脑卒中患者转化生长因子与细胞黏附因子检测及分析
作者：王钢 黄建群
单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院急诊科
关键词：脑血管意外；转化生长因子β；细胞间黏附因子
中华内科杂志000506 【摘要】 目的 探讨脑卒中患者外周血转化生长因子(TGF-β1)和细胞黏附因子(sICAM-1)水平的变化并对其进行分析。方法 对脑卒中患者(脑出血30例，脑血栓30例)外周血TGF-β1和sICAM-1水平进行检测。结果 脑出血患者外周血TGF-β1的水平明显低于对照组(P<0.01)，而sICAM-1水平明显高于对照组(P<0.01)；脑血栓患者外周血TGF-β1水平与对照组差异无显著性，而sICAM-1水平明显高于对照组(P<0.01)。 结论 TGF-β1具有保护脑组织作用，卒中后低水平的TGF-β1可加重脑损伤；sICAM-1是一种损伤性炎症因子，卒中病人高水平的sICAM-1表明其具有损伤作用。
, 百拇医药
The change of transforming growth factor-β1 and soluble intercellular adhesion molecule-1 level in patients with stroke
WANG Gang HUANG Jianqun
(Emergency Department, First Clinical Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China)
【Abstract】 Objective To probe into the significance of the change of the level of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and soluble intercellular adhesion molecule-1(sICAM-1) in sera of patients with stroke. Methods The level of TGF-β1 and sICAM-1 in sera of patients with stroke was detected. Results The level of TGF-β1 in patients with cerebral bleeding is much lower than that in a control group(P<0.01), while the level of sICAM-1 in these patients is much higher than that of in the control group(P<0.01). The level of TGF-β1 in patients with cerebral infarction is not different with that of in the control group, but the level of sICAM-1 in these patients is much higher than that of in the control group(P<0.01). Conclusions TGF-β1 can protect brain tissue, so the low level of TGF-β1 after stroke may enhance the damage of brain tissue; sICAM-1 is an inflammatory damaging factor, the high level of sICAM-1 in patients with stroke shows that it has damaging effect on the brain tissue. The effects of these two factors may probably be utilized to guide clinical therapy.
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【Key words】 Cerebrovascular disorders; Transforming growth factor beta; Soluble intercellular adhesion molecule
脑卒中后，伴随着缺血性脑损伤，其损伤机制有兴奋性细胞毒作用，细胞内钙负荷超载，蛋白质合成受抑制，自由基损伤及局部免疫反应等。中枢神经系统曾被认为是“免疫特区”。但近20多年来的研究发现，脑缺血后多种免疫细胞、细胞因子和抗体均参与免疫调节。我们对脑卒中患者外周血转化生长因子(TGF-β1)及细胞黏附因子(sICAM-1)水平进行检测，以探讨两者对卒中后脑损伤的影响。
资料与方法
1. 血清来源：病例组：经临床证实为脑出血的患者30例，男15例，女15例，年龄55～68岁，平均61 岁。脑血栓患者30例，男15例，女15例，年龄57～70岁，平均62岁。对照组：正常对照来自健康献血员30例，男15例，女15例，年龄35～44岁，平均40岁。
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2.血清标本制备：外周静脉血3 ml, 分离血清，-20℃保存。
