免疫治疗对重症肌无力病人淋巴细胞亚型的影响
作者：韩钊 徐文桢 刘鸣 魏于全 雷松
单位：325000 浙江省温州市，温州医学院附属第一医院神经内科(韩钊)；华西医科大学附属第一医院神经科(徐文祯、刘鸣)，肿瘤生物治疗中心(魏于全、雷松)
关键词：重症肌无力；免疫，细胞；胸腺切除术
中华内科杂志991003 【摘要】 目的 研究重症肌无力(MG)患者细胞免疫的异常改变和糖皮质激素及胸腺切除对各淋巴细胞亚群的影响。方法 采用免疫荧光双标记技术和流式细胞仪对39例MG患者和18例健康对照者周围血中淋巴细胞表型分析，并对15例MG患者经糖皮质激素治疗前后和7例MG患者在胸腺切除前后各淋巴细胞亚群的百分率的变化进行观察。结果 (1) MG患者总T细胞、总B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD-5CD+19)、CD+4 T淋巴细胞的百分率与对照相比差异无显著性，但CD+8 T细胞的百分率明显高于对照组；在CD+4 T细胞的亚群中，MG患者的CD+4CD45RA+细胞明显低于对照组，而CD+4CD45RA-细胞明显高于对照组；CD+5 B细胞(CD+5CD+19)的百分率在MG组明显高于对照组。(2)用糖皮质激素后周围血中总T细胞(CD+5)、总B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD5-CD+19)、CD+5 B细胞、CD+4 T细胞、CD+8 T细胞和CD+4CD45RA-细胞百分率明显下降。(3)胸腺切除后各淋巴细胞亚群无显著性改变。结论 MG细胞免疫的改变不仅有CD+4、CD+8 T细胞的变化，而且CD+4 T细胞功能亚群、B细胞亚群CD+5 B细胞也有异常改变，并可能在MG发病中起重要作用，糖皮质激素治疗对细胞免疫有全面抑制作用，胸腺切除对周围血中各淋巴亚群可能无影响。
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Effect of immunologic treatment on lymphocyte subsets in patients with myasthenia gravis
HAN Zhao*, XU Wenzhen, LIU Ming, et al.
*Department of Neurology, The First Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou, Zhejiang 325000
【Abstract】 Objective To study the abnormalities of cellular immunity of myasthenia gravis (MG) and the effects of glucocorticoid (GC) therapy and thymectomy on lymphocyte subsets in patients with myasthenia gravis. Methods Phenotypic analysis of peripheral blood lymphocyte in 39 patients with MG and 18 healthy controls were completed using flow cytometry and immunofluorescence double-staining methods; changes of lymphocyte subsets were studied in 15 of the MG patients after GC therapy and 7 of the MG patients after thymectomy. Results (1) The percentage of pan-T (CD+5)、pan-B (CD+19)、traditional B cell、CD+4T cell in patients with MG did not significantly differ from that in healthy controls. An increase in CD+8 cell was observed in MG patients as compared with normal controls. Among the CD+4T lymphocyte subsets, there was significant decrease of the percentage of CD+4CD45RA+ (suppressor-inducer) and increase of the percentage of CD+4CD45RA-(helper-inducer) subsets in MG patients than controls; the percentage of CD+5 B cell was significantly increased in MG patients as compared with that in healthy controls. (2) After GC therapy, the percentages of pan-T(CD+5) 、pan-B(CD+19)、traditional B cell、CD+4T cell、CD+8T cell、CD+4CD45RA-、CD+5B cell decreased. (3) After thymectomy, the proportions of T、B lymphocyte subsets did not change significantly. Conclusion Not only changes of T cell subsets (CD+4 and CD+8 T lymphocyte subsets) were shown, but also there were abnormal changes of functional CD+4 T lymphocyte subsets and CD+5 B lymphocyte which may play an important role in the pathogenesis of MG. There is comprehensive inhibiting action of GC on cellular immunity in MG patients, while there is no such effect with thymectomy on the lymphocyte subsets in MG patients.
