细胞间黏附分子-1在抗原引起气道炎症和高反应性中的应用
作者：吴聪 施焕中 龙学明 谢正福 许辉
单位：广西医科大学第一附属医院呼吸内科 南宁，530021
关键词：
中华内科杂志000715 我们以前的研究表明，过敏性支气管哮喘患者血清可溶性细胞间黏附分子-1(ICAM-1)水平明显增高，并与哮喘病情密切相关[1]。在哮喘发病机制中发挥重要作用的白细胞介素(IL)-5，经雾化吸入后可刺激气道局部产生大量的可溶性ICAM-1[2]。本研究进一步探讨抗ICAM-1单克隆抗体对抗原引起的气道炎症和气道高反应性的影响。
一、 材料与方法
1. 48只6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组12只。A组为阳性组对照组，参照我们以前报道的方法[3]用鸡卵清白蛋白(OVA)致敏和刺激小鼠，诱发气道嗜酸粒细胞(Eos)性炎症和气道高反应性；B组为阴性对照组，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替OVA作腹腔注射和雾化吸入；C组和D组分别为抗ICAM-1单抗处理组和IgG对照组，于OVA刺激前分别经尾静脉注射100 μg抗ICAM-1单抗或仓鼠同类IgG1(均购自美国Pharmingen公司)。
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2. 每组有6只小鼠于处死前40min腹腔注射总量为4 mg 5-溴脱氧尿核苷(BrdU，购自美国Sigma公司)，用于检测肺组织T淋巴细胞增殖过程中消耗BrdU所合成DNA 的量，即体内增殖反应。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，并计数BALF中的Eos。取BALF中其余的细胞用流式细胞仪检测ICAM-1的表达。
3.收集BALF后，取出小鼠肺脏，剪成碎片，以DNA酶-1和胶原酶酶裂解制成单细胞悬液，流经SephadexG-10柱去除巨噬细胞等黏附性细胞，然后用美国Miltenyi Biotec公司生产的MACS分离柱纯化出T淋巴细胞。T淋巴细胞经酸处理后与荧光素标记的抗BrdU单抗孵化后,以流式细胞仪分析T淋巴细胞中结合BrdU的细胞百分数。
4. 各组其余6只小鼠麻醉后置于体积描计盒中，用小导管将气管和啮齿动物呼吸机相连接，并给予频率为120次/min，潮气量为0.4 ml的机械通气。肌肉注射氯化筒箭毒碱阻断小鼠自主呼吸后连续记录呼吸阻力。给小鼠自低浓度至高浓度雾化吸入乙酰胆碱溶液直至呼吸阻力增加达到或超过50%以上，最后计算引起气道阻力增加50%时所吸入乙酰胆碱的浓度(PC50)，以此表示气道反应性。
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5. 测定气道反应性后取肺组织制成组织匀浆悬液，收集上清液冻存于-80℃待测其中IL-4和IL-5含量。IL-4和IL-5含量测定采用酶联免疫吸附测定法，试剂盒购自美国Endogen公司，最终结果以pg/g肺组织表示。
6. 统计学方法：所有数据以
±s表示，结果比较采用t检验、方差分析和q检验。
二、 结果
1. B组BALF中的细胞虽然也表达ICAM-1(平均荧光密度为12.5±3.2)，但明显低于A组(平均荧光密度为44.2±9.4；t=7.84，P<0.01) 。
2. 抗 ICAM-1单抗对Eos数、PC50值、BrdU阳性的T淋巴细胞百分数和细胞因子水平的影响见表1。
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讨论 从本研究中发现，抗原致敏和刺激可以使BALF中的细胞 ICAM-1表达增加。B组小鼠BALF中未见到Eos，A组则见到大量的Eos出现于BALF中，气道反应性也随之升高。当致敏小鼠接受抗ICAM-1单抗静脉注射后，BALF中的Eos数下降了63%；与此同时，PC50也升高64%。说明抗ICAM-1单抗可以抑制Eos浸润致敏小鼠的气道，并降低气道高反应性。
表1 抗 ICAM-1单抗对Eos数、气道反应性、肺组织
T淋巴细胞增殖能力和细胞因子水平的影响(±s) 组别
鼠数(只)
Eos数
(×108/L)
, 百拇医药
PC50值
BrdU阳性
的T淋巴
细胞百分
数(%)
IL-4
(pg/g)
IL-5
(pg/g)
A组
6
9.4±
1.4
, 百拇医药
0.21±
0.09
15.7±
1.2
391.3±
61.3
194.1±
27.7
B组
6
0
0.69±
0.12*
, 百拇医药
4.4±
0.5*
182.6±
49.7*
35.2±
8.2*
C组
6
3.5±
1.0*
0.58±
0.14*
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7.2±
0.9*
244.1±
56.6*
88.5±
15.0*
D组
6
9.2±
1.2
0.23±
0.11
, 百拇医药
14.9±
1.5
395.2±
58.0
191.5±
30.8
注：与A组比较，*P<0.01