3.检测方法：双抗体夹心ELISA法。深圳晶英生物公司提供(英国产) TGF-β检测：试剂盒说明书操作。大致步骤：(1) TGF-β1标准品活化，按说明书用样品稀释液440 μl加TGF-β1标品(20 μl)并加1 mol/L HCl 20 μl，混合后于2～8℃孵育60 min，再加20 μl 1 mol/L NaOH 中和，即为活化的标品；(2)样品及正常人血清活化：步骤同上； (3)加板：①将标品及样品(正常人及病人)加入96孔板100 μl/孔，37℃，孵育1h，洗涤，共5次； ② 加TGF-β1结合物100 μl/孔，37℃孵育1 h，洗涤5次； ③ 加底物100 μl/孔，20 min，加终止液，于450 nm处测吸光度(A)； ④ 以标准品绘标准曲线。sICAM-1检测：按Immunotech(法国)试剂盒说明书操作。大致步骤：(1) 第一步化学反应：① 第一孔为底物空白；② 以100 μl/孔加标准品，对照及样品，50 μl/孔生物素抗体；③ 18～25℃孵育1 h；④ 加100 μl/孔TMB底物，包括底物空白孔，避光，室温，孵育20 min；⑤加100 μl/孔终止液于各孔，于450 nm波长读A；⑥ 以标准品绘制标准曲线。
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结果
1.脑出血患者外周血 TGF-β1及sICAM-1的检测结果：按前述方法测得脑出血患者外周血 TGF-β1水平为(17±2) μg/L，正常人为(37±5) μg/L，SICAM-1水平为(547±80) μg/L,正常人为(248±54) μg/L。经统计学处理，脑出血患者外周血TGF-β1水平低于正常人，且差异有显著性(P<0.01)；脑出血患者外周血sICAM-1水平高于正常人，差异有显著性(P<0.01)。
2. 脑血栓患者外周血TGF-β1及sICAM-1的检测结果：用上述方法测得脑血栓患者外周血TGF-β1水平为(25±4) μg/L，正常人(37±5) μg/L, sICAM-1为(545±81) μg/L，正常人为(248±54) μg/L。
3. 统计学处理结果：脑血栓患者外周血TGF-β1水平看似低于正常人，但差异无显著性(P>0.05)。sICAM-1水平高于正常人，且差异有显著性(P<0.01)。
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讨论
TGF-β1是一种调节细胞生长和分化的多肽，其主要生物学作用涉及二个方面。一是免疫抑制功能，抑制T细胞和B细胞及肿瘤杀伤( NK)细胞的活性；二是促炎症分子，能促进免疫介导的炎症反应造成的组织损伤。但在卒中病人的发病过程中，其作用尚处于研究之中。
本研究结果显示TGF-β1血清水平在脑出血患者中明显低于正常人，这与许多研究结果相似[1-3]，但在脑血栓患者中TGF-β1血清水平与正常人无差异。Kim等[3]实验研究结果在脑血栓患者中TGF-β1血清水平也低于正常人，但他们入选的病人经CT、MRI证实为大面积脑梗死。而我们对脑血栓患者入选标准为经CT、MRI证实为脑血栓，并未限于大面积。
国外学者用大鼠做动物模型，造成脑缺血后，投给极低剂量的TGF-β1，发现其具有降低脑缺血所致海马角神经元损伤的作用，并能减小大鼠和家兔脑缺血模型的梗死面积，并证实TGF-β1能促进卒中后微血管增生。这就是说TGF-β1对脑缺血造成的脑损伤有保护作用。还有的学者实验研究认为免疫调节性细胞素TGF-β1在脑卒中病人中的减少可能反映了脑卒中后细胞素网络的一种炎症前状态，这可能提示这种细胞素在炎症环境中过多地被利用或聚集在炎症组织中[4]。 我们的研究结果表明，脑出血患者外周血的TGF-β1水平明显低于正常人(P<0.01)。脑血栓患者外周血TGF-β1水平与正常人无差异。从TGF-β1的保护作用看，提示脑出血病人的组织损伤较脑血栓更严重和广泛，这也说明卒中后低水平的TGF-β1可反映脑组织的损伤，但它是否可反映脑卒中脑组织损伤的程度，有待进一步研究。
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另一细胞因子sICAM-1则存在于炎症部位的多种细胞表面，如血管内皮细胞，各种上皮细胞，单核巨噬细胞和淋巴细胞。sICAM-1具有很多生物学作用。近年来研究表明，sICAM-1与脑缺血后的再灌注损伤有密切联系[4]。感染可诱发缺血性脑血管病，这主要与炎症后中性粒细胞增多，血液黏稠度增高有关。而炎症细胞可产生大量sICAM-1。sICAM-1又介导上皮与淋巴细胞间的黏附；介导与单核巨噬细胞，中性粒细胞的黏附。这样，中性粒细胞在局灶区血管内聚集。阻塞微血管形成无返流现象(no-reflow phenomenon)，即虽然缺血局部血流重新开放，缺血区并不能得到充分的灌注。因此，脑缺血后sICAM-1水平增高可加重脑损伤。此外，Fassbend等[5]发现有卒中危险因素(高血压、吸烟、糖尿病及高胆固醇)的非卒中者及急性脑梗死患者血中sICAM-1含量较健康者高。这也与我们的检测结果吻合。Hess等[6]研究发现，脑血管内皮细胞缺氧后再供氧可增加其sICAM-1的表达，抗自由基物质乙酰半胱氨酸可阻止ICAM-1的表达，提示其ICAM-1上调与自由基产生有关。
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从以上分析我们可知：对卒中后的脑损伤，TGF-β1具有保护作用，则sICAM-1为损伤作用。因此，我们也许可利用两者的作用对临床治疗给予指导。国外许多学者对脑缺血或脑梗死后的动物给予抗sICAM-1的抗体进行治疗，所得结果并不一致[7-9]。而TGF-β1的保护作用也仅限于动物实验。这需要我们在许多方面做进一步研究。
参考文献
1，Henrich-Noack P, Prehn JH, Krieglstein J. TGF-beta 1 protects hippocampal neurons against degeneration caused by transient global ischemia. Dose-response relationship and potential neuroprotective mechanisms. Stroke,1996,27:1609-1615.
