静脉注射和雾化吸入α1-抗胰蛋白酶对急性肺损伤兔保护作用的比较
作者：揭志军 蔡映云 杨文兰 金美玲 朱威 祝慈芳
单位：揭志军(200032 上海医科大学附属中山医院肺科 现在上海新华医院呼吸内科，200092)；蔡映云(200032 上海医科大学附属中山医院肺科)；杨文兰(200032 上海医科大学附属中山医院肺科)；金美玲(200032 上海医科大学附属中山医院肺科)；朱威(上海生物制品研究所)；祝慈芳(上海生物制品研究所)
关键词：
中华内科杂志000517 研究表明蛋白酶-抗蛋白酶失衡在急性肺损伤(ALI)中起重要作用[1]，为此补充抗蛋白酶成为一种治疗ALI的新途径。目前国外一些研究发现，应用合成的蛋白酶抑制物能减轻内毒素所致的肺损伤[2]。而α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)是体内最主要的抗蛋白酶，故本实验应用α1-AT对ALI兔进行干预，并比较静脉注射和雾化吸入的差异，探索防治ALI的新途径。
, http://www.100md.com
一、材料与方法
1.试验方法：32只健康成年新西兰大白兔，雌雄皆有，体重2.0～2.5 kg。麻醉后行气管切开，接呼吸机(Siemens SV900c)进行定容机械通气。稳定30 min后测定基础值，包括动脉血气、血常规、动脉血压、潮气量、气道峰压、平台压、静态总呼吸顺应性以及肺内动静脉分流(
s/t)等。然后随机分成4组，每组8只。(1)A组：急性肺损伤模型组，静脉内输注内毒素(LPS) 500 μg/kg。(2) B组：α1-AT静脉注射干预组，在输注LPS前15 min静脉注射α1-AT(由上海生物制品研究所提供)，浓度30 g/L，剂量为120 mg/kg。(3)C组： α1-AT雾化干预组，输注LPS前15 min和输注LPS 4 h后分别给予α1-AT射流雾化治疗各1次，每次剂量为30 mg/kg。(4)D组：生理盐水对照组，静脉注射生理盐水1 ml/kg。连续机械通气8 h后留取2 ml血浆测定α1-AT含量和活性，然后处死动物，计算肺湿/干重(W/D)比值。测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中α1-AT活性、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)样活性及总蛋白(TP)、白细胞介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)α等含量。
, 百拇医药
2.测定方法：采用速率散射比浊法测α1-AT含量 ，活性按Dietz法测定；根据Bieth法测NE样活性；应用ELISA测IL-8和TNFα含量；采用双缩脲法测TP。
3.病理观察：取左下肺组织数小块，石蜡包埋，切片，苏木紫-伊红染色后光镜观察。
4.统计学方法：应用SPSS统计软件对结果进行t检验，各组数据以
±s表示。
二、结果
1. 实验过程中各时项点生理指标的变化：见表1。
2. 四组动物血浆和BALF中生化指标及W/D的比较：见表2。
3.各组动物的肺组织结构，见图1～5。
, 百拇医药
讨论 健康兔经静脉注射500 μg/kg LPS后，动脉血氧分压(PaO2)下降，肺顺应性下降，s/t增加，出现了符合ALI的病理生理变化。A组血浆和BALF中α1-AT活性降低，BALF中NE样活性明显增高，说明蛋白酶-抗蛋白酶失衡可能是引起肺组织损伤的重要原因。因此抗蛋白酶治疗是防治ALI的一个新途径。本组资料显示，应用α1-AT干预后PaO2、WBC、血压和顺应性的下降幅度较A组减小，氧合好转，s/t也较小，BALF中蛋白含量、IL-8、TNFα浓度和W/D降低，说明α1-AT对LPS所致的ALI具有一定的防治作用。
, 百拇医药
由于α1-AT的分子量较大(52 000),且ALI的病变主要在
表1 四组动物生理指标的变化(±s) 组别
兔数
(只)
基础值
1/2 h
2 h
4 h
6 h
8 h
