肥厚性心肌病基因突变之检测
作者：李昭晖 叶珏 胡宝莲 惠汝太 马爱群
单位：李昭晖(西安交通大学第一临床学院心内科 710061)；马爱群(西安交通大学第一临床学院心内科 710061)；叶珏(北京阜外医院中德分子医学中心)；胡宝莲(北京阜外医院中德分子医学中心)；惠汝太(北京阜外医院中德分子医学中心)
关键词：
中华内科杂志000714
肥厚性心肌病(HCM)被认为是一种常染色体显性遗传病，约50%以上的患者有家族史。参照国外报道，我们在突变率较高和(或)突变种类较多的外显子区域，以聚合酶链反应-单链构象多态分析(PCR-SSCP)方法检测基因突变，以期发现部分中国人群家族性及散发HCM的致病基因突变及发病特点。
1.对象和方法：西安医科大学第一附属医院及北京阜外医院门诊及住院HCM患者21例，有家族史者13例，散发8例。正常对照3例。诊断标准：室间隔厚度>12 mm或心室有不对称性增厚，排除引起心肌肥厚的继发因素。取外周静脉血5 ml，2%EDTA抗凝，低渗溶血离心，取白细胞；盐析蛋白、氯仿抽提DNA。PCR引物序列及PCR程序见表1。
, http://www.100md.com
2.结果：21例患者及3例正常对照β-肌球蛋白重链(β-MHC)第9、13、16、20、23外显子，肌球蛋白结合蛋白C(MYBP-C)第25外显子，α-向肌球蛋白(α-TM)第5外显子， 经PCR-SSCP分析,在以上检测区域未发现基因突变。
讨论 自1989年Jarcko首次揭示一肥厚性心肌病家系致病基因位于染色体 14q1与 β-MHC紧密连锁之后，相继发现7个基因的100余种突变与HCM有关，突变基因表达出功能缺陷蛋白组装入肌小节被认为是HCM的主要发病机制。我们对21例HCM患者检测基因突变，没有阳性发现，但注意到一家系的发病情况特殊(图1)。通常将HCM归入常染色体显性遗传性疾病。Nishi发现一HCM家系，当β-MHC935密码子突变(Glu-> Lys)单独存在时，携带者无临床症状，因近亲婚配产生的纯合突变个体表现出典型HCM。而另一家系中发现携带有β-MHC870密码子突变(Arg->His)的家族成员不表现出HCM症状，而该突变与另一等位基因5′端的一无义突变共同存在时，患者表现出典型且严重的症状。Jeschke报道1例6.5岁时发生心跳骤停的HCM患者,在β-MHC等位基因上有Met349Thz及Arg 719Trp两个突变，前者从母亲继承而来，后者未在父亲基因中出现，考虑是父方配子水平发生突变所致。故提示此家系的HCM可能是以一种隐性遗传方式出现的，因Ⅰ1及Ⅰ2并非近亲婚配，故Ⅱ1,Ⅱ2为纯合突变的可能性不大，有可能为父方与母方携带不同的隐性突变等位基因，当其共同存在于后代个体中时，出现叠加效应，表现出临床症状。而发生于配子水平的突变致两后代个体发病的可能性虽小，但不能完全排除。况少青等[2] 检测35例散发性HCM患者，仅发现1例患者β-MHC基因383位密码子G-T颠换，导致赖氨酸变成天冬氨酸。另有报道分别对6及8个HCM家系进行突变基因检测，未发现突变[3，4]。以上研究均集中于国外报道突变较多的β-MHC基因第9、13、16、20、23等外显子区域，这从一定程度上表明，国人HCM发病情况与国外报道有一定差异。
, 百拇医药
表1 引物序列及PCR程序 外显子
引物序列(5′→3′)
PCR反应条件
片段长度(bp)
β-MHC
9
F：GGACTTGGACTGGTGGAGGA
95℃,5′；94℃,30″；58℃,30″
223
R：GGGGAGAGAGAGAGAGGTCA
72℃,40″(35cycles)；72℃,7′
, 百拇医药
13
F：TTACAGGCATGATCCACACACC
95℃,5′；94℃,40″；59.5℃,40″
267
R：GTGAACTTGAAAACTCTCATCC