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【Key words】 Myasthenia gravis Immunity，cellular Thymectomy
细胞免疫紊乱是重症肌无力( MG)发病的一个重要原因，近年来在淋巴细胞表型研究中发现，CD+4T 细胞由于表达不同的白细胞共同抗原(CD45)的异型体而分为功能不同的两个亚群，部分B细胞表面可低密度表达CD5分子(CD5通常表达在T细胞上)，B细胞也存在异质性，这种CD+5B细胞具有分泌多种自身抗体的功能[1]。为进一步了解MG患者细胞免疫的异常改变，我们采用免疫荧光双标记技术和流式细胞仪对一组MG患者周围血中淋巴细胞表型分析，并观察了糖皮质激素治疗和胸腺切除对各淋巴细胞亚型的影响。
材料与方法
, http://www.100md.com 一、研究对象
1.MG组：39例MG患者根据典型的临床表现、新斯的明试验、肌电图检查和血清乙酰胆碱受体抗体(AchRab)检测确诊，排除合并其他免疫性疾病，抽血前2个月内未应用免疫抑制剂。男15例，女24例；年龄5～70岁，平均(32.8±13.5)岁；病程1个月至10年；眼肌型11例，全身型28例；血清AchRab阳性29例，AchRab阴性10例。其中15例在应用糖皮质激素(主要为泼尼松，30～100 mg/d)治疗1个月后复查，7例施行了胸腺切除术，并在术前、术后1～4周分别进行细胞表型分析。
2.对照组：健康志愿者18例，年龄16～64岁，平均(35.3±12.3)岁。
二、方法
1.试剂： 淋巴细胞分离液(上海华精)、RPMI 1640培养液含5%胎牛血清(美国Sigma)、异硫氰酸荧光素(FITC)/藻红蛋白(PE)标记的配对小鼠抗人单克隆抗体：FITC-CD8/PE-CD4、FITC-CD45RA/PE-CD4、FITC-CD19/PE-CD5、FITC-IgG1/PE-IgG1(Immunotech公司)。
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2.标本采集：所有研究对象于8∶00～9∶00采集静脉血2 ml，用EDTA抗凝，3小时内进行细胞表型分析。
3.淋巴细胞准备：无菌条件下取抗凝血采用Ficoll密度梯度法分离外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI 1640培养液将其调制成1×106/ml的细胞悬液。
4.免疫荧光染色：取调制好的淋巴细胞悬液20 μl，分别加入配对荧光抗体：FITC-CD8/PE-CD4、FITC-CD45RA/PE-CD4、FITC-CD19/PE-CD5、FITC-IgG1/PE-IgG1(空白对照)，室温下反应15分钟，加入3 ml PBS液(0.01 mol/L，pH 7.4)摇匀，1 500 r/min离心3分钟，去上清液洗去游离的单抗，加入0.9 ml PBS液,上流式细胞仪。
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5.细胞表型分析：采用COULTER ESP型流式细胞仪。每个样品均分析104个细胞，分别检测出CD+4CD-8、CD+8CD-4、CD+4CD45RA+、CD+4CD45RA-、CD+5、CD+19、CD+5CD+19、CD-5CD+19细胞的百分率。
6.统计分析：所得数据全部输入微机，建立数据库，采用SPSS软件，进行t检验。
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结果
1.MG组与对照组比较(表1)：总T细胞(CD+5)、总B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD-5CD+19)、CD+4T淋巴细胞的百分率在两组间差异无显著性，但CD+8T细胞的百分率明显高于对照组；在CD+4T淋巴细胞的亚群中，MG患者的CD+4CD45RA+细胞明显低于对照组，而CD+4CD45RA-细胞明显高于对照组(P<0.05)；CD+5B 细胞(CD+5CD+19)的百分率在MG组明显高于对照组，差异有显著性(P<0.05)。
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2.15例MG患者在应用糖皮质激素1个月后周围血中总T细胞(CD+5)、总B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD-5CD+19)、CD+5B细胞、CD+4T细胞、CD+8T细胞和CD+4CD45RA-细胞百分率明显下降(P<0.05)；CD+4CD45RA+细胞在治疗前后差别无统计学意义(表2)。
3.39例MG 患者中有7例施行了胸腺切除术，在手术前后全T细胞(CD+5)、全B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD-5CD+19)、CD+5B细胞、CD+4T细胞、CD+8T细胞的两个功能亚群的百分率差别均无统计学意义(表3)。
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表1 重症肌无力(MG)患者与健康对照者T、B淋巴细胞亚群百分率的比较(%，
±s) 组别
例数
CD+4
CD-8
CD+8
CD-4
CD+4/
CD+8