T淋巴细胞的活化和增殖需要两类性质不同的信号，第一信号来自T淋巴细胞受体和抗原呈递细胞(APC)表面的主要组织相溶性复合体分子在抗原存在时相互作用的复合体；第二信号即为APC所提供的协同刺激信号。早有报道，表达于APC表面的ICAM-1就可以作为协同刺激信号。我们发现，当应用抗ICAM-1单抗封闭小鼠体内ICAM-1后，肺T淋巴细胞的增殖反应下降了54%。提示阻断ICAM-1这一协同刺激信号通路，APC的抗原呈递过程就会受到抑制。我们的结果还显示，抗ICAM-1单抗可以抑制肺组织局部IL-4和IL-5的产生。我们曾报道IL-4和IL-5不但能趋化Eos浸润到气道，还能招致气道高反应性[4，5]。综上所述，由于抗ICAM-1单抗封闭表达于气道APC表面的ICAM-1，抑制APC将抗原传递给T淋巴细胞，因而也就抑制了T淋巴细胞的活化过程，由T淋巴细胞所产生的IL-4和IL-5也随之减少。此时，抗原引起的气道Eos浸润和气道高反应性也就得到了缓解。
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基金项目：广西壮族自治区科技厅自然科学基金资助项目(9912017)
参考文献
1，施焕中，陈一强，龙学明，等.支气管哮喘患者血清可溶性粘附分子测定.中华结核和呼吸杂志，1996,19:363.
2，Shi HZ,Chen YQ,Qin SM .Inhaled IL-5 increases concentrations of soluble intracellular adhesion molecule-1 in sputum from atopin asthmatics subjects.J Allergy Clin Immunol,1999,103(3 Pt 1):463-467.
3，施焕中，钟小宁，许辉，等.γ-干扰素对抗原嗜酸性粒细胞浸润的影响.中华内科杂志，1996,35:371-375.
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4，Shi HZ,Deng JM,Xu H,et al.Effect of inhaled interleukin-4 on airway hyperreactivity in asthmatics.Am J Respir Crit Care Med,1998,157(6 Pt 1):1818-1821.
5，Shi HZ,Xiao CQ,Zhong D,et al.Effect of inhaled interleukin-5 on airway hyperreactivity and eosinophilia in asthmatics.Am J Respir Crit Care Med,1998,157:204-209.
收稿日期：1999-08-15, 百拇医药
单位：广西医科大学第一附属医院呼吸内科 南宁，530021
关键词：
中华内科杂志000715 我们以前的研究表明，过敏性支气管哮喘患者血清可溶性细胞间黏附分子-1(ICAM-1)水平明显增高，并与哮喘病情密切相关[1]。在哮喘发病机制中发挥重要作用的白细胞介素(IL)-5，经雾化吸入后可刺激气道局部产生大量的可溶性ICAM-1[2]。本研究进一步探讨抗ICAM-1单克隆抗体对抗原引起的气道炎症和气道高反应性的影响。
一、 材料与方法
1. 48只6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组12只。A组为阳性组对照组，参照我们以前报道的方法[3]用鸡卵清白蛋白(OVA)致敏和刺激小鼠，诱发气道嗜酸粒细胞(Eos)性炎症和气道高反应性；B组为阴性对照组，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替OVA作腹腔注射和雾化吸入；C组和D组分别为抗ICAM-1单抗处理组和IgG对照组，于OVA刺激前分别经尾静脉注射100 μg抗ICAM-1单抗或仓鼠同类IgG1(均购自美国Pharmingen公司)。
, http://www.100md.com
2. 每组有6只小鼠于处死前40min腹腔注射总量为4 mg 5-溴脱氧尿核苷(BrdU，购自美国Sigma公司)，用于检测肺组织T淋巴细胞增殖过程中消耗BrdU所合成DNA 的量，即体内增殖反应。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，并计数BALF中的Eos。取BALF中其余的细胞用流式细胞仪检测ICAM-1的表达。
3.收集BALF后，取出小鼠肺脏，剪成碎片，以DNA酶-1和胶原酶酶裂解制成单细胞悬液，流经SephadexG-10柱去除巨噬细胞等黏附性细胞，然后用美国Miltenyi Biotec公司生产的MACS分离柱纯化出T淋巴细胞。T淋巴细胞经酸处理后与荧光素标记的抗BrdU单抗孵化后,以流式细胞仪分析T淋巴细胞中结合BrdU的细胞百分数。
4. 各组其余6只小鼠麻醉后置于体积描计盒中，用小导管将气管和啮齿动物呼吸机相连接，并给予频率为120次/min，潮气量为0.4 ml的机械通气。肌肉注射氯化筒箭毒碱阻断小鼠自主呼吸后连续记录呼吸阻力。给小鼠自低浓度至高浓度雾化吸入乙酰胆碱溶液直至呼吸阻力增加达到或超过50%以上，最后计算引起气道阻力增加50%时所吸入乙酰胆碱的浓度(PC50)，以此表示气道反应性。
