学进展.1995,26:132-137.
[9] Araujo DM, Cotman CW. Trophic effects of interleukin-4, -7 and -8 on hippocampal neuronal cultures:potential involvement of glial-derived factors. Brain Res,1993,600:49-55.
[10] Weidenfeld J, Bodoff M, Saphier D, et al. Further studies on the stimulatory action of nicotine on adrenocortical function in the rat. Neuroendocrinology, 1989,50:132-138.
(收稿:1999-02-10 修回:1999-05-13), 百拇医药
单位：710038 西安，第四军医大学唐都医院神经内科(第一作者现在江苏省扬州市江苏武警总队医院，225003)
关键词：重症肌无力；白细胞介素-1；大鼠
中华内科杂志991004 【摘要】 目的 探讨重症肌无力(MG)患者中枢神经系统损害与白细胞介素(IL)-1之间的关系。方法 将MG患者血中提取的IgG注入大鼠脑室系统，建立大鼠中枢神经系统受损模型，然后观察模型大鼠脑、胸腺、血清IL-1水平的变化。结果 脑室内注入IgG后第1周起，脑、胸腺及血清中IL-1水平升高，其中脑组织上升最为明显，第2周末达高峰；而在胸腺及血中上升则相对缓慢，第3周末时仍在缓慢上升。结论 大鼠中枢神经系统受损MG模型脑、胸腺及血中IL-1水平显著升高，表明其在MG患者中枢神经系统损害过程中可能起重要作用。
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Changes of the interleukin-1 in dysfunction of central nervous system in myasthenia gravis
LIU Xuhong*, LI Zhuyi, LIU Yu，et al.
*Department of Neurology, The Armied Police′s Hospital of Siangsn Troops, Jiangsu, Yangzhou 225003
【Abstract】 Objective Recent studies have demonstrated that acetylcholine receptor antibodies (AChRab) present in the serum of the patients with myasthenia gravis (MG) not only block acetylcholine transmission at the neuromuscular junction, but also cause dysfunction of central nervous system (CNS). The mechanism remains unclear. In the present study the concentration of interleukin-1 in the brain, thymus and blood was investigated to reveal the mechanism of CNS dysfunction in MG. Methods The concentration of interleukin-1 in brain, thymus and blood was detected after establishing the experimental MG model of central nervous system dysfunction induced by injection of AChRab purified from MG sera into the rat cerebral ventricular system. Results Interleukin-1 level in brain, thymus and blood started to increase one week after injection of AChRab. The level of interleukin-1 in brain tissue showed a very significant increase, as compared to that in thymus and blood till the end of 2 weeks after injection, where as in thymus and blood the increasing rate was relatively slow. Conclusion It is concluded that interleulin-1 increased in rat brain, thymus and blood may play an important role in generating dysfunction of CNS in MG.