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CD+4
CD45RA+
CD+4
CD45RA-
CD+4
CD45RA+/CD+4
CD+5
CD+19
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CD-5CD+19
CD+5CD+19
(CD+5B)
CD+5CD+19/
CD+19
MG组
39
40.251 2±
, 百拇医药
34.666 7±
1.176 2±
12.171 8±
25.392 3±
0.323 2±
73.717 9±
14.051 3±
9.723 6±
4.051 3±
3.432 3±
9.747 2
9.006 0
, 百拇医药
0.560 1
6.132 4
7.678 6
0.082 5
10.917 2
5.896 0
4.573 5
2.702 6
1.024 3
对照
18
42.255 6±
, 百拇医药
22.455 6±
1.908 1±
28.398 1±
14.051 7±
0.654 6±
68.538 9±
16.450 0±
13.346 3±
1.588 9±
0.098 6±
组
10.272 0
, 百拇医药
5.811 1
0.832 0
6.670 0
5.420 2
0.362 1
10.123 9
4.467 6
5.980 0
0.624 4
0.011 3
P值
>0.05
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<0.05
<0.05
<0.05
<0.05
<0.05
>0.05
>0.05
>0.05
<0.05
<0.05
表2 重症肌无力患者糖皮质激素治疗前后各淋巴细胞亚群的变化(%，±s)
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例数
CD+4CD-8
CD+8CD-4
CD+4CD45RA+
CD+4CD45RA-
CD+5
CD+19
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CD+5CD+19
(CD+5B)
治疗前
15
43.334 8±
35.899 0±
9.337 6±
31.333 8±
72.888 9±
19.503 0±
, 百拇医药 5.876 3±
9.673 2
8.877 8
4.222 3
8.776 0
11.334 4
8.569 1
3.453 2
治疗后
15
30.273 2±
28.223 4±
, 百拇医药
13.333 5±
16.455 2±
54.336 1±
9.078 2±
1.432 1±
8.661 1
6.773 2
6.277 4
7.899 0
9.473 2
4.634 1
0.533 9
, 百拇医药
P值
<0.05
<0.05
>0.05
<0.05
<0.05
<0.05
<0.05
表3 重症肌无力患者胸腺切除术前后各淋巴细胞亚群的变化(%，±s)
例数
CD+4
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CD-8
CD+8
CD-4
CD+4
CD45RA+
CD+4
CD45RA-
CD+5
, 百拇医药 CD+19
CD+5CD+19
(CD+5B)
手术前
7
42.791 2±
37.373 8±
12.346 7±
30.444 7±
68.870 0±
, 百拇医药
19.305 2±
4.305 3±
9.873 2
8.143 2
6.334 5
8.335 9
10.343 1
7.667 0
1.231 0
手术后
7
44.676 8±
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32.866 7±
14.334 5±
28.333 4±
65.334 3±
18.433 7±
4.070 8±
11.878 9
7.676 8
7.673 8
8.123 7
10.345 6
8.293 1
, 百拇医药
1.122 3
P值
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
讨论
MG是一种自身免疫性疾病，其发病机制是由于患者体内产生以AchRab为主的自身抗体作用所致。大部分学者认为AchRab的产生与调节性T细胞CD+4亚群增多和(或)CD+8亚群减少是导致B细胞过度活化所致[2]。但是，本研究发现CD+4T细胞数无明显改变，而CD+8T细胞数明显升高，这一结果与上述解释有一定的矛盾。近年来发现CD+4T细胞具有异质性，表达CD45RA分子(CD+4CD45RA+)的亚群具有诱导CD+8T抑制细胞产生抑制作用的功能，称抑制细胞诱导亚群(suppressor-inducer)；无CD45RA分子表达的亚群(CD+4CD45RA-)则包含辅助细胞诱导亚群(helper-inducer)，该亚群具有辅助B细胞合成IgG的功能[3，4]。本研究发现MG患者外周血中CD+4CD45RA+细胞数降低，CD+4CD45RA-细胞数增高，这表明MG患者B细胞的过度激活，不是单纯地取决于CD+4和CD+8T细胞数量的改变，而与CD+4T细胞功能亚群的改变有密切关系。