胰腺癌组织中抑癌蛋白的表达及其临床意义
作者：徐彤 陆星华 胡育新 侯敏
单位：徐彤(100730 中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院消化内科)；陆星华(100730 中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院消化内科)；胡育新(病理科)侯敏(上海长海医院肿瘤科)
关键词：胰腺肿瘤；免疫组织化学；抑癌蛋白
中华内科杂志000508 【摘要】 目的 分析抑癌蛋白(p53、p16Ink4、p21Waf1、p27Kip1)在胰腺癌组织中的异常表达及其与临床和病理特征的关系。方法 采用单克隆抗体及免疫组化 Envision法分别检测了35例胰腺癌、14例壶腹癌和11例慢性胰腺炎组织中p53、p16、p21和p27的表达情况。 结果 p53在胰腺癌和慢性胰腺炎的表达阳性率分别为62.9%和0 (P<0.05)。p16、p21和p27在胰腺癌的表达缺失率分别为60.0%、37.1% 和62.9%，缺失率明显高于慢性胰腺炎(P<0.05)。80% 的胰腺癌组织有2种以上抑癌蛋白的表达异常。不同抑癌蛋白表达之间无明显相关。除p16表达与肿瘤分化程度相关(P<0.05)外，4种抑癌蛋白表达与年龄、性别、肿瘤大小、部位、淋巴结转移和临床分期等无明显相关。结论 胰腺癌组织中可存在多种抑癌蛋白的表达异常，表明抑癌机制的丧失是胰腺癌发生的重要机制。
, 百拇医药
The expression of anti-oncogene products in pancreatic carcinoma
XU Tong LU Xinghua HU Yuxin
(Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730,China)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of anti-oncogene products (p53、p16Ink4、p21Waf1 and p27Kip1) in pancreatic carcinoma(PCa) and their relationship with clinicopathological findings. Methods 35 specimens of PCa,14 of ampulla carcinoma and 11 of chronic pancreatitis (CP)were obtained by surgery and p53、p16、p21 and p27 proteins were immunohistochemically stained respectively by using Envision system. Results p53 protein was positively stained in 22 out of 35 PCa specimens (62.9%),with a rate much higher than that in CP(P<0.05). 20(60.0 %) 、13(37.1%) and 22(62.9%) of 35 PCa specimens showed loss of p16、p21 and p27, all of which except p27 showed a significant difference when compared with CP(P<0.05). Eighty percent of PCa specimens showed abnormality of more than 2 kinds of anti-oncogene products. There was no significant correlation between any two proteins, neither between expression of anti-oncogene products and the age,gender, tumor site, tumor size, clinical stages and lymph nodes metastasis. However, p16 protein expression was correlated with histological grade. Conclusion Abnormal expression of anti-oncogene products was common in PCa, abrogation of tumor-suppressive pathways might play an important role in the carcinogenesis.
, 百拇医药
