幽门螺杆菌感染时胃黏膜一氧化氮合酶基因异常表达与细胞凋亡
作者：李子俊 陈颜芳 林秋雄 王启仪 詹德娟 符永恒 刘婉薇
单位：510080 广州，广东省人民医院消化内科
关键词：
中华内科杂志000618 幽门螺杆菌(Hp)是胃癌发生的高危因素之一，究其机制尚不清楚。一氧化氮(NO)是机体内的一种特殊效应分子，具有第二信使分子和靶细胞毒功能。当NO过量产生可诱发基因突变、细胞凋亡或肿瘤的发生[1]。本研究旨在探讨Hp感染状态下胃黏膜组织内一氧化氮合酶(NOS)基因表达、NO含量改变与细胞凋亡增殖变化的意义。
一、对象与方法
1.对象：经胃镜及病理证实为慢性活动性胃炎患者28例，其中Hp感染阳性16例，年龄24～64岁；Hp阴性12例，年龄19～56岁。正常对照组8例。内镜下于胃窦大和小弯侧、前和后壁分别活检2～3块黏膜组织行Hp病理检查及生化、分子生物学检测。Hp感染阳性组采用奥美拉唑加阿莫西林及灭滴灵正规治疗2周，停药1个月后复查内镜及Hp。
, http://www.100md.com
2.方法：(1)病理及Hp检测：慢性胃炎的诊断采用悉尼胃炎分级标准[2]，每级3分，累积计算每例病人胃黏膜炎症组织的病理积分数。Hp检测采用病理Warthin-Starry银染色法及快速尿素酶试验，2项均阳性为阳性，单项阳性退出试验。(2)NO代谢产物(NO2-)检测：采用Griess等[3]介绍的方法。试剂盒由北京军事医学科学院生产。(3)NOS基因表达检测：采用Qiagen公司RNA抽提试剂盒及Promega公司的反转录试剂盒，抽提胃黏膜组织总RNA并逆转为cDNA和PCR扩增。PCR引物序列有3套，①诱导型(iNOS)上游引物:5′-TCACGCTTGGGTCTTFTTCACT-3′,下游引物5′-TTGTCTCTGG-GTCCTCTGGTCA-3′；② 结构型(cNOS)上游引物:5′-GGTGAATCCATACCAGCCTGATCCATGGAACAC-3′,下游引物为5′-TACTCGAAACGCCAGTCCTTCTTCTTCGAATGG-3′ ；③β-actin上游引物:5′-CAGCCGCCACCATTTCGCCA-3′,下游引物:5′-CAGGTCCCGGCCAGCCAGGT-3′ 。iNOS、cNOS、β-actin 的PCR特异性条带分别为450 bp、661 bp、534 bp。结果用Molcular Analyst软件包进行容积定量分析。(4)细胞凋亡分析及增殖细胞核抗原(PCNA)检测：采用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记方法(TUNEL)检测凋亡细胞，凋亡试剂盒由德国Bochringer Nannheim公司生产。 用PCNA单克隆抗体进行免疫LSAB组化染色。抗体和LSAB试剂盒购自美国DAKO公司。
, 百拇医药
3.统计学处理：采用t检验或校正t′检验以及线性相关分析。
二、结果
1.Hp感染时胃黏膜组织NO2-水平及NOS基因表达：见表1。
表1 Hp感染者胃黏膜组织NO2水平及NOS
基因表达(
±s) 组别
例数
胃炎积分
NO2-(μg/g)
, 百拇医药
iNOS/actin
cNOS/actin
对照组
8
4.78±1.63
0.340±0.171
Hp(+)
16
6.7±2.2
246.74±48.25##
0.812±0.248
0.415±0.216*
, 百拇医药
Hp(-)
12
5.8±2.0△
64.56±21.40**
0.344±0.140**
0.321±0.527△
注：**与Hp(+)组比较，##与对照组比较，P值均<0.01；△与Hp(+)组比较，P>0.05；与对照组比较，P>0.05
2.Hp感染时胃黏膜细胞凋亡和增殖变化：见表2。
, 百拇医药
表2 Hp感染时胃黏膜细胞凋亡和增殖变化(%，±s) 组别
例数
凋亡指数
PCNA指数
Hp(-)
12
4.26±1.54
8.82±2.76
Hp(+)
16
12.48±4.51*
, 百拇医药
20.21±4.79*
注：*与Hp(-)组比较，P<0.01