当CD+4CD45RA+细胞数降低，CD+8T抑制细胞对B细胞的抑制作用减弱；CD+4CD45RA-细胞数增多，其中的辅助细胞诱导亚群相应增多，对B细胞的辅助功能增强，从而导致B细胞过度活化，产生大量自身抗体。在体外试验中，当CD+4CD45RA+细胞被激活后，CD45RA分子表达减少，而CD45RA和CD29分子表达增多，表明抑制细胞诱导亚群在某种条件下可以向辅助细胞诱导亚群转化[5]。本研究发现的MG患者CD+4T细胞亚群的异常改变，推测可能与MG患者在AchR抗原激活CD+4T细胞后，CD+4CD45RA+细胞向CD+4CD45RA-细胞转化有关；CD+8T细胞数量增加，可能是由于抑制细胞诱导亚群(CD+4CD45RA+)细胞数量减少，引起CD+8T细胞代偿性增多的结果，但由于CD+4CD45RA+细胞数减少，结果不能发挥应有的诱导CD+8T抑制细胞产生抑制作用，导致CD+8T细胞的功能下降，从而使B细胞功能活跃，产生以AchRab为主的多种自身抗体。
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尽管MG患者体内存在大量的自身抗体，但直接分泌抗体的B细胞(总B、传统B细胞)在MG外周血中却未见明显升高，但是，表达CD5分子的CD5+B细胞在MG患者周围血中表现出有意义的增高，本研究的发现与Ragheb和Lisak的报道一致[6]。说明CD+5B细胞可能参与了MG的发病。体外培养表明，CD+5B细胞产生以IgM为主的自身抗体，众所周知，MG患者体内AchRab是以IgG为主的，因此CD+5B细胞在MG患者体内增高参与MG发病的机制还不清楚，有可能与AchRab阴性MG和AchRab滴度与肌无力程度不成正比例有关。Yomamoto等[7]在MG患者的非IgG部分发现一种IgM血浆因子可以影响AchR通道中Na+内流，但不影响钠通道中Na+内流，这种IgM因子同时出现在AchRab阳性和阴性MG患者的血浆中。但这种IgM因子是否就是由CD+5B细胞分泌的自身抗体，尚需进一步证实。此外，CD+5B细胞还可以分泌抗独特型抗体通过抗独特型网络起免疫调节作用。
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糖皮质激素是治疗MG的主要药物之一，对免疫应答有复杂而广泛的作用。它通过与细胞浆内受体结合诱导免疫调节，抑制巨噬细胞分泌白细胞介素(IL)-1，使淋巴细胞死亡，对激活淋巴细胞作用显著。本研究观察了15例MG患者在用糖皮质激素治疗1个月后，全T、B细胞和全细胞、传统B细胞、CD+5B细胞、CD+4T细胞、CD+8T细胞、CD+4CD45RA-细胞百分率明显下降。说明糖皮质激素治疗对细胞免疫具全面抑制作用。
胸腺是T细胞发育、分化、成熟的场所，且被认为是MG自身免疫应答的发源地。临床观察发现：约90%的MG患者伴有胸腺异常，摘除胸腺可使部分患者临床症状改善。本研究对7例MG患者在胸腺切除前后分别进行表型分析，未发现某一细胞亚群发生显著性异常改变，与国外的报道一致[8，9]。说明胸腺切除对MG患者周围血淋巴细胞各亚群可能无影响。其原因可能是：(1)胸腺切除后对人体免疫系统的影响，并不一定会通过周围血中淋巴细胞亚群数量的变化来表现，而有可能在其他外围淋巴器官(如脾、淋巴结)，或通过其他免疫参数的改变来表现；(2)研究中采用的单克隆抗体不能精确地发现可能有改变的细胞亚群来；(3)观察的时间太短，因为临床观察：胸腺切除后短期疗效不一定好，出现危象的机率高，在此观察的7例中，有2例术后3周内发生了肌无力危象；(4)样本量小。因而，胸腺切除后，免疫功能的改变尚需进一步研究，如寻找更精确的细胞表面标志，对外围淋巴器官及淋巴细胞功能的研究。
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参考文献
[1] 邱晓彦,综述. B-1细胞研究进展. 国外医学免疫学分册, 1996, 19：235-239.
[2] Drachman DB, Myasthenia gravis. N Engl J Med, 1994, 330: 1797-1810.
[3] 金伯泉，主编. 细胞和分子免疫学. 西安: 世界图书出版公司, 1994.269-286.
[4] Oksaranta O, Tarvonen S, Ilonen J, et al. T-cell subpopulations in the cerebrospinal fluid and peripheral blood of patients with multiple sclerosis: a follow-up study. Neurology, 1996, 47: 1542-1545.
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[5] Akbar AN, Terry L, Timms A, et al. Loss of CD45R and gain of UCHLI reactivity is a feature of primed T cells. J Immunol, 1988, 140: 2171-2178.
[6] Ragheb S, Lisak RP. Effect of clinical status and treament on the frequency of CD5+B cells in patients with myasthenia gravis. Neurology, 1992, 42: 1076-1080.