PaO2(mm Hg)
, 百拇医药
A组
8
163.9± 7.4
123.6±20.6△*
100.5±25.7△*
83.1±29.7△*
69.1±20.5△*
54.9±12.2△*
B组
8
163.1±17.2
, 百拇医药
149.1±12.8△*#
118.3±14.8△*
116.1±16.0△*#
93.5± 7.5△*#
75.8±10.0△*#
C组
8
169.9±11.6
138.9± 9.0△*
123.9± 8.3△*#
, 百拇医药
123.3±20.6△*#
114.4±25.3△*#▲
93.0±11.3△*#▲
D组
8
160.9±12.7
162.6± 9.3
165.0± 8.8
161.5± 8.8
159.5±11.8
161.1± 7.5
, 百拇医药
气道峰压(cm H2O)
A组
8
7.8±1.8
9.3±1.8*
10.9±1.7△*
13.3±3.2△*
15±4.1△*
15.8± 3.7△*
B组
8
, http://www.100md.com
8.3±0.7
8.7±0.7*
10.6±0.8△*
11.6±1.0△*#
12.3±1.2△*#
13.5± 1.0△*#
C组
8
8.0±1.0
8.7±1.0△*
, http://www.100md.com 10.4±1.2△*
11.0±1.2△*#
11.9±1.1△*#
12.9± 1.1△*#
D组
8
7.8±0.8
7.6±0.8
8.2±0.5
8.2±0.4
8.1±0.4
, 百拇医药
8.3± 0.3
静态总呼吸顺应性(ml/cm H2O)
A组
8
3.42±1.01
2.66±0.41△
2.18±0.31△*
1.86±0.28△*
1.58±0.29△*
1.45±0.21△*
, 百拇医药
B组
8
3.23±0.45
3.15±1.51
2.24±0.23△*
1.99±0.31△*
1.87±0.26△*#
1.72±0.25△*#
C组
8
2.95±0.59
, 百拇医药
2.58±0.30△
2.17±0.25△*
2.09±0.19△*#
1.84±0.14△*#
1.75±0.10△*#
D组
8
3.00±0.58
2.97±0.55
2.93±0.39
, http://www.100md.com 2.92±0.30
2.87±0.36
2.84±0.33
WBC(×109/L)
A组
8
4.9±0.3
2.8±0.6△*
1.8±0.3△*
2.4±0.7△*
2.7±0.6△*
, 百拇医药
3.2±1.0△*
B组
8
4.6±0.6
2.6±1.0△*
2.9±1.2△*
3.7±1.5
4.8±1.4#
6.0±1.5#
C组
8
, 百拇医药
5.0±0.4
2.9±0.5△*
2.6±0.7△*#
3.5±0.3△*#
5.2±1.1#
6.3±0.9*#
D组
8
4.9±0.3
4.8±0.2
4.3±0.3
, 百拇医药
4.2±0.3
4.6±0.3
5.2±0.3
血压(mm Hg)
A组
8
93.0± 7.3
70.8± 6.3△*
65.4± 3.7△*
60.1± 5.9△*
55.5± 7.0△*
, 百拇医药
52.9± 9.7△*
B组
8
92.0±10.7
71.5± 5.6△*
68.0± 5.8△*
73.0± 9.0△*#
71.0± 6.6△*#
73.5±10.8△*#
C组
, http://www.100md.com
8
89.3± 9.7
74.5±14.4△*
64.1±11.1△*
69.6±11.8△*
65.9±13.0△*
60.1±10.8△*
D组
8
92.3± 7.0
92.9± 6.8
, http://www.100md.com
92.3± 6.9
96.0± 5.2
94.8± 6.7
93.5± 7.2s/t(%)
A组
8
14.7±1.6
-
-
21.8±2.8△*
, 百拇医药
-
26.2± 1.3△*
B组
8
14.2±1.0
-
-