, 百拇医药
2，Krupinski J, Kumar P ,Kumar S , et al. Increased expression of TGF-beta 1 in brain tissue after ischemic stroke in humans. Stroke, 1996,27: 852-857.
3，Kim JS, Yoon SS, Kim YH, et al. Serial measurement of interleukin- 6, transforming growth factor-beta, and S-100 protein in patients with acute stroke. Stroke, 1996,27:1553-1557.
4，Heufelder AE, Bahn RS. Soluble intercellular adhesion molecule-1(sICAM-1) in sera of patients with Grave′s ophthalmopathy and thyroid diseases. Clin Exp Immunol,1993,92:296-302.
, http://www.100md.com
5，Fassbend K, Mossner R, Motsch L, et al. Circulating selectin- and immunoglobulin-type adhesion molecules in acute ischemic stroke. Stoke, 1995,26:1361-1364.
6，Hess DC, Zhai W, Carroll J, et al. Increased expression of ICAM-1 during reoxygenation in brain endothelial cells. Stroke, 1994,25:1463-1468.
7，Mori E, del Zoppo GJ, Chambers JD, et al. Inhibition of polymorphonuclear leukocyte adherence suppresses no-reflow after focal cerebral ischemia in baboons. Stroke, 1992,23:712-718.
, http://www.100md.com
8，Bowes MP, Zivin SA, Rothlein R, et al. Monoclonal antibody to the ICAM-1 adhesion site reduces neurological damage in a rabbit cerebral embolism stroke model. Exp Neurol,1993,119:215-219.
9，Takeshima R, Kirsch JR, Koehler RC, et al. Monoclonal leukocyte antibody does not decrease the injury of transient focal cerebral ischemia in cats. Stroke, 1992,23:247-252.
(收稿日期：1999-10-29), http://www.100md.com
单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院急诊科
关键词：脑血管意外；转化生长因子β；细胞间黏附因子
中华内科杂志000506 【摘要】 目的 探讨脑卒中患者外周血转化生长因子(TGF-β1)和细胞黏附因子(sICAM-1)水平的变化并对其进行分析。方法 对脑卒中患者(脑出血30例，脑血栓30例)外周血TGF-β1和sICAM-1水平进行检测。结果 脑出血患者外周血TGF-β1的水平明显低于对照组(P<0.01)，而sICAM-1水平明显高于对照组(P<0.01)；脑血栓患者外周血TGF-β1水平与对照组差异无显著性，而sICAM-1水平明显高于对照组(P<0.01)。 结论 TGF-β1具有保护脑组织作用，卒中后低水平的TGF-β1可加重脑损伤；sICAM-1是一种损伤性炎症因子，卒中病人高水平的sICAM-1表明其具有损伤作用。
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The change of transforming growth factor-β1 and soluble intercellular adhesion molecule-1 level in patients with stroke
WANG Gang HUANG Jianqun
(Emergency Department, First Clinical Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China)
【Abstract】 Objective To probe into the significance of the change of the level of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and soluble intercellular adhesion molecule-1(sICAM-1) in sera of patients with stroke. Methods The level of TGF-β1 and sICAM-1 in sera of patients with stroke was detected. Results The level of TGF-β1 in patients with cerebral bleeding is much lower than that in a control group(P<0.01), while the level of sICAM-1 in these patients is much higher than that of in the control group(P<0.01). The level of TGF-β1 in patients with cerebral infarction is not different with that of in the control group, but the level of sICAM-1 in these patients is much higher than that of in the control group(P<0.01). Conclusions TGF-β1 can protect brain tissue, so the low level of TGF-β1 after stroke may enhance the damage of brain tissue; sICAM-1 is an inflammatory damaging factor, the high level of sICAM-1 in patients with stroke shows that it has damaging effect on the brain tissue. The effects of these two factors may probably be utilized to guide clinical therapy.