[7] Yomamoto T, Vincent A, Ciulla, TA,et al. Seronegative myasthenia gravis:a plasma factor inhibiting agonist-induced acetylcholine receptor function copurifies with IgM. Ann Neurol, 1991, 30: 550-557.
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[8] Crosti F, Armanini M, Confalonieri P, et al. Changes in peripheral blood lymphocyte subset frequencies in myasthenia gravis patients are related to immunosuppression. J Neurol, 1994, 241: 218-222.
[9] Melms A, Malcherek G, Gern U, et al. Thymectomy and azathioprine have no effect on the phenotype of CD4T lymphocyte subsets in myasthenia gravis. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1993, 56: 46-51.
(收稿：1999-01-20 修回：1999-04-30), http://www.100md.com
单位：325000 浙江省温州市，温州医学院附属第一医院神经内科(韩钊)；华西医科大学附属第一医院神经科(徐文祯、刘鸣)，肿瘤生物治疗中心(魏于全、雷松)
关键词：重症肌无力；免疫，细胞；胸腺切除术
中华内科杂志991003 【摘要】 目的 研究重症肌无力(MG)患者细胞免疫的异常改变和糖皮质激素及胸腺切除对各淋巴细胞亚群的影响。方法 采用免疫荧光双标记技术和流式细胞仪对39例MG患者和18例健康对照者周围血中淋巴细胞表型分析，并对15例MG患者经糖皮质激素治疗前后和7例MG患者在胸腺切除前后各淋巴细胞亚群的百分率的变化进行观察。结果 (1) MG患者总T细胞、总B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD-5CD+19)、CD+4 T淋巴细胞的百分率与对照相比差异无显著性，但CD+8 T细胞的百分率明显高于对照组；在CD+4 T细胞的亚群中，MG患者的CD+4CD45RA+细胞明显低于对照组，而CD+4CD45RA-细胞明显高于对照组；CD+5 B细胞(CD+5CD+19)的百分率在MG组明显高于对照组。(2)用糖皮质激素后周围血中总T细胞(CD+5)、总B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD5-CD+19)、CD+5 B细胞、CD+4 T细胞、CD+8 T细胞和CD+4CD45RA-细胞百分率明显下降。(3)胸腺切除后各淋巴细胞亚群无显著性改变。结论 MG细胞免疫的改变不仅有CD+4、CD+8 T细胞的变化，而且CD+4 T细胞功能亚群、B细胞亚群CD+5 B细胞也有异常改变，并可能在MG发病中起重要作用，糖皮质激素治疗对细胞免疫有全面抑制作用，胸腺切除对周围血中各淋巴亚群可能无影响。
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Effect of immunologic treatment on lymphocyte subsets in patients with myasthenia gravis
HAN Zhao*, XU Wenzhen, LIU Ming, et al.
*Department of Neurology, The First Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou, Zhejiang 325000
【Abstract】 Objective To study the abnormalities of cellular immunity of myasthenia gravis (MG) and the effects of glucocorticoid (GC) therapy and thymectomy on lymphocyte subsets in patients with myasthenia gravis. Methods Phenotypic analysis of peripheral blood lymphocyte in 39 patients with MG and 18 healthy controls were completed using flow cytometry and immunofluorescence double-staining methods; changes of lymphocyte subsets were studied in 15 of the MG patients after GC therapy and 7 of the MG patients after thymectomy. Results (1) The percentage of pan-T (CD+5)、pan-B (CD+19)、traditional B cell、CD+4T cell in patients with MG did not significantly differ from that in healthy controls. An increase in CD+8 cell was observed in MG patients as compared with normal controls. Among the CD+4T lymphocyte subsets, there was significant decrease of the percentage of CD+4CD45RA+ (suppressor-inducer) and increase of the percentage of CD+4CD45RA-(helper-inducer) subsets in MG patients than controls; the percentage of CD+5 B cell was significantly increased in MG patients as compared with that in healthy controls. (2) After GC therapy, the percentages of pan-T(CD+5) 、pan-B(CD+19)、traditional B cell、CD+4T cell、CD+8T cell、CD+4CD45RA-、CD+5B cell decreased. (3) After thymectomy, the proportions of T、B lymphocyte subsets did not change significantly. Conclusion Not only changes of T cell subsets (CD+4 and CD+8 T lymphocyte subsets) were shown, but also there were abnormal changes of functional CD+4 T lymphocyte subsets and CD+5 B lymphocyte which may play an important role in the pathogenesis of MG. There is comprehensive inhibiting action of GC on cellular immunity in MG patients, while there is no such effect with thymectomy on the lymphocyte subsets in MG patients.