【Key words】 Pancreatic carcinoma； Immunohistochemistry； Anti-oncogene products
近年来研究表明，细胞周期调节失控是肿瘤发生的重要机制。细胞周期的正常演进依赖于细胞周期蛋白(cyclins)-细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)-细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKIs)的正负性调节。其中G1卡点可以决定细胞继续增殖抑或进入G0期或进入终末分化或死亡。这一卡点主要受cyclin D1/K4和cyclin E/CDK2调节。CKIs是一类新近分离的小分子蛋白，已发现的有p16Ink4、p21Waf1、p27Kip1(以下简称p16、p21、p27)等在G1卡点作用于CDK/cyclin复合物,阻止细胞周期运行，抑制细胞向恶性转化，也被称为抑癌基因，在上皮细胞恶性转化中它们的失活比癌基因的变异更为重要。在基因研究的同时，检测抑癌基因表达异常可进一步有助于分析其与肿瘤发生的关系。免疫组化研究既可以保持原有的组织形态，把基因表达和组织病理观察直接联系起来，实验方法又简单、易行，是最常选择的方法。已有文献报道，胰腺癌(PCa)组织有 p53、p16和p21的异常表达：p53表达率为37%～64%[1-5]， p16表达缺失率为42%～45%, 甚至更高[6,7]，p21的表达缺失率为59%～79%[2,3]。但不同抑癌蛋白表达之间的关系、多抑癌蛋白表达异常的情况及其与临床病理特征的关系尚不肯定。另外，p27在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、肺癌、结直肠癌等多种癌组织中有表达缺失，并与恶性程度、预后等有关[8],在PCa的表达尚不清楚。我们应用免疫组化法检测了PCa组织中上述蛋白的表达，以探讨多种CKI蛋白表达与PCa临床及病理学特征的关系。
, 百拇医药
表1 本研究所用一抗特性、工作浓度及阳性对照 鼠单抗
出产
克隆号
特异结合性
浓度(mg/L)
稀释度
阳性对照
抗p53
DAKO,Glostrup,Denmark
Do-7
p53蛋白
400
, http://www.100md.com
1:100
结肠癌
抗p16INK4
PharMingen,Inc., San Diego,CA
G175-405
人p16蛋白
500
1:200
黑色素瘤
抗p21Waf1
Santa Cruz， Biotechnology，Inc.,Santa Cruz,CA
, 百拇医药
187
人p21蛋白
200
1:400
PANC-1
抗p27Kip1
PharMingen,Inc.,G173-524
鼠和人
500
1:200
皮脂腺瘤
San Diego,CA
, 百拇医药
p27蛋白
材料与方法 1.病例与标本：35例PCa，14例壶腹癌(ACa)和11例慢性胰腺炎(CP)均为手术切除标本，并有手术记录及临床资料。35例PCa中男21例，女14例，年龄37～76岁，平均58.6岁。患者术前均未接受放疗和化疗。其中高分化腺癌12例，中分化腺癌12例，低分化腺癌11例。按照美国癌症协会TNM标准进行临床分期，其中Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期14例，Ⅳ期2例。
2.免疫染色：所有标本均经10%中性甲醛固定及石蜡包埋，连续切片4 μm厚，分别作HE及免疫组化染色[Envision system：鼠EnvisionTM+System,Peroxidase(DAB),K 4006, DAKO,Glostrup,Denmark]。切片常规脱蜡至水后，3% H2O2室温下20 min抑制内源性过氧化物酶。后置于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液微波95～100℃ 10～15 min修复抗原。特异性单克隆抗体孵育(20～25℃)30 min，二抗-酶标多聚物孵育(20～25℃)30 min，DAB显色5～10 min，水洗后苏木素衬染。一抗均为鼠单克隆抗体，其特异性均经Western blot分析鉴定，并适用于石蜡切片免疫组化检测，它们的特性见表1。每批染色均设阳性对照，见表1,阴性对照采用抗体稀释液(北京中山有限公司)代替一抗。
, 百拇医药
3.结果判定：p53、p21、p27的阳性判定均以细胞核为准，无论胞浆阳性与否：核阳性细胞数>5%的肿瘤细胞视为阳性。由于p16易在胞浆着色，采用特异性单克隆抗体研究者仅把核阳性视为阳性[6,7]。在我们的研究中部分正常胰腺组织以胞浆着色为主，因此判断p16表达与否以胞核为主，并兼顾胞浆染色：核阳性细胞数>5%或胞浆强阳性细胞数>50%肿瘤细胞为阳性。
4.统计学分析：采用χ2检验分析。
结果