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【Key words】 Cerebrovascular disorders; Transforming growth factor beta; Soluble intercellular adhesion molecule
脑卒中后，伴随着缺血性脑损伤，其损伤机制有兴奋性细胞毒作用，细胞内钙负荷超载，蛋白质合成受抑制，自由基损伤及局部免疫反应等。中枢神经系统曾被认为是“免疫特区”。但近20多年来的研究发现，脑缺血后多种免疫细胞、细胞因子和抗体均参与免疫调节。我们对脑卒中患者外周血转化生长因子(TGF-β1)及细胞黏附因子(sICAM-1)水平进行检测，以探讨两者对卒中后脑损伤的影响。
资料与方法
1. 血清来源：病例组：经临床证实为脑出血的患者30例，男15例，女15例，年龄55～68岁，平均61 岁。脑血栓患者30例，男15例，女15例，年龄57～70岁，平均62岁。对照组：正常对照来自健康献血员30例，男15例，女15例，年龄35～44岁，平均40岁。
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2.血清标本制备：外周静脉血3 ml, 分离血清，-20℃保存。
3.检测方法：双抗体夹心ELISA法。深圳晶英生物公司提供(英国产) TGF-β检测：试剂盒说明书操作。大致步骤：(1) TGF-β1标准品活化，按说明书用样品稀释液440 μl加TGF-β1标品(20 μl)并加1 mol/L HCl 20 μl，混合后于2～8℃孵育60 min，再加20 μl 1 mol/L NaOH 中和，即为活化的标品；(2)样品及正常人血清活化：步骤同上； (3)加板：①将标品及样品(正常人及病人)加入96孔板100 μl/孔，37℃，孵育1h，洗涤，共5次； ② 加TGF-β1结合物100 μl/孔，37℃孵育1 h，洗涤5次； ③ 加底物100 μl/孔，20 min，加终止液，于450 nm处测吸光度(A)； ④ 以标准品绘标准曲线。sICAM-1检测：按Immunotech(法国)试剂盒说明书操作。大致步骤：(1) 第一步化学反应：① 第一孔为底物空白；② 以100 μl/孔加标准品，对照及样品，50 μl/孔生物素抗体；③ 18～25℃孵育1 h；④ 加100 μl/孔TMB底物，包括底物空白孔，避光，室温，孵育20 min；⑤加100 μl/孔终止液于各孔，于450 nm波长读A；⑥ 以标准品绘制标准曲线。
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结果
1.脑出血患者外周血 TGF-β1及sICAM-1的检测结果：按前述方法测得脑出血患者外周血 TGF-β1水平为(17±2) μg/L，正常人为(37±5) μg/L，SICAM-1水平为(547±80) μg/L,正常人为(248±54) μg/L。经统计学处理，脑出血患者外周血TGF-β1水平低于正常人，且差异有显著性(P<0.01)；脑出血患者外周血sICAM-1水平高于正常人，差异有显著性(P<0.01)。
2. 脑血栓患者外周血TGF-β1及sICAM-1的检测结果：用上述方法测得脑血栓患者外周血TGF-β1水平为(25±4) μg/L，正常人(37±5) μg/L, sICAM-1为(545±81) μg/L，正常人为(248±54) μg/L。
3. 统计学处理结果：脑血栓患者外周血TGF-β1水平看似低于正常人，但差异无显著性(P>0.05)。sICAM-1水平高于正常人，且差异有显著性(P<0.01)。
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讨论
TGF-β1是一种调节细胞生长和分化的多肽，其主要生物学作用涉及二个方面。一是免疫抑制功能，抑制T细胞和B细胞及肿瘤杀伤( NK)细胞的活性；二是促炎症分子，能促进免疫介导的炎症反应造成的组织损伤。但在卒中病人的发病过程中，其作用尚处于研究之中。
本研究结果显示TGF-β1血清水平在脑出血患者中明显低于正常人，这与许多研究结果相似[1-3]，但在脑血栓患者中TGF-β1血清水平与正常人无差异。Kim等[3]实验研究结果在脑血栓患者中TGF-β1血清水平也低于正常人，但他们入选的病人经CT、MRI证实为大面积脑梗死。而我们对脑血栓患者入选标准为经CT、MRI证实为脑血栓，并未限于大面积。
国外学者用大鼠做动物模型，造成脑缺血后，投给极低剂量的TGF-β1，发现其具有降低脑缺血所致海马角神经元损伤的作用，并能减小大鼠和家兔脑缺血模型的梗死面积，并证实TGF-β1能促进卒中后微血管增生。这就是说TGF-β1对脑缺血造成的脑损伤有保护作用。还有的学者实验研究认为免疫调节性细胞素TGF-β1在脑卒中病人中的减少可能反映了脑卒中后细胞素网络的一种炎症前状态，这可能提示这种细胞素在炎症环境中过多地被利用或聚集在炎症组织中[4]。 我们的研究结果表明，脑出血患者外周血的TGF-β1水平明显低于正常人(P<0.01)。脑血栓患者外周血TGF-β1水平与正常人无差异。从TGF-β1的保护作用看，提示脑出血病人的组织损伤较脑血栓更严重和广泛，这也说明卒中后低水平的TGF-β1可反映脑组织的损伤，但它是否可反映脑卒中脑组织损伤的程度，有待进一步研究。