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【Key words】 Myasthenia gravis Immunity，cellular Thymectomy
细胞免疫紊乱是重症肌无力( MG)发病的一个重要原因，近年来在淋巴细胞表型研究中发现，CD+4T 细胞由于表达不同的白细胞共同抗原(CD45)的异型体而分为功能不同的两个亚群，部分B细胞表面可低密度表达CD5分子(CD5通常表达在T细胞上)，B细胞也存在异质性，这种CD+5B细胞具有分泌多种自身抗体的功能[1]。为进一步了解MG患者细胞免疫的异常改变，我们采用免疫荧光双标记技术和流式细胞仪对一组MG患者周围血中淋巴细胞表型分析，并观察了糖皮质激素治疗和胸腺切除对各淋巴细胞亚型的影响。
材料与方法
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1.MG组：39例MG患者根据典型的临床表现、新斯的明试验、肌电图检查和血清乙酰胆碱受体抗体(AchRab)检测确诊，排除合并其他免疫性疾病，抽血前2个月内未应用免疫抑制剂。男15例，女24例；年龄5～70岁，平均(32.8±13.5)岁；病程1个月至10年；眼肌型11例，全身型28例；血清AchRab阳性29例，AchRab阴性10例。其中15例在应用糖皮质激素(主要为泼尼松，30～100 mg/d)治疗1个月后复查，7例施行了胸腺切除术，并在术前、术后1～4周分别进行细胞表型分析。
2.对照组：健康志愿者18例，年龄16～64岁，平均(35.3±12.3)岁。
二、方法
1.试剂： 淋巴细胞分离液(上海华精)、RPMI 1640培养液含5%胎牛血清(美国Sigma)、异硫氰酸荧光素(FITC)/藻红蛋白(PE)标记的配对小鼠抗人单克隆抗体：FITC-CD8/PE-CD4、FITC-CD45RA/PE-CD4、FITC-CD19/PE-CD5、FITC-IgG1/PE-IgG1(Immunotech公司)。
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2.标本采集：所有研究对象于8∶00～9∶00采集静脉血2 ml，用EDTA抗凝，3小时内进行细胞表型分析。
3.淋巴细胞准备：无菌条件下取抗凝血采用Ficoll密度梯度法分离外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI 1640培养液将其调制成1×106/ml的细胞悬液。
4.免疫荧光染色：取调制好的淋巴细胞悬液20 μl，分别加入配对荧光抗体：FITC-CD8/PE-CD4、FITC-CD45RA/PE-CD4、FITC-CD19/PE-CD5、FITC-IgG1/PE-IgG1(空白对照)，室温下反应15分钟，加入3 ml PBS液(0.01 mol/L，pH 7.4)摇匀，1 500 r/min离心3分钟，去上清液洗去游离的单抗，加入0.9 ml PBS液,上流式细胞仪。
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5.细胞表型分析：采用COULTER ESP型流式细胞仪。每个样品均分析104个细胞，分别检测出CD+4CD-8、CD+8CD-4、CD+4CD45RA+、CD+4CD45RA-、CD+5、CD+19、CD+5CD+19、CD-5CD+19细胞的百分率。
6.统计分析：所得数据全部输入微机，建立数据库，采用SPSS软件，进行t检验。
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结果
1.MG组与对照组比较(表1)：总T细胞(CD+5)、总B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD-5CD+19)、CD+4T淋巴细胞的百分率在两组间差异无显著性，但CD+8T细胞的百分率明显高于对照组；在CD+4T淋巴细胞的亚群中，MG患者的CD+4CD45RA+细胞明显低于对照组，而CD+4CD45RA-细胞明显高于对照组(P<0.05)；CD+5B 细胞(CD+5CD+19)的百分率在MG组明显高于对照组，差异有显著性(P<0.05)。
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2.15例MG患者在应用糖皮质激素1个月后周围血中总T细胞(CD+5)、总B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD-5CD+19)、CD+5B细胞、CD+4T细胞、CD+8T细胞和CD+4CD45RA-细胞百分率明显下降(P<0.05)；CD+4CD45RA+细胞在治疗前后差别无统计学意义(表2)。
3.39例MG 患者中有7例施行了胸腺切除术，在手术前后全T细胞(CD+5)、全B细胞(CD+19)、传统B细胞(CD-5CD+19)、CD+5B细胞、CD+4T细胞、CD+8T细胞的两个功能亚群的百分率差别均无统计学意义(表3)。