1.抑癌蛋白在PCa和CP中的不同表达：p53均在细胞核表达，且呈不均一性，阳性细胞占0～100%不等。而p21和p27除了在细胞核表达外，还可在胞浆表达，且往往呈弥漫性。p16的表达均为胞核与胞浆同时表达。间质细胞不表达p53和p21,但有时表达p16和p27。4种蛋白典型的阳性表达，见图1、2、4、5。p53、p16、p21和p27在不同疾病的表达情况，见表2。在CP中，所有腺泡和导管细胞均不表达p53,均表达p21,绝大多数表达p16和p27。但在PCa中，p53阳性率升高至62.9%，同时有不同程度的p16、p21和p27表达缺失，缺失率分别为60.0%、37.1%和62.9%。这种表达缺失在ACa却没有如此突出，分别为28.6%、28.6%和50.0%。
, 百拇医药
表2 p16、p21、p53、p27蛋白在不同疾病中的表达 病种
例数
p16缺失
p21缺失
p53过度表达
p27缺失
慢性胰腺炎
11
1
0
0
3
胰腺癌
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35
21*
13*
22*
22
壶腹癌
14
4
4
6*
7
注：与慢性胰腺炎相比差异有显著性， *P<0.05 2.PCa多抑癌蛋白表达异常情况：35例PCa中，仅有1种抑癌蛋白表达异常的有7例(20.0%)，且仅见于p53过度表达。有2种异常的有15例(42.9%)，其中较多的组合是p16-p27-和p53+p27-,各为4例，未见到p21-p53+者。同时有3种异常的有11例(31.4%)，多见于p53+p27-p16-或p53+p27-p21-。4种蛋白表达均异常者有2例(5.7%)。同一部位连续切片HE染色及4种蛋白表达情况，见图3～7。
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3.不同抑癌蛋白表达的相互关系：任意2组抑癌蛋白表达异常的相关性分析表明：p16、p27表达缺失与p21、p53表达异常均无相关，但p53表达过度和p21表达缺失间呈负相关(r=-0.51，P<0.05)。
4. PCa抑癌蛋白表达与临床病理及生存时间的关系： p16、p21、p53、p27蛋白表达异常与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、淋巴结转移及临床分期无关(表3)，但是低分化肿瘤组织的p16表达缺失率高于高分化组织，两者差异有显著性(P<0.05)。
表3 p16、p21、p53、p27蛋白表达与胰腺癌临床及病理学特征的关系 临床病理
参数
例数
p16缺失
p21缺失
, 百拇医药
p53异常
表达
p27缺失
性别
男
21
14(66.7)
6(28.6)
14(66.7)
13(61.9)
女
14
7(50.0)
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7(50.0)
8(57.1)
9(64.3)
年龄(岁)
≥50
24
14(58.3)
8(33.3)
15(62.5)
15(62.5)
<50
11
7(63.6)
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5(45.5)
7(63.6)
7(63.6)
肿瘤大小
≥5cm
15
7(46.7)
5(33.3)
9(60.0)
9(60.0)
<5cm
20
14(70.0)
, 百拇医药
8(40.0)
13(65.0)
13(65.0)
肿瘤部位
头
23
16(69.6)
8(34.8)
15(65.2)
16(69.6)
体尾
12
5(41.7)
, 百拇医药
5(41.7)
7(58.3)
6(50.0)
病理学
高-中分化
24
11(45.8)
10(41.7)
16(66.7)
15(62.5)
低分化
11
, 百拇医药 10(90.9)*
3(27.3)
6(54.5)
7(63.6)
淋巴结转移
转移
17
11(64.7)
6(35.3)
12(70.6)
12(70.6)
未转移
, 百拇医药
18
10(55.6)
7(38.9)
10(55.6)
10(55.6)
临床分期
Ⅰ～Ⅱ期
19
10(52.6)
7(36.8)
11(57.9)
10(52.6)
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Ⅲ～Ⅳ期
16
11(68.8)
6(37.5)
11(68.8)
12(75.0)
注： 两组间比较差异有显著性，*P<0.05
讨论
CKIs被认为有抑制细胞周期和细胞增殖分化的作用。其中野生型p53诱导Waf1/Cip1基因编码的蛋白产物p21表达，后者抑制cyclin D1/CDK4复合物的活性,抑制DNA合成。p16与cyclin D1竞争结合并抑制CDK4的活性,使之不能解除Rb蛋白对转录因子的抑制。p27抑制cyclin E/CDK2、cyclin A/CDK2、cyclin D1/CDK4的活性，其中cyclin D1/CDK4与p27Kip1的动态平衡是决定细胞增殖分化的最重要因素[8]。当这些基因异常或不能正常表达时，细胞增殖失控，向癌变发展。