70℃,1′(40cycles)；72℃,10′
16
F：TTGACCATAGTGCAGAATCC
95℃,5′；94℃,30″；58℃,30″
438
, 百拇医药
R：CTCAGAACCTTGGGAGAATC
72℃,40″(35cycles)；72℃,7′
20
F：ATGATTACAGGAAAAGC
95℃,5′；94℃,30″；58℃,30″
298
R：CCTGATGGGAATGGGATCTG
72℃,40″(35cycles)；72℃,7′
23
F：CCCTCCTATTTGAGTGATGTGC
, 百拇医药
95℃,5′；94℃,40″；59.5℃,40″
404
R：GGTCAGTATGGTCTGAGAGTCC
70℃,1′(40cycles)；72℃,10′
MyBP-C
25
F：AACAGATCCGAGGGAAGGTGG
95℃,5′；94℃,40″；59.5℃,40″
310
R：TTTTTAACTGGGGAGGGGGC
, 百拇医药
70℃,1′(40cycles)；72℃,10′
α-Tm
5
F：CCATGCCCTTCTGTTACACAAAGC
95℃,5′；94℃,40″；59.5℃,40″[1]
R：TGCCAGAAGGTCATGCTGTTTAGTC
70℃,1′(40cycles)；72℃,10′
图1 一家系发病图谱
参考文献
, 百拇医药
1，Thierfelder L,Watkins H,MacRae C,et al.Alpha-Tropomyosin and cardiac troponin T mutations cause familial hypertropic cardiomyopathy:a disease of the sarcomere.Cell,1994,77:701-712.
2，况少青,于金德,陆林,等.肥厚性心肌病患者心脏β-肌凝蛋白重链基因点突变的研究.中华心血管病杂志,1996,24:111-114.
3，张之炯,张修武,雷蓓蕾,等.家族性肥厚型心肌病患者β型肌凝蛋白重链基因突变研究.中国心血管杂志,1998,3:80-83.
4，Hwang DS,Chen YT,Su JS,et al.Evidence of genetic heterogeneity of hypertrophic cardiomyopathy in eight Chinese patients.Chung Hua I Hsueh Tsa Chih(Taipei),1996,57:315-321.
收稿日期：1999-09-15, 百拇医药
单位：李昭晖(西安交通大学第一临床学院心内科 710061)；马爱群(西安交通大学第一临床学院心内科 710061)；叶珏(北京阜外医院中德分子医学中心)；胡宝莲(北京阜外医院中德分子医学中心)；惠汝太(北京阜外医院中德分子医学中心)
关键词：
中华内科杂志000714
肥厚性心肌病(HCM)被认为是一种常染色体显性遗传病，约50%以上的患者有家族史。参照国外报道，我们在突变率较高和(或)突变种类较多的外显子区域，以聚合酶链反应-单链构象多态分析(PCR-SSCP)方法检测基因突变，以期发现部分中国人群家族性及散发HCM的致病基因突变及发病特点。
1.对象和方法：西安医科大学第一附属医院及北京阜外医院门诊及住院HCM患者21例，有家族史者13例，散发8例。正常对照3例。诊断标准：室间隔厚度>12 mm或心室有不对称性增厚，排除引起心肌肥厚的继发因素。取外周静脉血5 ml，2%EDTA抗凝，低渗溶血离心，取白细胞；盐析蛋白、氯仿抽提DNA。PCR引物序列及PCR程序见表1。
, http://www.100md.com