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表1 重症肌无力(MG)患者与健康对照者T、B淋巴细胞亚群百分率的比较(%，
±s) 组别例数
CD+4
CD-8
CD+8
CD-4
CD+4/
CD+8
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CD+4
CD45RA+
CD+4
CD45RA-
CD+4
CD45RA+/CD+4
CD+5
CD+19
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CD-5CD+19
CD+5CD+19
(CD+5B)
CD+5CD+19/
CD+19
MG组
39
40.251 2±
, 百拇医药
34.666 7±
1.176 2±
12.171 8±
25.392 3±
0.323 2±
73.717 9±
14.051 3±
9.723 6±
4.051 3±
3.432 3±
9.747 2
9.006 0
, 百拇医药
0.560 1
6.132 4
7.678 6
0.082 5
10.917 2
5.896 0
4.573 5
2.702 6
1.024 3
对照
18
42.255 6±
, 百拇医药
22.455 6±
1.908 1±
28.398 1±
14.051 7±
0.654 6±
68.538 9±
16.450 0±
13.346 3±
1.588 9±
0.098 6±
组
10.272 0
, 百拇医药
5.811 1
0.832 0
6.670 0
5.420 2
0.362 1
10.123 9
4.467 6
5.980 0
0.624 4
0.011 3
P值
>0.05
, http://www.100md.com
<0.05
<0.05
<0.05
<0.05
<0.05
>0.05
>0.05
>0.05
<0.05
<0.05
表2 重症肌无力患者糖皮质激素治疗前后各淋巴细胞亚群的变化(%，
±s), http://www.100md.com
例数
CD+4CD-8
CD+8CD-4
CD+4CD45RA+
CD+4CD45RA-
CD+5
CD+19
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CD+5CD+19
(CD+5B)
治疗前
15
43.334 8±
35.899 0±
9.337 6±
31.333 8±
72.888 9±
19.503 0±
, 百拇医药 5.876 3±
9.673 2
8.877 8
4.222 3
8.776 0
11.334 4
8.569 1
3.453 2
治疗后
15
30.273 2±
28.223 4±
, 百拇医药
13.333 5±
16.455 2±
54.336 1±
9.078 2±
1.432 1±
8.661 1
6.773 2
6.277 4
7.899 0
9.473 2
4.634 1
0.533 9
, 百拇医药
P值
<0.05
<0.05
>0.05
<0.05
<0.05
<0.05
<0.05
表3 重症肌无力患者胸腺切除术前后各淋巴细胞亚群的变化(%，
±s)例数
CD+4
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CD-8
CD+8
CD-4
CD+4
CD45RA+
CD+4
CD45RA-
CD+5
, 百拇医药 CD+19
CD+5CD+19
(CD+5B)
手术前
7
42.791 2±
37.373 8±
12.346 7±
30.444 7±
68.870 0±
, 百拇医药
19.305 2±
4.305 3±
9.873 2
8.143 2
6.334 5
8.335 9
10.343 1
7.667 0
1.231 0
手术后
7
44.676 8±
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32.866 7±
14.334 5±
28.333 4±
65.334 3±
18.433 7±
4.070 8±
11.878 9
7.676 8
7.673 8
8.123 7
10.345 6
8.293 1
, 百拇医药
1.122 3
P值
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
讨论