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【Key words】 Myasthenia gravis Interleukin-1 Rat
重症肌无力(MG)患者体内存在细胞因子网络失衡。细胞因子白细胞介素(IL)-1与MG有着极为密切的关系。研究发现在诱导MG模型过程中有T细胞分泌的细胞因子参与[1-3]。MG患者乙酰胆碱受体抗体(AChRab)的病理作用除累及神经肌接头处乙酰胆碱受体(AChR)外，还可波及到中枢神经系统[4]。目前尚未阐明MG患者AChRab引起中枢神经系统损害的机制，也未能明确AChRab引起中枢神经系统损害的过程中是否有细胞因子参与。为此我们用大鼠脑室内注入MG患者AChRab的方法，建立中枢神经系统受损的MG模型，观察其中枢神经系统和外周IL-1的变化及其相互关系。
材料和方法
一、中枢神经系统损害的大鼠MG模型
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1.提取IgG：取3例临床症状典型，血AChRab阳性的全身型MG患者血清各10 ml，用硫酸氨盐析法和Protein G亲和层析法提取IgG。另取2例健康人血清各10 ml，提取IgG，作正常对照，方法同上。
2.动物分组：成年雄性SD大鼠56只，体重200～250 g，购自第四军医大学动物中心。随机分为空白对照组8只和健康对照组及实验组各24只。
3.大鼠脑室内注入IgG[5]：将提取的25 μl MG患者IgG缓慢注入脑室系统，隔日1次，共3次。健康对照组，大鼠脑室内注入正常人IgG，方法同上。空白对照组，不作任何处理。
二、标本留取和检测
脑室内注入IgG后，分别在第1、2、3周末(各8只)留取标本。戊巴比妥经腹腔麻醉后，迅速暴露心脏，留取2 ml血标本。然后，经主动脉插管，用200 ml生理盐水快速冲洗，取脑组织及胸腺，称湿重，匀浆(组织∶生理盐水=0.5 g∶1 ml)，离心，取上清，冻存待测。用IL-1放免试剂盒(北方生物技术研究所产品)测定实验组、健康对照组及空白对照组脑、胸腺和血中的IL-1水平。
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三、统计处理
计量资料以
±s表示；组间比较用t检验。结果
侧脑室内注入IgG后，第2周起实验组大鼠出现摄食量明显减少，体重下降(平均15 g)，动作迟缓、笨拙，行走不稳，呼吸频率加快、动度减弱，对巴比妥类药物耐受性差等MG模型样症状。而健康对照组则无上述症状，反而在第3周时体重平均增加75 g，与空白对照组比较，体重增加值相同。
实验组脑室内注入IgG第2周末，脑、胸腺及外周血中IL-1水平均显著增高，与健康对照组比较，差异具有显著或极显著性，而健康对照组上述各部位IL-1水平无明显变化，与空白对照组比较差异无显著性(表1)。
表1 实验组及对照组脑、胸腺、血清白细胞介素IL-1水平(ng/L,
±s) 组别, 百拇医药
例数
脑
胸腺
血清
空白对照组
8
97.50±24.30
107.50±26 .00
127.50±36.70
健康对照组
24
91.25±30.40
122.50±17.52
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135.00±35.88
实验组
24
196.25±40.88**
189.60±46.70**
174.50±31.35*
注:与健康对照组比较，*P<0.05,**P<0.01 脑室内注入MG患者IgG时间与IL-1变化：第1周末脑、胸腺及血中IL-1水平开始升高，第2周末时脑组织达高峰，第3周开始下降；而在胸腺及血中IL-1变化较缓慢，至第3周末时仍在缓慢升高。
讨论
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一、大鼠中枢神经系统受损时IL-1的来源
本项研究发现，脑室内注入MG患者IgG后，脑组织中IL-1水平上升时间与大鼠出现MG模型样症状时间同步。另外，从实验组脑及外周IL-1上升时间、峰值及幅度看，脑组织中的IL-1产生于中枢神经系统，而不是来自于外周血。脑组织中IL-1升高可能是继发于MG患者IgG(内含AChRab)与神经-AChR之间的免疫结合反应。神经-AChR和肌-AChR同属于AChR-门控-离子通道基因家族，两者的α亚单位氨基酸序列高度同源；且形态学研究结果表明MG患者AChRab可与中枢神经-AChR免疫交叉结合[5]。另外，已有研究证实中枢神经系统内血管内皮细胞、小胶质细胞、星形细胞和神经细胞均能合成IL-1；也有研究发现在鼠海马、嗅球、小脑、大脑皮质、下丘脑、延髓等许多部位存在IL-1受体及其mRNA表达[6]。把MG患者AChRab与大鼠中枢神经-AChR之间的免疫结合反应分布部位与IL-1受体分布的部位作一比较发现，两者在中枢神经系统许多部位分布一致，如大脑皮层、下丘脑、脑干颅神经运动核团、脊髓前角等[5]。此外，外周血中的IL-1很难通过血脑屏障。有人将IL-1注入外周血，结果发现只有0.1%进入脑内。因此，推测注入脑室的MG患者IgG(AChRab)与神经AChR免疫交叉结合，致神经AChR结构、功能变化，间接引起IL-1水平升高。