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野生型p53易水解，半衰期20～40 min，免疫组化检测不到。但突变型p53蛋白构型改变，稳定性增加，半衰期2～12 h，可被免疫组化检出。所以p53过度表达通常被认为提示有p53基因突变。据多项报道，以阳性细胞>20%为分界值，基本可反映有无p53基因突变[1]。大约95%的PCa有p16基因转录异常，其中40%为杂和缺失，40%为纯合缺失，15%为p16启动子的CpG岛甲基化[7]。但由于组织标本中混有正常组织，p16基因GC含量丰富等原因，基因异常的检出率仅为20%～50%。而免疫组化采用特异性抗体(如G175-405)仅标记p16野生型蛋白，无论何种基因异常，都表现为表达缺失。与p53、p16不同，多种肿瘤中均未发现p21[9]和p27[10,11]基因异常。p27表达与mRNA无直接关系，而主要受翻译、泛素/蛋白酶途径降解和非共价结合等转录后调节，如降解活性增强致表达缺失[8,12]，因此p27表达异常不能反映基因异常。
, 百拇医药
CP(包括腺泡和导管细胞)组织通常表达的p16、p21在PCa中表达明显减弱或消失，但这些异常在ACa却没有如此突出，表明p16、p21在PCa的发生中更为重要。p53在CP通常不表达，在PCa、ACa却过度表达,2种癌组间差异无显著性，表明p53在2种肿瘤的发生中起同等重要作用。大多数正常组织不表达p27，仅在一些细胞增殖分化水平较低的组织如皮肤附件、血管平滑肌等表达，表明其有控制细胞分化的作用[8]。正常胰腺腺泡及导管细胞几乎不表达p27，但在CP时却有表达，可能为细胞在炎症时对p27 的耐受性增强所致。当p27表达减弱或对抗因素增强时,出现向癌发展的趋势。我们的结果表明，p27在PCa的阳性率明显低于CP(虽然差异无显著性)，同时Fredersdorf 等[8]发现乳腺癌细胞株在p27高表达的同时有更高的cyclin D1、CDK4表达，提示cyclin D1提高了细胞对p27的耐受，这些都支持上述观点。
35例PCa中1种抑癌蛋白表达异常仅见于p53，表明与其他三者相比，p53异常发生在较早阶段[5]或者p53在致瘤方面的独立性更大。不过，80% PCa有2种以上抑癌蛋白表达异常，表明多数情况下癌的发生及发展是多个基因及表达异常的结果。这项研究中未发现不同抑癌蛋白表达之间的相关性，这可以用它们不同的发病机制来解释。有争议的是，既然p53诱导p21表达抑制CDK1活性，用p21表达反映p53功能状态似乎比p53蛋白本身的表达更有意义。有人发现PCa的p53+与p21-显著相关，看来可以印证这一点[3]。但也有研究发现两者无显著相关，甚至在明确有p53框架漂移或点突变或17p LOH致p53表达缺失的肿瘤中仍有p21表达[2,13]。我们甚至发现p53+和p21-间有负相关，表明的确存在p53非依赖的p21表达，甚至后者更为重要。其中p21 mRNA的稳定性增加可能是重要机制。
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p53蛋白表达与胰腺癌患者年龄、性别、TNM分期、淋巴结转移无明显关系，与文献报道类似[1]。近年来认为其与预后有关[4]，但我们的研究缺乏随访资料。p16的表达缺失与肿瘤的分化程度相关，且在胰腺导管病变的不同阶段p16表达缺失率逐渐上升[7]都表明p16在维持正常细胞形态、抑制细胞恶性变方面起重要作用。虽然p27在其他肿瘤有帮助预后的作用，但对PCa来说似乎意义不大，还需要更大样本及长期的随访研究。
, 百拇医药
图1 胰腺癌组织P16表达：癌细胞核强阳性，胞浆部分着色，部分间质细胞阳性 图2 胰腺癌组织 p27表达：癌细胞核及胞浆均
着色 图3胰腺癌组织连续切片 HE×200图4胰腺癌组织连续切片 p53 表达：仅在癌细胞核表达，间质细胞不表达 图 5 胰腺癌组织连续切片 p21表达：癌细胞核强阳性，胞浆也有
表达 图 6 胰腺癌组织连续切片：癌细胞不表达 p16 图 7胰腺癌组织连续切片：癌细胞不表达 p27图 1，2，4～7均为免疫组化Envision法(DAB)，苏木素衬染 ×200
基金项目：卫生部直属医疗机构临床学科重点基金资助(9700001)
参考文献
1，Lundin J, Nordling S, von Boguslawsky K, et al. Prognostic value of immunohistochemical expression of p53 in patients with pancreatic cancer. Oncology, 1996,53:104-111.