18.6±2.7△*#
-
21.5± 3.0△*#
C组
8
, 百拇医药
12.8±1.4
-
-
15.5±1.0△*#▲
-
19.9± 1.2*△#▲
D组
8
12.8±1.5
-
-
14.3±1.4
, 百拇医药
-
14.1± 1.4
注：表中-为未做；1 mm Hg=0.133 kPa; 1 cm H2O=0.098 kPa 与基础值相比，△P<0.05；与D组相比，*P<0.05；与A组相比，#P<0.05；B组与C组相比，▲P<0.05表2 四组动物血浆和BALF中生化指标以及W/D的比较(±s) 组别
兔数
(只)
血浆
BALF
, 百拇医药
W/D
α1-AT含量
(mg/L)
α1-AT活性
(×103U/L)
α1-AT活性
(×103U/L)
NE样活性
(nmol.ml-1.h-1)
, http://www.100md.com
IL-8
(ng/L)
TNFα(ng/L)
TP
(mg/kg)
A组
8
406±222*
0.21±0.08*
0.018±0.004*
10.10±4.52*
, 百拇医药
1 160±280*
74.0±33.6*
254±108*
6.5±0.6*
B组
8
996±382*▲
0.50±0.13*▲
0.051±0.018*▲
3.11±1.65*▲
, 百拇医药
782±263*▲
41.7±26.0*▲
132± 42*▲
5.6±0.3*▲
C组
8
495±131*△
0.42±0.13▲
0.076±0.014*▲△
2.38±1.31*▲
, 百拇医药
609±151*▲
35.9±11.9*▲
120± 23*▲
5.4±0.2*▲
D组
8
<10
0.34±0.15
0.031±0.010
0.96±0.48
139± 53
, 百拇医药
18.3± 9.2
67± 22
4.9±0.1
注：与D组比较，*P<0.05；与A组比较，▲P<0.05;与B组比较，△P<0.05 肺间质，因此雾化吸入的α1-AT能否到达肺间质，提高组织间液的抗蛋白酶活性，是取得疗效的关键。本实验中C组BALF中α1-AT活性明显高于其他各组，可能由于雾化的α1-AT主要集中在支气管和肺泡腔内，使肺局部α1-AT活性增高所致。C组血浆α1-AT含量数值上高于A组，虽然在统计学上与A组比较，差异无显著性，但说明可能有一些α1-AT通过弥散越过肺泡壁进入血循环，提示雾化吸入α1-AT能进入肺间质。与B组比较，C组PaO2的下降减慢，分流也较小，且雾化的α1-AT总量只是静脉用药的一半，无论从疗效、卫生经济学还是安全性上考虑，雾化吸入似优于静脉给药。
, 百拇医药
图1 正常肺组织结构 图2 A组肺组织可见弥漫性肺泡间隔增厚并有炎性细胞浸润，肺泡萎陷，肺胞腔 内可见嗜伊红染色的水肿液和灶性出血。小血管内瘀血并有粒细胞扣押 图3 A组肺组织可见肺泡明显萎陷，肺间质和肺泡腔内见大量核成分叶状的中性粒细胞浸泣 HE染色 ×200 图4 B组肺泡萎陷较A组明显减轻，肺泡间隔轻度增厚，少量炎性细胞浸润，肺泡轻度水肿，有少量出血 图5 C组肺组织改变类似B组 图1、2、4、5均为HE染色 ×100
基金项目：卫生部科学基金资助项目(98-1-150)
参考文献
1，Donnelly SC, MacGregor I, Zamani A,et al. Plasma elastase levels and the development of the adult respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med， 1995， 151: 1428-1433.
2，Nishina K,Mikawa K,Takao Y,et al. ONO-5046, an elastase inhibitor, attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits. Anesth Analg, 1997, 84: 1097-1103.