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二、IL-1在中枢神经系统中的作用
中枢神经系统内IL-1升高可致实验动物出现典型的慢波睡眠和皮质脑电同步化，探究行为减少及抑制摄食、体重下降[7]；还可使传入神经传导速度延迟，并影响Ca2+通道及动作电位的产生。有人将IL-1注入脑室发现，海马区乙酰胆碱转移酶活性急剧下降，说明IL-1可通过降低海马胆碱能神经元合成ACh水平来影响其功能状态[8]。也有研究发现，中枢神经系统内高浓度的IL-1对胆碱能神经元具有兴奋毒性作用，致神经元死亡[9]。据此推测本实验中大鼠出现体重减轻、摄食量减少等MG模型样症状，与AChRab和神经AChR结合引起神经AChR功能障碍及IL-1的过多释放有关，即两者可能均起重要作用。
三、MG患者IgG致中枢神经系统损害时脑组织IL-1与外周IL-1变化之间的关系
目前MG与细胞因子关系研究主要集中在外周血单核细胞和胸腺，而尚未研究MG患者中枢神经系统损害时细胞因子的变化[2]。此项研究发现，侧脑室内注入MG患者IgG(AChRab)后，大鼠中枢神经系统内IL-1升高的同时，胸腺及外周血中IL-1水平也有相应增加，其机制不甚清楚。推测有下列两种可能：(1)注入脑室内的MG患者IgG通过影响下丘脑-垂体-肾上腺轴功能，间接影响周围免疫器官功能，引起周围IL-1水平升高。Weidenfeld等[10]先把MG患者IgG注入鼠脑室系统，然后研究其对HPA功能的影响，发现鼠促肾上腺皮质激素分泌量明显下降，证明中枢神经系统内的MG患者IgG可影响神经-内分泌功能。(2)IL-1的神经递质、调质样作用。外周免疫器官受胆碱能神经元支配。中枢神经系统中的AChRab与IL-1，两者协同影响中枢神经系统胆碱能系统可间接影响胆碱能神经元对外周免疫器官的调节作用(如胸腺等)，继发外周IL-1水平升高。
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综上我们认为注入脑室内的MG患者IgG致中枢神经系统损害的同时，还可使脑、胸腺及周围血IL-1水平升高，表明IL-1参与MG患者中枢神经系统损害过程。
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39670264)
参考文献
[1] Huang D, Pirskanen R，Hjelmstrom P, et al. Polymorphisms in IL-1beta and IL-1 receptor antagonist genes are associated with myasthenia gravis. J Neuroimmunol, 1998,81:76-81.
[2] Zhang GX, Navikas V, Link H. Cytokines and the pathogenesis of myasthenia gravis. Muscle Nerve,1997,20:543-551.
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[3] 王炜,肖保国,吕传真. 重症肌无力患者骨髓、胸腺及外周血中IFN-γ、IL-4 分泌细胞检测.上海免疫杂志, 1997,17:376-377.
[4] 许贤豪. 重症肌无力研究新进展. 中华神经科杂志,1997, 30:67-69.
[5] 李柱一, 丘晓飞 ,鞠躬, 等. 重症肌无力中枢神经系统受损模型. 中华神经科杂志, 1997,30:218-222.
[6] Takao T, Tracey DE,Mitchell WM, et al. Interleukin-1 receptors in mouse brain:characterization and neuronal localization. Endocrinology,1990,127:3070-3078.
[7] Pousset F. Cytokines and the brain. Eur Cytokine Netw,1993,4:57-61.
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[8] 要航, 王福庄. 细胞因子对中枢神经系统海马区的作用.生理科学进展.1995,26:132-137.
[9] Araujo DM, Cotman CW. Trophic effects of interleukin-4, -7 and -8 on hippocampal neuronal cultures:potential involvement of glial-derived factors. Brain Res,1993,600:49-55.
[10] Weidenfeld J, Bodoff M, Saphier D, et al. Further studies on the stimulatory action of nicotine on adrenocortical function in the rat. Neuroendocrinology, 1989,50:132-138.
(收稿:1999-02-10 修回:1999-05-13), 百拇医药