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(收稿日期：2000-01-06), 百拇医药
单位：徐彤(100730 中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院消化内科)；陆星华(100730 中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院消化内科)；胡育新(病理科)侯敏(上海长海医院肿瘤科)
关键词：胰腺肿瘤；免疫组织化学；抑癌蛋白
中华内科杂志000508 【摘要】 目的 分析抑癌蛋白(p53、p16Ink4、p21Waf1、p27Kip1)在胰腺癌组织中的异常表达及其与临床和病理特征的关系。方法 采用单克隆抗体及免疫组化 Envision法分别检测了35例胰腺癌、14例壶腹癌和11例慢性胰腺炎组织中p53、p16、p21和p27的表达情况。 结果 p53在胰腺癌和慢性胰腺炎的表达阳性率分别为62.9%和0 (P<0.05)。p16、p21和p27在胰腺癌的表达缺失率分别为60.0%、37.1% 和62.9%，缺失率明显高于慢性胰腺炎(P<0.05)。80% 的胰腺癌组织有2种以上抑癌蛋白的表达异常。不同抑癌蛋白表达之间无明显相关。除p16表达与肿瘤分化程度相关(P<0.05)外，4种抑癌蛋白表达与年龄、性别、肿瘤大小、部位、淋巴结转移和临床分期等无明显相关。结论 胰腺癌组织中可存在多种抑癌蛋白的表达异常，表明抑癌机制的丧失是胰腺癌发生的重要机制。
, 百拇医药
The expression of anti-oncogene products in pancreatic carcinoma
XU Tong LU Xinghua HU Yuxin
(Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730,China)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of anti-oncogene products (p53、p16Ink4、p21Waf1 and p27Kip1) in pancreatic carcinoma(PCa) and their relationship with clinicopathological findings. Methods 35 specimens of PCa,14 of ampulla carcinoma and 11 of chronic pancreatitis (CP)were obtained by surgery and p53、p16、p21 and p27 proteins were immunohistochemically stained respectively by using Envision system. Results p53 protein was positively stained in 22 out of 35 PCa specimens (62.9%),with a rate much higher than that in CP(P<0.05). 20(60.0 %) 、13(37.1%) and 22(62.9%) of 35 PCa specimens showed loss of p16、p21 and p27, all of which except p27 showed a significant difference when compared with CP(P<0.05). Eighty percent of PCa specimens showed abnormality of more than 2 kinds of anti-oncogene products. There was no significant correlation between any two proteins, neither between expression of anti-oncogene products and the age,gender, tumor site, tumor size, clinical stages and lymph nodes metastasis. However, p16 protein expression was correlated with histological grade. Conclusion Abnormal expression of anti-oncogene products was common in PCa, abrogation of tumor-suppressive pathways might play an important role in the carcinogenesis.
