一氧化氮合酶及其基因表达与肺动脉高压的关系
作者：王良兴 陈少贤 徐正介 喻林升 王群姬 谢于鹏 陈彦凡 王卫 张洪勤
单位：325000 浙江省温州医学院肺心病研究室， 附属第一医院呼吸科
关键词：
中华内科杂志000616 肺动脉高压是慢性阻塞性肺疾病(COPD)并发肺心病的中心环节，阐明其形成机制一直是防治COPD的重要研究课题。本实验采用慢性低氧高CO2性肺动脉高压大鼠模型，观察结构型和诱导型一氧化氮合酶及其基因表达的变化，探讨其在肺动脉高压形成中的作用。
1.材料与方法：(1) 动物模型的制备：雄性SD大鼠(温州医学院实验动物中心提供)20只，体重180～280g，随机分为 2组，每组10只。①A组：正常对照组，大鼠常压氧下饲养4周，室温15～20℃，相对湿度50%～70%。②B组：低氧高CO2组，大鼠置于常压低氧高CO2舱中(吸气氧浓度为8.5%～11.0%，CO2浓度为5.0%～6.5%)，每日10 h，其余时间同正常对照组，饲养4周。(2)平均肺动脉压(mPAP)和平均颈动脉压(mCAP)的测定：腹腔注射1%戊巴比妥钠全身麻醉，颈正中切口，颈外静脉插管至肺动脉并行颈总动脉插管，测mPAP和mCAP。(3)血清一氧化氮(NO)的测定：试剂盒购自伊利康生物技术有限公司，按说明书操作。(4)结构型一氧化氮合酶(cNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)免疫组化染色(SABC法)及观测 ：一抗为兔抗鼠cNOS、iNOS(美国Santa Cruz公司)，二抗及检测试剂盒为SABC工作液，DAB染色，苏木素套染，阳性结果呈棕黄色。每只大鼠选一张肺组织切片，每张切片随机选取直径约100～200 μm肺细小动脉5支，用图像分析仪心肺血管分析软件检测血管壁上的平均吸光度值(A)作为管壁cNOS和iNOS的相对含量。(5)原位杂交：放血处死大鼠，取出肺组织，10%缓冲甲醛固定，常规脱水，透明并石蜡包埋，连续切片，标本经二甲苯脱蜡至水，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化,滴加地高辛标记的cNOS、 iNOS寡核苷酸探针杂交,封闭，滴加小鼠抗地高辛,滴加生物素化羊抗小鼠IgG，滴加SABC，DAB显色，苏木素复染，阳性结果呈棕黄色。肺细小动脉管壁cNOS mRNA和iNOS mRNA相对含量的检测方法同cNOS和iNOS 。寡核苷酸探针采用地高辛标记的cNOS和iNOS多相寡核苷酸探针(购自武汉博士德生物工程有限公司)。cNOS寡核苷酸探针序列来源于人基因AI925269GI5661233-①121-155;②661-695；大鼠基因AJ011116 GI3676237③216-250。iNOS寡核苷酸探针序列来源于人基因AF051164GI2944098-①661-695;②1561-1595；③2821-2855;大鼠基因AF042085 GI3170236; ④3226-3250。 (6)统计学方法：采用SPSS软件进行组间 t检验，数据以
±s表示。
, http://www.100md.com
2.结果：两组mPAP、血清NO、肺动脉cNOS、iNOS及其基因表达：见表1。
表1 两组mPAP、血清NO、肺动脉cNOS、iNOS及其mRNA的表达(±s) 组别
鼠数
(只)
mPAP
(mm Hg)
NO
(μmol/L)
A
cNOS
, 百拇医药
iNOS
cNOS mRNA
iNOS mRNA
A组
8
14.4±1.7
110.0±20.3
0.231±0.030
0.139±0.025
0.091±0.008
0.096±0.016
B组
, 百拇医药
8
21.2±1.5
87.0± 5.4
0.157±0.017
0.223±0.027
0.051±0.017
0.112±0.017
t值
8.910
3.310
13.23
14.35
, 百拇医药
12.72
4.554