3.根除Hp后胃黏膜组织内iNOS mRNA表达、NO2-水平及细胞凋亡指数变化：见表3。iNOS mRNA表达水平和NO2-水平分别与细胞凋亡指数变化呈正相关，r=0. 734和0.902， P<0.05。
表3 根除Hp前后组织内iNOS mRNA表达、NO2水平及细胞凋亡变化(10例) 检测指标
根除前
根除后
凋亡指数(%，±s)
, 百拇医药
14.26±6.23
3.16±1.67*
iNOS/actin
0.75±0.16
0.40±0.11*
NO2水平(μg/g)
269.13±37.84
89.42±21.39*
注：*与根除前比较，P<0.01 讨论 NOS是NO产生的限速因素，影响NO的生成量和生物效应。NOS分cNOS和iNOS 2大类。这些不同型NOS基因的定位结构、表达蛋白质和作用也不尽相同[2]。通常生理浓度NO(pmol或fmol水平)参与信息传递和细胞保护作用。而过量的NO(nmol水平)见于病理刺激和炎症反应时，iNOS mRNA过表达，持久产生大量NO、羟自由基和亚硝酸盐等，引起DNA链断裂、基因突变甚至致癌[4]。
, 百拇医药
本研究结果证实，正常人胃黏膜组织内仅cNOS mRNA低表达，产生少量NO，而iNOS mRNA未检测到表达。说明在正常生理条件下，低浓度NO主要来源于cNOS，可能与胃黏膜的生理功能及其黏膜防御有关。当Hp感染时，iNOS mRNA表达水平及NO水平显著升高，根除Hp后，上述指标恢复，与治疗前比较差异有显著性(P<0.01)。该结果提示NO可能参于Hp感染引起胃黏膜损伤的过程[2]。
胃黏膜上皮细胞凋亡和增殖的不平衡是胃肿瘤发生的重要病理基础[5]。我们发现Hp感染时胃黏膜上皮细胞凋亡和增殖指数均增加明显，与Hp阴性组比较差异有显著性。根除Hp后，细胞凋亡指数降低，同时iNOS mRNA表达和NO2-水平也显著降低。细胞凋亡指数与iNOS mRNA表达和NO2-水平呈正相关(r=0.734和0.902，P<0.05)。说明Hp感染时，产生过量NO与胃黏膜细胞凋亡增加有关，特别是腺上皮细胞凋亡，导致腺体的萎缩，酸和胃蛋白酶分泌减少，则有利于亚硝胺类致癌物形成和重要胃癌前病变的发生和发展[1,5]。考虑到Hp感染引起胃黏膜炎症反应常呈慢性持续状态，因此胃黏膜内NO持续大量生成，其在Hp相关性胃病发病中的作用应不宜忽视。
, 百拇医药
参考文献
1，Ohshima H， Bartsch H. Chronic infections and inflammatory processes as cancer risk factors: possible role of nitric oxide in carcinogensis. Mutat Res , 1994,305: 253-264.
2，Rachmilewitz D, Kameli F, Eliakim R, et al. Enhanced gastric nitric oxide synthase activity in duodenal ulcer patients. Gut,1994,35:1394-1397.
3，Griess LC, Wanger DA, Glogowski J, et al . Analysis of nitrate nitrite and [15 N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem, 1982,126:131-138.
4，藏梦维，刘景生.一氧化氮的致突变性和致癌性.国外医学生理病理科学与临床分册, 1998，18(1): 37-40.
5，Hahm KB, LEE KT, Kim JH, et al. Helicobacter pylori infection, oxidative DNA damage, gastric carcinogenesis, and reversibility by rebamipide. Dig Dis Sci,1998,43 (9 Suppl):72S-77S.