, http://www.100md.com
5. 测定气道反应性后取肺组织制成组织匀浆悬液，收集上清液冻存于-80℃待测其中IL-4和IL-5含量。IL-4和IL-5含量测定采用酶联免疫吸附测定法，试剂盒购自美国Endogen公司，最终结果以pg/g肺组织表示。
6. 统计学方法：所有数据以
±s表示，结果比较采用t检验、方差分析和q检验。二、 结果
1. B组BALF中的细胞虽然也表达ICAM-1(平均荧光密度为12.5±3.2)，但明显低于A组(平均荧光密度为44.2±9.4；t=7.84，P<0.01) 。
2. 抗 ICAM-1单抗对Eos数、PC50值、BrdU阳性的T淋巴细胞百分数和细胞因子水平的影响见表1。
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讨论 从本研究中发现，抗原致敏和刺激可以使BALF中的细胞 ICAM-1表达增加。B组小鼠BALF中未见到Eos，A组则见到大量的Eos出现于BALF中，气道反应性也随之升高。当致敏小鼠接受抗ICAM-1单抗静脉注射后，BALF中的Eos数下降了63%；与此同时，PC50也升高64%。说明抗ICAM-1单抗可以抑制Eos浸润致敏小鼠的气道，并降低气道高反应性。
表1 抗 ICAM-1单抗对Eos数、气道反应性、肺组织
T淋巴细胞增殖能力和细胞因子水平的影响(
±s) 组别鼠数(只)
Eos数
(×108/L)
, 百拇医药
PC50值
BrdU阳性
的T淋巴
细胞百分
数(%)
IL-4
(pg/g)
IL-5
(pg/g)
A组
6
9.4±
1.4
, 百拇医药
0.21±
0.09
15.7±
1.2
391.3±
61.3
194.1±
27.7
B组
6
0
0.69±
0.12*
, 百拇医药
4.4±
0.5*
182.6±
49.7*
35.2±
8.2*
C组
6
3.5±
1.0*
0.58±
0.14*
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7.2±
0.9*
244.1±
56.6*
88.5±
15.0*
D组
6
9.2±
1.2
0.23±
0.11
, 百拇医药
14.9±
1.5
395.2±
58.0
191.5±
30.8
注：与A组比较，*P<0.01
T淋巴细胞的活化和增殖需要两类性质不同的信号，第一信号来自T淋巴细胞受体和抗原呈递细胞(APC)表面的主要组织相溶性复合体分子在抗原存在时相互作用的复合体；第二信号即为APC所提供的协同刺激信号。早有报道，表达于APC表面的ICAM-1就可以作为协同刺激信号。我们发现，当应用抗ICAM-1单抗封闭小鼠体内ICAM-1后，肺T淋巴细胞的增殖反应下降了54%。提示阻断ICAM-1这一协同刺激信号通路，APC的抗原呈递过程就会受到抑制。我们的结果还显示，抗ICAM-1单抗可以抑制肺组织局部IL-4和IL-5的产生。我们曾报道IL-4和IL-5不但能趋化Eos浸润到气道，还能招致气道高反应性[4，5]。综上所述，由于抗ICAM-1单抗封闭表达于气道APC表面的ICAM-1，抑制APC将抗原传递给T淋巴细胞，因而也就抑制了T淋巴细胞的活化过程，由T淋巴细胞所产生的IL-4和IL-5也随之减少。此时，抗原引起的气道Eos浸润和气道高反应性也就得到了缓解。
, http://www.100md.com
基金项目：广西壮族自治区科技厅自然科学基金资助项目(9912017)
参考文献
1，施焕中，陈一强，龙学明，等.支气管哮喘患者血清可溶性粘附分子测定.中华结核和呼吸杂志，1996,19:363.
2，Shi HZ,Chen YQ,Qin SM .Inhaled IL-5 increases concentrations of soluble intracellular adhesion molecule-1 in sputum from atopin asthmatics subjects.J Allergy Clin Immunol,1999,103(3 Pt 1):463-467.
3，施焕中，钟小宁，许辉，等.γ-干扰素对抗原嗜酸性粒细胞浸润的影响.中华内科杂志，1996,35:371-375.
, http://www.100md.com
4，Shi HZ,Deng JM,Xu H,et al.Effect of inhaled interleukin-4 on airway hyperreactivity in asthmatics.Am J Respir Crit Care Med,1998,157(6 Pt 1):1818-1821.
5，Shi HZ,Xiao CQ,Zhong D,et al.Effect of inhaled interleukin-5 on airway hyperreactivity and eosinophilia in asthmatics.Am J Respir Crit Care Med,1998,157:204-209.
收稿日期：1999-08-15, 百拇医药