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：1 mm Hg=0.133 kPa 讨论 自从证实内皮细胞衍生舒张因子(EDRF)为NO以来，NO与肺动脉高压的关系受到了极大的重视[1,2]，以往报道的实验研究大多采用单纯缺氧性肺动脉高压动物模型。临床上COPD患者常导致低氧血症和CO2潴留，而高CO2在肺动脉高压形成中起着一定的作用[3]。因此，本实验采用慢性低氧高CO2性肺动脉高压动物模型研究NO和cNOS、iNOS及其基因表达的改变在慢性低氧高CO2性肺动脉高压形成中的作用。内源性NO是在一氧化氮合酶的作用下，以还原型辅酶Ⅱ为辅助因子，L-精氨酸与分子氧反应，脱去L-瓜氨酸而生成的，一氧化氮合酶是内源性NO生成的限速酶，在肺动脉上有cNOS和iNOS两种亚型。本实验发现，低氧高CO2抑制了cNOS及其基因在肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞中的表达，同时又诱导了肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞中iNOS及其基因的表达。前者可使内源性NO的合成和释放量减少，促进肺动脉高压的发生和发展；后者可使肺组织NO的合成和释放量增加，对肺动脉压发挥反馈抑制作用；两者变化的综合结果导致NO的合成减少，促进肺动脉高压的形成和肺血管结构的重建。
, 百拇医药
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(398530396479)；浙江省医药卫生优秀青年科技人才专项科研基金项目资助
参考文献
1，Steudel W, Scherrer-Crosbie M, Bloch KD, et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J Clin Invest, 1998,101:2468-2477.
2，Giaid A, Saleh D. Reduced expression of endothelial nitric oxide synthase in the lung of patients with pulmonary hypertension. N Engl J Med, 1995,333:214-219.
3，Myers JL, Domkowski PW ,Wang Y, et al. Sympathetic blockade blunts hypercapnic pulmonary arterial vasoconstriction in newborn piglets.Eur J Cardiothorac Surg, 1998,13:298-305.
(收稿日期：1999-12-06), 百拇医药
单位：325000 浙江省温州医学院肺心病研究室， 附属第一医院呼吸科
关键词：
中华内科杂志000616 肺动脉高压是慢性阻塞性肺疾病(COPD)并发肺心病的中心环节，阐明其形成机制一直是防治COPD的重要研究课题。本实验采用慢性低氧高CO2性肺动脉高压大鼠模型，观察结构型和诱导型一氧化氮合酶及其基因表达的变化，探讨其在肺动脉高压形成中的作用。
1.材料与方法：(1) 动物模型的制备：雄性SD大鼠(温州医学院实验动物中心提供)20只，体重180～280g，随机分为 2组，每组10只。①A组：正常对照组，大鼠常压氧下饲养4周，室温15～20℃，相对湿度50%～70%。②B组：低氧高CO2组，大鼠置于常压低氧高CO2舱中(吸气氧浓度为8.5%～11.0%，CO2浓度为5.0%～6.5%)，每日10 h，其余时间同正常对照组，饲养4周。(2)平均肺动脉压(mPAP)和平均颈动脉压(mCAP)的测定：腹腔注射1%戊巴比妥钠全身麻醉，颈正中切口，颈外静脉插管至肺动脉并行颈总动脉插管，测mPAP和mCAP。(3)血清一氧化氮(NO)的测定：试剂盒购自伊利康生物技术有限公司，按说明书操作。(4)结构型一氧化氮合酶(cNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)免疫组化染色(SABC法)及观测 ：一抗为兔抗鼠cNOS、iNOS(美国Santa Cruz公司)，二抗及检测试剂盒为SABC工作液，DAB染色，苏木素套染，阳性结果呈棕黄色。每只大鼠选一张肺组织切片，每张切片随机选取直径约100～200 μm肺细小动脉5支，用图像分析仪心肺血管分析软件检测血管壁上的平均吸光度值(A)作为管壁cNOS和iNOS的相对含量。(5)原位杂交：放血处死大鼠，取出肺组织，10%缓冲甲醛固定，常规脱水，透明并石蜡包埋，连续切片，标本经二甲苯脱蜡至水，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化,滴加地高辛标记的cNOS、 iNOS寡核苷酸探针杂交,封闭，滴加小鼠抗地高辛,滴加生物素化羊抗小鼠IgG，滴加SABC，DAB显色，苏木素复染，阳性结果呈棕黄色。