(收稿日期：1999-08-19), http://www.100md.com
单位：510080 广州，广东省人民医院消化内科
关键词：
中华内科杂志000618 幽门螺杆菌(Hp)是胃癌发生的高危因素之一，究其机制尚不清楚。一氧化氮(NO)是机体内的一种特殊效应分子，具有第二信使分子和靶细胞毒功能。当NO过量产生可诱发基因突变、细胞凋亡或肿瘤的发生[1]。本研究旨在探讨Hp感染状态下胃黏膜组织内一氧化氮合酶(NOS)基因表达、NO含量改变与细胞凋亡增殖变化的意义。
一、对象与方法
1.对象：经胃镜及病理证实为慢性活动性胃炎患者28例，其中Hp感染阳性16例，年龄24～64岁；Hp阴性12例，年龄19～56岁。正常对照组8例。内镜下于胃窦大和小弯侧、前和后壁分别活检2～3块黏膜组织行Hp病理检查及生化、分子生物学检测。Hp感染阳性组采用奥美拉唑加阿莫西林及灭滴灵正规治疗2周，停药1个月后复查内镜及Hp。
, http://www.100md.com
2.方法：(1)病理及Hp检测：慢性胃炎的诊断采用悉尼胃炎分级标准[2]，每级3分，累积计算每例病人胃黏膜炎症组织的病理积分数。Hp检测采用病理Warthin-Starry银染色法及快速尿素酶试验，2项均阳性为阳性，单项阳性退出试验。(2)NO代谢产物(NO2-)检测：采用Griess等[3]介绍的方法。试剂盒由北京军事医学科学院生产。(3)NOS基因表达检测：采用Qiagen公司RNA抽提试剂盒及Promega公司的反转录试剂盒，抽提胃黏膜组织总RNA并逆转为cDNA和PCR扩增。PCR引物序列有3套，①诱导型(iNOS)上游引物:5′-TCACGCTTGGGTCTTFTTCACT-3′,下游引物5′-TTGTCTCTGG-GTCCTCTGGTCA-3′；② 结构型(cNOS)上游引物:5′-GGTGAATCCATACCAGCCTGATCCATGGAACAC-3′,下游引物为5′-TACTCGAAACGCCAGTCCTTCTTCTTCGAATGG-3′ ；③β-actin上游引物:5′-CAGCCGCCACCATTTCGCCA-3′,下游引物:5′-CAGGTCCCGGCCAGCCAGGT-3′ 。iNOS、cNOS、β-actin 的PCR特异性条带分别为450 bp、661 bp、534 bp。结果用Molcular Analyst软件包进行容积定量分析。(4)细胞凋亡分析及增殖细胞核抗原(PCNA)检测：采用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记方法(TUNEL)检测凋亡细胞，凋亡试剂盒由德国Bochringer Nannheim公司生产。 用PCNA单克隆抗体进行免疫LSAB组化染色。抗体和LSAB试剂盒购自美国DAKO公司。
, 百拇医药
3.统计学处理：采用t检验或校正t′检验以及线性相关分析。
二、结果
1.Hp感染时胃黏膜组织NO2-水平及NOS基因表达：见表1。
表1 Hp感染者胃黏膜组织NO2水平及NOS
基因表达(
±s) 组别例数
胃炎积分
NO2-(μg/g)
, 百拇医药
iNOS/actin
cNOS/actin
对照组
8
4.78±1.63
0.340±0.171
Hp(+)
16
6.7±2.2
246.74±48.25##
0.812±0.248
0.415±0.216*
, 百拇医药
Hp(-)
12
5.8±2.0△
64.56±21.40**
0.344±0.140**
0.321±0.527△
注：**与Hp(+)组比较，##与对照组比较，P值均<0.01；△与Hp(+)组比较，P>0.05；与对照组比较，P>0.05
2.Hp感染时胃黏膜细胞凋亡和增殖变化：见表2。
, 百拇医药
表2 Hp感染时胃黏膜细胞凋亡和增殖变化(%，
±s) 组别例数
凋亡指数
PCNA指数
Hp(-)
12
4.26±1.54
8.82±2.76
Hp(+)
16
12.48±4.51*
, 百拇医药
20.21±4.79*
注：*与Hp(-)组比较，P<0.01