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【Key words】 Pancreatic carcinoma； Immunohistochemistry； Anti-oncogene products
近年来研究表明，细胞周期调节失控是肿瘤发生的重要机制。细胞周期的正常演进依赖于细胞周期蛋白(cyclins)-细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)-细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKIs)的正负性调节。其中G1卡点可以决定细胞继续增殖抑或进入G0期或进入终末分化或死亡。这一卡点主要受cyclin D1/K4和cyclin E/CDK2调节。CKIs是一类新近分离的小分子蛋白，已发现的有p16Ink4、p21Waf1、p27Kip1(以下简称p16、p21、p27)等在G1卡点作用于CDK/cyclin复合物,阻止细胞周期运行，抑制细胞向恶性转化，也被称为抑癌基因，在上皮细胞恶性转化中它们的失活比癌基因的变异更为重要。在基因研究的同时，检测抑癌基因表达异常可进一步有助于分析其与肿瘤发生的关系。免疫组化研究既可以保持原有的组织形态，把基因表达和组织病理观察直接联系起来，实验方法又简单、易行，是最常选择的方法。已有文献报道，胰腺癌(PCa)组织有 p53、p16和p21的异常表达：p53表达率为37%～64%[1-5]， p16表达缺失率为42%～45%, 甚至更高[6,7]，p21的表达缺失率为59%～79%[2,3]。但不同抑癌蛋白表达之间的关系、多抑癌蛋白表达异常的情况及其与临床病理特征的关系尚不肯定。另外，p27在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、肺癌、结直肠癌等多种癌组织中有表达缺失，并与恶性程度、预后等有关[8],在PCa的表达尚不清楚。我们应用免疫组化法检测了PCa组织中上述蛋白的表达，以探讨多种CKI蛋白表达与PCa临床及病理学特征的关系。
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表1 本研究所用一抗特性、工作浓度及阳性对照 鼠单抗
出产
克隆号
特异结合性
浓度(mg/L)
稀释度
阳性对照
抗p53
DAKO,Glostrup,Denmark
Do-7
p53蛋白
400
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1:100
结肠癌
抗p16INK4
PharMingen,Inc., San Diego,CA
G175-405
人p16蛋白
500
1:200
黑色素瘤
抗p21Waf1
Santa Cruz， Biotechnology，Inc.,Santa Cruz,CA
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187
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200
1:400
PANC-1
抗p27Kip1
PharMingen,Inc.,G173-524
鼠和人
500
1:200
皮脂腺瘤
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p27蛋白
材料与方法 1.病例与标本：35例PCa，14例壶腹癌(ACa)和11例慢性胰腺炎(CP)均为手术切除标本，并有手术记录及临床资料。35例PCa中男21例，女14例，年龄37～76岁，平均58.6岁。患者术前均未接受放疗和化疗。其中高分化腺癌12例，中分化腺癌12例，低分化腺癌11例。按照美国癌症协会TNM标准进行临床分期，其中Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期14例，Ⅳ期2例。
2.免疫染色：所有标本均经10%中性甲醛固定及石蜡包埋，连续切片4 μm厚，分别作HE及免疫组化染色[Envision system：鼠EnvisionTM+System,Peroxidase(DAB),K 4006, DAKO,Glostrup,Denmark]。切片常规脱蜡至水后，3% H2O2室温下20 min抑制内源性过氧化物酶。后置于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液微波95～100℃ 10～15 min修复抗原。特异性单克隆抗体孵育(20～25℃)30 min，二抗-酶标多聚物孵育(20～25℃)30 min，DAB显色5～10 min，水洗后苏木素衬染。一抗均为鼠单克隆抗体，其特异性均经Western blot分析鉴定，并适用于石蜡切片免疫组化检测，它们的特性见表1。每批染色均设阳性对照，见表1,阴性对照采用抗体稀释液(北京中山有限公司)代替一抗。
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3.结果判定：p53、p21、p27的阳性判定均以细胞核为准，无论胞浆阳性与否：核阳性细胞数>5%的肿瘤细胞视为阳性。由于p16易在胞浆着色，采用特异性单克隆抗体研究者仅把核阳性视为阳性[6,7]。在我们的研究中部分正常胰腺组织以胞浆着色为主，因此判断p16表达与否以胞核为主，并兼顾胞浆染色：核阳性细胞数>5%或胞浆强阳性细胞数>50%肿瘤细胞为阳性。