MG是一种自身免疫性疾病，其发病机制是由于患者体内产生以AchRab为主的自身抗体作用所致。大部分学者认为AchRab的产生与调节性T细胞CD+4亚群增多和(或)CD+8亚群减少是导致B细胞过度活化所致[2]。但是，本研究发现CD+4T细胞数无明显改变，而CD+8T细胞数明显升高，这一结果与上述解释有一定的矛盾。近年来发现CD+4T细胞具有异质性，表达CD45RA分子(CD+4CD45RA+)的亚群具有诱导CD+8T抑制细胞产生抑制作用的功能，称抑制细胞诱导亚群(suppressor-inducer)；无CD45RA分子表达的亚群(CD+4CD45RA-)则包含辅助细胞诱导亚群(helper-inducer)，该亚群具有辅助B细胞合成IgG的功能[3，4]。本研究发现MG患者外周血中CD+4CD45RA+细胞数降低，CD+4CD45RA-细胞数增高，这表明MG患者B细胞的过度激活，不是单纯地取决于CD+4和CD+8T细胞数量的改变，而与CD+4T细胞功能亚群的改变有密切关系。当CD+4CD45RA+细胞数降低，CD+8T抑制细胞对B细胞的抑制作用减弱；CD+4CD45RA-细胞数增多，其中的辅助细胞诱导亚群相应增多，对B细胞的辅助功能增强，从而导致B细胞过度活化，产生大量自身抗体。在体外试验中，当CD+4CD45RA+细胞被激活后，CD45RA分子表达减少，而CD45RA和CD29分子表达增多，表明抑制细胞诱导亚群在某种条件下可以向辅助细胞诱导亚群转化[5]。本研究发现的MG患者CD+4T细胞亚群的异常改变，推测可能与MG患者在AchR抗原激活CD+4T细胞后，CD+4CD45RA+细胞向CD+4CD45RA-细胞转化有关；CD+8T细胞数量增加，可能是由于抑制细胞诱导亚群(CD+4CD45RA+)细胞数量减少，引起CD+8T细胞代偿性增多的结果，但由于CD+4CD45RA+细胞数减少，结果不能发挥应有的诱导CD+8T抑制细胞产生抑制作用，导致CD+8T细胞的功能下降，从而使B细胞功能活跃，产生以AchRab为主的多种自身抗体。
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尽管MG患者体内存在大量的自身抗体，但直接分泌抗体的B细胞(总B、传统B细胞)在MG外周血中却未见明显升高，但是，表达CD5分子的CD5+B细胞在MG患者周围血中表现出有意义的增高，本研究的发现与Ragheb和Lisak的报道一致[6]。说明CD+5B细胞可能参与了MG的发病。体外培养表明，CD+5B细胞产生以IgM为主的自身抗体，众所周知，MG患者体内AchRab是以IgG为主的，因此CD+5B细胞在MG患者体内增高参与MG发病的机制还不清楚，有可能与AchRab阴性MG和AchRab滴度与肌无力程度不成正比例有关。Yomamoto等[7]在MG患者的非IgG部分发现一种IgM血浆因子可以影响AchR通道中Na+内流，但不影响钠通道中Na+内流，这种IgM因子同时出现在AchRab阳性和阴性MG患者的血浆中。但这种IgM因子是否就是由CD+5B细胞分泌的自身抗体，尚需进一步证实。此外，CD+5B细胞还可以分泌抗独特型抗体通过抗独特型网络起免疫调节作用。
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糖皮质激素是治疗MG的主要药物之一，对免疫应答有复杂而广泛的作用。它通过与细胞浆内受体结合诱导免疫调节，抑制巨噬细胞分泌白细胞介素(IL)-1，使淋巴细胞死亡，对激活淋巴细胞作用显著。本研究观察了15例MG患者在用糖皮质激素治疗1个月后，全T、B细胞和全细胞、传统B细胞、CD+5B细胞、CD+4T细胞、CD+8T细胞、CD+4CD45RA-细胞百分率明显下降。说明糖皮质激素治疗对细胞免疫具全面抑制作用。
胸腺是T细胞发育、分化、成熟的场所，且被认为是MG自身免疫应答的发源地。临床观察发现：约90%的MG患者伴有胸腺异常，摘除胸腺可使部分患者临床症状改善。本研究对7例MG患者在胸腺切除前后分别进行表型分析，未发现某一细胞亚群发生显著性异常改变，与国外的报道一致[8，9]。说明胸腺切除对MG患者周围血淋巴细胞各亚群可能无影响。其原因可能是：(1)胸腺切除后对人体免疫系统的影响，并不一定会通过周围血中淋巴细胞亚群数量的变化来表现，而有可能在其他外围淋巴器官(如脾、淋巴结)，或通过其他免疫参数的改变来表现；(2)研究中采用的单克隆抗体不能精确地发现可能有改变的细胞亚群来；(3)观察的时间太短，因为临床观察：胸腺切除后短期疗效不一定好，出现危象的机率高，在此观察的7例中，有2例术后3周内发生了肌无力危象；(4)样本量小。因而，胸腺切除后，免疫功能的改变尚需进一步研究，如寻找更精确的细胞表面标志，对外围淋巴器官及淋巴细胞功能的研究。
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参考文献
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[7] Yomamoto T, Vincent A, Ciulla, TA,et al. Seronegative myasthenia gravis:a plasma factor inhibiting agonist-induced acetylcholine receptor function copurifies with IgM. Ann Neurol, 1991, 30: 550-557.
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(收稿：1999-01-20 修回：1999-04-30), http://www.100md.com