3.根除Hp后胃黏膜组织内iNOS mRNA表达、NO2-水平及细胞凋亡指数变化：见表3。iNOS mRNA表达水平和NO2-水平分别与细胞凋亡指数变化呈正相关，r=0. 734和0.902， P<0.05。
表3 根除Hp前后组织内iNOS mRNA表达、NO2水平及细胞凋亡变化(10例) 检测指标
根除前
根除后
凋亡指数(%，
±s), 百拇医药
14.26±6.23
3.16±1.67*
iNOS/actin
0.75±0.16
0.40±0.11*
NO2水平(μg/g)
269.13±37.84
89.42±21.39*
注：*与根除前比较，P<0.01 讨论 NOS是NO产生的限速因素，影响NO的生成量和生物效应。NOS分cNOS和iNOS 2大类。这些不同型NOS基因的定位结构、表达蛋白质和作用也不尽相同[2]。通常生理浓度NO(pmol或fmol水平)参与信息传递和细胞保护作用。而过量的NO(nmol水平)见于病理刺激和炎症反应时，iNOS mRNA过表达，持久产生大量NO、羟自由基和亚硝酸盐等，引起DNA链断裂、基因突变甚至致癌[4]。
, 百拇医药
本研究结果证实，正常人胃黏膜组织内仅cNOS mRNA低表达，产生少量NO，而iNOS mRNA未检测到表达。说明在正常生理条件下，低浓度NO主要来源于cNOS，可能与胃黏膜的生理功能及其黏膜防御有关。当Hp感染时，iNOS mRNA表达水平及NO水平显著升高，根除Hp后，上述指标恢复，与治疗前比较差异有显著性(P<0.01)。该结果提示NO可能参于Hp感染引起胃黏膜损伤的过程[2]。
胃黏膜上皮细胞凋亡和增殖的不平衡是胃肿瘤发生的重要病理基础[5]。我们发现Hp感染时胃黏膜上皮细胞凋亡和增殖指数均增加明显，与Hp阴性组比较差异有显著性。根除Hp后，细胞凋亡指数降低，同时iNOS mRNA表达和NO2-水平也显著降低。细胞凋亡指数与iNOS mRNA表达和NO2-水平呈正相关(r=0.734和0.902，P<0.05)。说明Hp感染时，产生过量NO与胃黏膜细胞凋亡增加有关，特别是腺上皮细胞凋亡，导致腺体的萎缩，酸和胃蛋白酶分泌减少，则有利于亚硝胺类致癌物形成和重要胃癌前病变的发生和发展[1,5]。考虑到Hp感染引起胃黏膜炎症反应常呈慢性持续状态，因此胃黏膜内NO持续大量生成，其在Hp相关性胃病发病中的作用应不宜忽视。
, 百拇医药
参考文献
1，Ohshima H， Bartsch H. Chronic infections and inflammatory processes as cancer risk factors: possible role of nitric oxide in carcinogensis. Mutat Res , 1994,305: 253-264.
2，Rachmilewitz D, Kameli F, Eliakim R, et al. Enhanced gastric nitric oxide synthase activity in duodenal ulcer patients. Gut,1994,35:1394-1397.
3，Griess LC, Wanger DA, Glogowski J, et al . Analysis of nitrate nitrite and [15 N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem, 1982,126:131-138.
4，藏梦维，刘景生.一氧化氮的致突变性和致癌性.国外医学生理病理科学与临床分册, 1998，18(1): 37-40.
5，Hahm KB, LEE KT, Kim JH, et al. Helicobacter pylori infection, oxidative DNA damage, gastric carcinogenesis, and reversibility by rebamipide. Dig Dis Sci,1998,43 (9 Suppl):72S-77S.
(收稿日期：1999-08-19), http://www.100md.com