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另一细胞因子sICAM-1则存在于炎症部位的多种细胞表面，如血管内皮细胞，各种上皮细胞，单核巨噬细胞和淋巴细胞。sICAM-1具有很多生物学作用。近年来研究表明，sICAM-1与脑缺血后的再灌注损伤有密切联系[4]。感染可诱发缺血性脑血管病，这主要与炎症后中性粒细胞增多，血液黏稠度增高有关。而炎症细胞可产生大量sICAM-1。sICAM-1又介导上皮与淋巴细胞间的黏附；介导与单核巨噬细胞，中性粒细胞的黏附。这样，中性粒细胞在局灶区血管内聚集。阻塞微血管形成无返流现象(no-reflow phenomenon)，即虽然缺血局部血流重新开放，缺血区并不能得到充分的灌注。因此，脑缺血后sICAM-1水平增高可加重脑损伤。此外，Fassbend等[5]发现有卒中危险因素(高血压、吸烟、糖尿病及高胆固醇)的非卒中者及急性脑梗死患者血中sICAM-1含量较健康者高。这也与我们的检测结果吻合。Hess等[6]研究发现，脑血管内皮细胞缺氧后再供氧可增加其sICAM-1的表达，抗自由基物质乙酰半胱氨酸可阻止ICAM-1的表达，提示其ICAM-1上调与自由基产生有关。
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从以上分析我们可知：对卒中后的脑损伤，TGF-β1具有保护作用，则sICAM-1为损伤作用。因此，我们也许可利用两者的作用对临床治疗给予指导。国外许多学者对脑缺血或脑梗死后的动物给予抗sICAM-1的抗体进行治疗，所得结果并不一致[7-9]。而TGF-β1的保护作用也仅限于动物实验。这需要我们在许多方面做进一步研究。
参考文献
1，Henrich-Noack P, Prehn JH, Krieglstein J. TGF-beta 1 protects hippocampal neurons against degeneration caused by transient global ischemia. Dose-response relationship and potential neuroprotective mechanisms. Stroke,1996,27:1609-1615.
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2，Krupinski J, Kumar P ,Kumar S , et al. Increased expression of TGF-beta 1 in brain tissue after ischemic stroke in humans. Stroke, 1996,27: 852-857.
3，Kim JS, Yoon SS, Kim YH, et al. Serial measurement of interleukin- 6, transforming growth factor-beta, and S-100 protein in patients with acute stroke. Stroke, 1996,27:1553-1557.
4，Heufelder AE, Bahn RS. Soluble intercellular adhesion molecule-1(sICAM-1) in sera of patients with Grave′s ophthalmopathy and thyroid diseases. Clin Exp Immunol,1993,92:296-302.
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5，Fassbend K, Mossner R, Motsch L, et al. Circulating selectin- and immunoglobulin-type adhesion molecules in acute ischemic stroke. Stoke, 1995,26:1361-1364.
6，Hess DC, Zhai W, Carroll J, et al. Increased expression of ICAM-1 during reoxygenation in brain endothelial cells. Stroke, 1994,25:1463-1468.
7，Mori E, del Zoppo GJ, Chambers JD, et al. Inhibition of polymorphonuclear leukocyte adherence suppresses no-reflow after focal cerebral ischemia in baboons. Stroke, 1992,23:712-718.
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8，Bowes MP, Zivin SA, Rothlein R, et al. Monoclonal antibody to the ICAM-1 adhesion site reduces neurological damage in a rabbit cerebral embolism stroke model. Exp Neurol,1993,119:215-219.
9，Takeshima R, Kirsch JR, Koehler RC, et al. Monoclonal leukocyte antibody does not decrease the injury of transient focal cerebral ischemia in cats. Stroke, 1992,23:247-252.
(收稿日期：1999-10-29), http://www.100md.com