4.统计学分析：采用χ2检验分析。
结果
1.抑癌蛋白在PCa和CP中的不同表达：p53均在细胞核表达，且呈不均一性，阳性细胞占0～100%不等。而p21和p27除了在细胞核表达外，还可在胞浆表达，且往往呈弥漫性。p16的表达均为胞核与胞浆同时表达。间质细胞不表达p53和p21,但有时表达p16和p27。4种蛋白典型的阳性表达，见图1、2、4、5。p53、p16、p21和p27在不同疾病的表达情况，见表2。在CP中，所有腺泡和导管细胞均不表达p53,均表达p21,绝大多数表达p16和p27。但在PCa中，p53阳性率升高至62.9%，同时有不同程度的p16、p21和p27表达缺失，缺失率分别为60.0%、37.1%和62.9%。这种表达缺失在ACa却没有如此突出，分别为28.6%、28.6%和50.0%。
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表2 p16、p21、p53、p27蛋白在不同疾病中的表达 病种
例数
p16缺失
p21缺失
p53过度表达
p27缺失
慢性胰腺炎
11
1
0
0
3
胰腺癌
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35
21*
13*
22*
22
壶腹癌
14
4
4
6*
7
注：与慢性胰腺炎相比差异有显著性， *P<0.05 2.PCa多抑癌蛋白表达异常情况：35例PCa中，仅有1种抑癌蛋白表达异常的有7例(20.0%)，且仅见于p53过度表达。有2种异常的有15例(42.9%)，其中较多的组合是p16-p27-和p53+p27-,各为4例，未见到p21-p53+者。同时有3种异常的有11例(31.4%)，多见于p53+p27-p16-或p53+p27-p21-。4种蛋白表达均异常者有2例(5.7%)。同一部位连续切片HE染色及4种蛋白表达情况，见图3～7。
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3.不同抑癌蛋白表达的相互关系：任意2组抑癌蛋白表达异常的相关性分析表明：p16、p27表达缺失与p21、p53表达异常均无相关，但p53表达过度和p21表达缺失间呈负相关(r=-0.51，P<0.05)。
4. PCa抑癌蛋白表达与临床病理及生存时间的关系： p16、p21、p53、p27蛋白表达异常与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、淋巴结转移及临床分期无关(表3)，但是低分化肿瘤组织的p16表达缺失率高于高分化组织，两者差异有显著性(P<0.05)。
表3 p16、p21、p53、p27蛋白表达与胰腺癌临床及病理学特征的关系 临床病理
参数
例数
p16缺失
p21缺失
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p53异常
表达
p27缺失
性别
男
21
14(66.7)
6(28.6)
14(66.7)
13(61.9)
女
14
7(50.0)
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7(50.0)
8(57.1)
9(64.3)
年龄(岁)
≥50
24
14(58.3)
8(33.3)
15(62.5)
15(62.5)
<50
11
7(63.6)
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5(45.5)
7(63.6)
7(63.6)
肿瘤大小
≥5cm
15
7(46.7)
5(33.3)
9(60.0)
9(60.0)
<5cm
20
14(70.0)
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8(40.0)
13(65.0)
13(65.0)
肿瘤部位
头
23
16(69.6)
8(34.8)
15(65.2)
16(69.6)
体尾
12
5(41.7)
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5(41.7)
7(58.3)
6(50.0)
病理学
高-中分化
24
11(45.8)
10(41.7)
16(66.7)
15(62.5)
低分化
11
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3(27.3)
6(54.5)
7(63.6)
淋巴结转移
转移
17
11(64.7)
6(35.3)
12(70.6)
12(70.6)
未转移
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18
10(55.6)
7(38.9)
10(55.6)
10(55.6)
临床分期
Ⅰ～Ⅱ期
19
10(52.6)
7(36.8)
11(57.9)
10(52.6)
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Ⅲ～Ⅳ期
16
11(68.8)
6(37.5)