(收稿日期：1999-07-23), 百拇医药
单位：揭志军(200032 上海医科大学附属中山医院肺科 现在上海新华医院呼吸内科，200092)；蔡映云(200032 上海医科大学附属中山医院肺科)；杨文兰(200032 上海医科大学附属中山医院肺科)；金美玲(200032 上海医科大学附属中山医院肺科)；朱威(上海生物制品研究所)；祝慈芳(上海生物制品研究所)
关键词：
中华内科杂志000517 研究表明蛋白酶-抗蛋白酶失衡在急性肺损伤(ALI)中起重要作用[1]，为此补充抗蛋白酶成为一种治疗ALI的新途径。目前国外一些研究发现，应用合成的蛋白酶抑制物能减轻内毒素所致的肺损伤[2]。而α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)是体内最主要的抗蛋白酶，故本实验应用α1-AT对ALI兔进行干预，并比较静脉注射和雾化吸入的差异，探索防治ALI的新途径。
, http://www.100md.com
一、材料与方法
1.试验方法：32只健康成年新西兰大白兔，雌雄皆有，体重2.0～2.5 kg。麻醉后行气管切开，接呼吸机(Siemens SV900c)进行定容机械通气。稳定30 min后测定基础值，包括动脉血气、血常规、动脉血压、潮气量、气道峰压、平台压、静态总呼吸顺应性以及肺内动静脉分流(
s/t)等。然后随机分成4组，每组8只。(1)A组：急性肺损伤模型组，静脉内输注内毒素(LPS) 500 μg/kg。(2) B组：α1-AT静脉注射干预组，在输注LPS前15 min静脉注射α1-AT(由上海生物制品研究所提供)，浓度30 g/L，剂量为120 mg/kg。(3)C组： α1-AT雾化干预组，输注LPS前15 min和输注LPS 4 h后分别给予α1-AT射流雾化治疗各1次，每次剂量为30 mg/kg。(4)D组：生理盐水对照组，静脉注射生理盐水1 ml/kg。连续机械通气8 h后留取2 ml血浆测定α1-AT含量和活性，然后处死动物，计算肺湿/干重(W/D)比值。测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中α1-AT活性、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)样活性及总蛋白(TP)、白细胞介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)α等含量。, 百拇医药
2.测定方法：采用速率散射比浊法测α1-AT含量 ，活性按Dietz法测定；根据Bieth法测NE样活性；应用ELISA测IL-8和TNFα含量；采用双缩脲法测TP。
3.病理观察：取左下肺组织数小块，石蜡包埋，切片，苏木紫-伊红染色后光镜观察。
4.统计学方法：应用SPSS统计软件对结果进行t检验，各组数据以
±s表示。二、结果
1. 实验过程中各时项点生理指标的变化：见表1。
2. 四组动物血浆和BALF中生化指标及W/D的比较：见表2。
3.各组动物的肺组织结构，见图1～5。
, 百拇医药
讨论 健康兔经静脉注射500 μg/kg LPS后，动脉血氧分压(PaO2)下降，肺顺应性下降，
s/t增加，出现了符合ALI的病理生理变化。A组血浆和BALF中α1-AT活性降低，BALF中NE样活性明显增高，说明蛋白酶-抗蛋白酶失衡可能是引起肺组织损伤的重要原因。因此抗蛋白酶治疗是防治ALI的一个新途径。本组资料显示，应用α1-AT干预后PaO2、WBC、血压和顺应性的下降幅度较A组减小，氧合好转，s/t也较小，BALF中蛋白含量、IL-8、TNFα浓度和W/D降低，说明α1-AT对LPS所致的ALI具有一定的防治作用。, 百拇医药
由于α1-AT的分子量较大(52 000),且ALI的病变主要在
表1 四组动物生理指标的变化(
±s) 组别兔数
(只)
基础值
1/2 h
2 h
4 h
6 h
8 h
PaO2(mm Hg)
, 百拇医药
A组
8
163.9± 7.4