肺细小动脉管壁cNOS mRNA和iNOS mRNA相对含量的检测方法同cNOS和iNOS 。寡核苷酸探针采用地高辛标记的cNOS和iNOS多相寡核苷酸探针(购自武汉博士德生物工程有限公司)。cNOS寡核苷酸探针序列来源于人基因AI925269GI5661233-①121-155;②661-695；大鼠基因AJ011116 GI3676237③216-250。iNOS寡核苷酸探针序列来源于人基因AF051164GI2944098-①661-695;②1561-1595；③2821-2855;大鼠基因AF042085 GI3170236; ④3226-3250。 (6)统计学方法：采用SPSS软件进行组间 t检验，数据以
±s表示。, http://www.100md.com
2.结果：两组mPAP、血清NO、肺动脉cNOS、iNOS及其基因表达：见表1。
表1 两组mPAP、血清NO、肺动脉cNOS、iNOS及其mRNA的表达(
±s) 组别鼠数
(只)
mPAP
(mm Hg)
NO
(μmol/L)
A
cNOS
, 百拇医药
iNOS
cNOS mRNA
iNOS mRNA
A组
8
14.4±1.7
110.0±20.3
0.231±0.030
0.139±0.025
0.091±0.008
0.096±0.016
B组
, 百拇医药
8
21.2±1.5
87.0± 5.4
0.157±0.017
0.223±0.027
0.051±0.017
0.112±0.017
t值
8.910
3.310
13.23
14.35
, 百拇医药
12.72
4.554
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：1 mm Hg=0.133 kPa 讨论 自从证实内皮细胞衍生舒张因子(EDRF)为NO以来，NO与肺动脉高压的关系受到了极大的重视[1,2]，以往报道的实验研究大多采用单纯缺氧性肺动脉高压动物模型。临床上COPD患者常导致低氧血症和CO2潴留，而高CO2在肺动脉高压形成中起着一定的作用[3]。因此，本实验采用慢性低氧高CO2性肺动脉高压动物模型研究NO和cNOS、iNOS及其基因表达的改变在慢性低氧高CO2性肺动脉高压形成中的作用。内源性NO是在一氧化氮合酶的作用下，以还原型辅酶Ⅱ为辅助因子，L-精氨酸与分子氧反应，脱去L-瓜氨酸而生成的，一氧化氮合酶是内源性NO生成的限速酶，在肺动脉上有cNOS和iNOS两种亚型。本实验发现，低氧高CO2抑制了cNOS及其基因在肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞中的表达，同时又诱导了肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞中iNOS及其基因的表达。前者可使内源性NO的合成和释放量减少，促进肺动脉高压的发生和发展；后者可使肺组织NO的合成和释放量增加，对肺动脉压发挥反馈抑制作用；两者变化的综合结果导致NO的合成减少，促进肺动脉高压的形成和肺血管结构的重建。
, 百拇医药
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(398530396479)；浙江省医药卫生优秀青年科技人才专项科研基金项目资助
参考文献
1，Steudel W, Scherrer-Crosbie M, Bloch KD, et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J Clin Invest, 1998,101:2468-2477.
2，Giaid A, Saleh D. Reduced expression of endothelial nitric oxide synthase in the lung of patients with pulmonary hypertension. N Engl J Med, 1995,333:214-219.
3，Myers JL, Domkowski PW ,Wang Y, et al. Sympathetic blockade blunts hypercapnic pulmonary arterial vasoconstriction in newborn piglets.Eur J Cardiothorac Surg, 1998,13:298-305.
(收稿日期：1999-12-06), 百拇医药