11(68.8)
12(75.0)
注： 两组间比较差异有显著性，*P<0.05
讨论
CKIs被认为有抑制细胞周期和细胞增殖分化的作用。其中野生型p53诱导Waf1/Cip1基因编码的蛋白产物p21表达，后者抑制cyclin D1/CDK4复合物的活性,抑制DNA合成。p16与cyclin D1竞争结合并抑制CDK4的活性,使之不能解除Rb蛋白对转录因子的抑制。p27抑制cyclin E/CDK2、cyclin A/CDK2、cyclin D1/CDK4的活性，其中cyclin D1/CDK4与p27Kip1的动态平衡是决定细胞增殖分化的最重要因素[8]。当这些基因异常或不能正常表达时，细胞增殖失控，向癌变发展。
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野生型p53易水解，半衰期20～40 min，免疫组化检测不到。但突变型p53蛋白构型改变，稳定性增加，半衰期2～12 h，可被免疫组化检出。所以p53过度表达通常被认为提示有p53基因突变。据多项报道，以阳性细胞>20%为分界值，基本可反映有无p53基因突变[1]。大约95%的PCa有p16基因转录异常，其中40%为杂和缺失，40%为纯合缺失，15%为p16启动子的CpG岛甲基化[7]。但由于组织标本中混有正常组织，p16基因GC含量丰富等原因，基因异常的检出率仅为20%～50%。而免疫组化采用特异性抗体(如G175-405)仅标记p16野生型蛋白，无论何种基因异常，都表现为表达缺失。与p53、p16不同，多种肿瘤中均未发现p21[9]和p27[10,11]基因异常。p27表达与mRNA无直接关系，而主要受翻译、泛素/蛋白酶途径降解和非共价结合等转录后调节，如降解活性增强致表达缺失[8,12]，因此p27表达异常不能反映基因异常。
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CP(包括腺泡和导管细胞)组织通常表达的p16、p21在PCa中表达明显减弱或消失，但这些异常在ACa却没有如此突出，表明p16、p21在PCa的发生中更为重要。p53在CP通常不表达，在PCa、ACa却过度表达,2种癌组间差异无显著性，表明p53在2种肿瘤的发生中起同等重要作用。大多数正常组织不表达p27，仅在一些细胞增殖分化水平较低的组织如皮肤附件、血管平滑肌等表达，表明其有控制细胞分化的作用[8]。正常胰腺腺泡及导管细胞几乎不表达p27，但在CP时却有表达，可能为细胞在炎症时对p27 的耐受性增强所致。当p27表达减弱或对抗因素增强时,出现向癌发展的趋势。我们的结果表明，p27在PCa的阳性率明显低于CP(虽然差异无显著性)，同时Fredersdorf 等[8]发现乳腺癌细胞株在p27高表达的同时有更高的cyclin D1、CDK4表达，提示cyclin D1提高了细胞对p27的耐受，这些都支持上述观点。
35例PCa中1种抑癌蛋白表达异常仅见于p53，表明与其他三者相比，p53异常发生在较早阶段[5]或者p53在致瘤方面的独立性更大。不过，80% PCa有2种以上抑癌蛋白表达异常，表明多数情况下癌的发生及发展是多个基因及表达异常的结果。这项研究中未发现不同抑癌蛋白表达之间的相关性，这可以用它们不同的发病机制来解释。有争议的是，既然p53诱导p21表达抑制CDK1活性，用p21表达反映p53功能状态似乎比p53蛋白本身的表达更有意义。有人发现PCa的p53+与p21-显著相关，看来可以印证这一点[3]。但也有研究发现两者无显著相关，甚至在明确有p53框架漂移或点突变或17p LOH致p53表达缺失的肿瘤中仍有p21表达[2,13]。我们甚至发现p53+和p21-间有负相关，表明的确存在p53非依赖的p21表达，甚至后者更为重要。其中p21 mRNA的稳定性增加可能是重要机制。
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p53蛋白表达与胰腺癌患者年龄、性别、TNM分期、淋巴结转移无明显关系，与文献报道类似[1]。近年来认为其与预后有关[4]，但我们的研究缺乏随访资料。p16的表达缺失与肿瘤的分化程度相关，且在胰腺导管病变的不同阶段p16表达缺失率逐渐上升[7]都表明p16在维持正常细胞形态、抑制细胞恶性变方面起重要作用。虽然p27在其他肿瘤有帮助预后的作用，但对PCa来说似乎意义不大，还需要更大样本及长期的随访研究。
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图1 胰腺癌组织P16表达：癌细胞核强阳性，胞浆部分着色，部分间质细胞阳性 图2 胰腺癌组织 p27表达：癌细胞核及胞浆均
着色 图3胰腺癌组织连续切片 HE×200图4胰腺癌组织连续切片 p53 表达：仅在癌细胞核表达，间质细胞不表达 图 5 胰腺癌组织连续切片 p21表达：癌细胞核强阳性，胞浆也有
表达 图 6 胰腺癌组织连续切片：癌细胞不表达 p16 图 7胰腺癌组织连续切片：癌细胞不表达 p27图 1，2，4～7均为免疫组化Envision法(DAB)，苏木素衬染 ×200
基金项目：卫生部直属医疗机构临床学科重点基金资助(9700001)
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(收稿日期：2000-01-06), 百拇医药