123.6±20.6△*
100.5±25.7△*
83.1±29.7△*
69.1±20.5△*
54.9±12.2△*
B组
8
163.1±17.2
, 百拇医药
149.1±12.8△*#
118.3±14.8△*
116.1±16.0△*#
93.5± 7.5△*#
75.8±10.0△*#
C组
8
169.9±11.6
138.9± 9.0△*
123.9± 8.3△*#
, 百拇医药
123.3±20.6△*#
114.4±25.3△*#▲
93.0±11.3△*#▲
D组
8
160.9±12.7
162.6± 9.3
165.0± 8.8
161.5± 8.8
159.5±11.8
161.1± 7.5
, 百拇医药
气道峰压(cm H2O)
A组
8
7.8±1.8
9.3±1.8*
10.9±1.7△*
13.3±3.2△*
15±4.1△*
15.8± 3.7△*
B组
8
, http://www.100md.com
8.3±0.7
8.7±0.7*
10.6±0.8△*
11.6±1.0△*#
12.3±1.2△*#
13.5± 1.0△*#
C组
8
8.0±1.0
8.7±1.0△*
, http://www.100md.com 10.4±1.2△*
11.0±1.2△*#
11.9±1.1△*#
12.9± 1.1△*#
D组
8
7.8±0.8
7.6±0.8
8.2±0.5
8.2±0.4
8.1±0.4
, 百拇医药
8.3± 0.3
静态总呼吸顺应性(ml/cm H2O)
A组
8
3.42±1.01
2.66±0.41△
2.18±0.31△*
1.86±0.28△*
1.58±0.29△*
1.45±0.21△*
, 百拇医药
B组
8
3.23±0.45
3.15±1.51
2.24±0.23△*
1.99±0.31△*
1.87±0.26△*#
1.72±0.25△*#
C组
8
2.95±0.59
, 百拇医药
2.58±0.30△
2.17±0.25△*
2.09±0.19△*#
1.84±0.14△*#
1.75±0.10△*#
D组
8
3.00±0.58
2.97±0.55
2.93±0.39
, http://www.100md.com 2.92±0.30
2.87±0.36
2.84±0.33
WBC(×109/L)
A组
8
4.9±0.3
2.8±0.6△*
1.8±0.3△*
2.4±0.7△*
2.7±0.6△*
, 百拇医药
3.2±1.0△*
B组
8
4.6±0.6
2.6±1.0△*
2.9±1.2△*
3.7±1.5
4.8±1.4#
6.0±1.5#
C组
8
, 百拇医药
5.0±0.4
2.9±0.5△*
2.6±0.7△*#
3.5±0.3△*#
5.2±1.1#
6.3±0.9*#
D组
8
4.9±0.3
4.8±0.2
4.3±0.3
, 百拇医药
4.2±0.3
4.6±0.3
5.2±0.3
血压(mm Hg)
A组
8
93.0± 7.3
70.8± 6.3△*
65.4± 3.7△*
60.1± 5.9△*
55.5± 7.0△*
, 百拇医药
52.9± 9.7△*
B组
8
92.0±10.7
71.5± 5.6△*
68.0± 5.8△*
73.0± 9.0△*#
71.0± 6.6△*#
73.5±10.8△*#
C组
, http://www.100md.com
8
89.3± 9.7
74.5±14.4△*
64.1±11.1△*
69.6±11.8△*
65.9±13.0△*
60.1±10.8△*
D组
8
92.3± 7.0
92.9± 6.8
, http://www.100md.com
92.3± 6.9
96.0± 5.2
94.8± 6.7
93.5± 7.2
s/t(%)A组
8
14.7±1.6
-
-
21.8±2.8△*
, 百拇医药
-
26.2± 1.3△*
B组
8
14.2±1.0
-
-
18.6±2.7△*#
-
21.5± 3.0△*#
C组
8
, 百拇医药
12.8±1.4
-
-
15.5±1.0△*#▲
-
19.9± 1.2*△#▲
D组
8
12.8±1.5
-
-
14.3±1.4
, 百拇医药
-
14.1± 1.4
注：表中-为未做；1 mm Hg=0.133 kPa; 1 cm H2O=0.098 kPa 与基础值相比，△P<0.05；与D组相比，*P<0.05；与A组相比，#P<0.05；B组与C组相比，▲P<0.05表2 四组动物血浆和BALF中生化指标以及W/D的比较(
±s) 组别兔数
(只)
血浆
BALF
, 百拇医药
W/D
α1-AT含量
(mg/L)
α1-AT活性
(×103U/L)
α1-AT活性
(×103U/L)
NE样活性
(nmol.ml-1.h-1)
, http://www.100md.com
IL-8
(ng/L)
TNFα(ng/L)
TP
(mg/kg)
A组
8
406±222*
0.21±0.08*
0.018±0.004*
10.10±4.52*
, 百拇医药
1 160±280*
74.0±33.6*
254±108*
6.5±0.6*
B组
8
996±382*▲
0.50±0.13*▲
0.051±0.018*▲
3.11±1.65*▲
, 百拇医药
782±263*▲
41.7±26.0*▲
132± 42*▲
5.6±0.3*▲
C组
8
495±131*△
0.42±0.13▲
0.076±0.014*▲△
2.38±1.31*▲
, 百拇医药
609±151*▲
35.9±11.9*▲
120± 23*▲
5.4±0.2*▲
D组
8
<10
0.34±0.15
0.031±0.010
0.96±0.48
139± 53
, 百拇医药
18.3± 9.2
67± 22
4.9±0.1
注：与D组比较，*P<0.05；与A组比较，▲P<0.05;与B组比较，△P<0.05 肺间质，因此雾化吸入的α1-AT能否到达肺间质，提高组织间液的抗蛋白酶活性，是取得疗效的关键。本实验中C组BALF中α1-AT活性明显高于其他各组，可能由于雾化的α1-AT主要集中在支气管和肺泡腔内，使肺局部α1-AT活性增高所致。C组血浆α1-AT含量数值上高于A组，虽然在统计学上与A组比较，差异无显著性，但说明可能有一些α1-AT通过弥散越过肺泡壁进入血循环，提示雾化吸入α1-AT能进入肺间质。与B组比较，C组PaO2的下降减慢，分流也较小，且雾化的α1-AT总量只是静脉用药的一半，无论从疗效、卫生经济学还是安全性上考虑，雾化吸入似优于静脉给药。
, 百拇医药
图1 正常肺组织结构 图2 A组肺组织可见弥漫性肺泡间隔增厚并有炎性细胞浸润，肺泡萎陷，肺胞腔 内可见嗜伊红染色的水肿液和灶性出血。小血管内瘀血并有粒细胞扣押 图3 A组肺组织可见肺泡明显萎陷，肺间质和肺泡腔内见大量核成分叶状的中性粒细胞浸泣 HE染色 ×200 图4 B组肺泡萎陷较A组明显减轻，肺泡间隔轻度增厚，少量炎性细胞浸润，肺泡轻度水肿，有少量出血 图5 C组肺组织改变类似B组 图1、2、4、5均为HE染色 ×100
基金项目：卫生部科学基金资助项目(98-1-150)
参考文献
1，Donnelly SC, MacGregor I, Zamani A,et al. Plasma elastase levels and the development of the adult respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med， 1995， 151: 1428-1433.
2，Nishina K,Mikawa K,Takao Y,et al. ONO-5046, an elastase inhibitor, attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits. Anesth Analg, 1997, 84: 1097-1103.
(收稿日期：1999-07-23), 百拇医药