2.结果：21例患者及3例正常对照β-肌球蛋白重链(β-MHC)第9、13、16、20、23外显子，肌球蛋白结合蛋白C(MYBP-C)第25外显子，α-向肌球蛋白(α-TM)第5外显子， 经PCR-SSCP分析,在以上检测区域未发现基因突变。
讨论 自1989年Jarcko首次揭示一肥厚性心肌病家系致病基因位于染色体 14q1与 β-MHC紧密连锁之后，相继发现7个基因的100余种突变与HCM有关，突变基因表达出功能缺陷蛋白组装入肌小节被认为是HCM的主要发病机制。我们对21例HCM患者检测基因突变，没有阳性发现，但注意到一家系的发病情况特殊(图1)。通常将HCM归入常染色体显性遗传性疾病。Nishi发现一HCM家系，当β-MHC935密码子突变(Glu-> Lys)单独存在时，携带者无临床症状，因近亲婚配产生的纯合突变个体表现出典型HCM。而另一家系中发现携带有β-MHC870密码子突变(Arg->His)的家族成员不表现出HCM症状，而该突变与另一等位基因5′端的一无义突变共同存在时，患者表现出典型且严重的症状。Jeschke报道1例6.5岁时发生心跳骤停的HCM患者,在β-MHC等位基因上有Met349Thz及Arg 719Trp两个突变，前者从母亲继承而来，后者未在父亲基因中出现，考虑是父方配子水平发生突变所致。故提示此家系的HCM可能是以一种隐性遗传方式出现的，因Ⅰ1及Ⅰ2并非近亲婚配，故Ⅱ1,Ⅱ2为纯合突变的可能性不大，有可能为父方与母方携带不同的隐性突变等位基因，当其共同存在于后代个体中时，出现叠加效应，表现出临床症状。而发生于配子水平的突变致两后代个体发病的可能性虽小，但不能完全排除。况少青等[2] 检测35例散发性HCM患者，仅发现1例患者β-MHC基因383位密码子G-T颠换，导致赖氨酸变成天冬氨酸。另有报道分别对6及8个HCM家系进行突变基因检测，未发现突变[3，4]。以上研究均集中于国外报道突变较多的β-MHC基因第9、13、16、20、23等外显子区域，这从一定程度上表明，国人HCM发病情况与国外报道有一定差异。
, 百拇医药
表1 引物序列及PCR程序 外显子
引物序列(5′→3′)
PCR反应条件
片段长度(bp)
β-MHC
9
F：GGACTTGGACTGGTGGAGGA
95℃,5′；94℃,30″；58℃,30″
223
R：GGGGAGAGAGAGAGAGGTCA
72℃,40″(35cycles)；72℃,7′
, 百拇医药
13
F：TTACAGGCATGATCCACACACC
95℃,5′；94℃,40″；59.5℃,40″
267
R：GTGAACTTGAAAACTCTCATCC
70℃,1′(40cycles)；72℃,10′
16
F：TTGACCATAGTGCAGAATCC
95℃,5′；94℃,30″；58℃,30″
438
, 百拇医药
R：CTCAGAACCTTGGGAGAATC
72℃,40″(35cycles)；72℃,7′
20
F：ATGATTACAGGAAAAGC
95℃,5′；94℃,30″；58℃,30″
298
R：CCTGATGGGAATGGGATCTG
72℃,40″(35cycles)；72℃,7′
23
F：CCCTCCTATTTGAGTGATGTGC
, 百拇医药
95℃,5′；94℃,40″；59.5℃,40″
404
R：GGTCAGTATGGTCTGAGAGTCC
70℃,1′(40cycles)；72℃,10′
MyBP-C
25
F：AACAGATCCGAGGGAAGGTGG
95℃,5′；94℃,40″；59.5℃,40″
310
R：TTTTTAACTGGGGAGGGGGC
, 百拇医药
70℃,1′(40cycles)；72℃,10′
α-Tm
5
F：CCATGCCCTTCTGTTACACAAAGC
95℃,5′；94℃,40″；59.5℃,40″[1]
R：TGCCAGAAGGTCATGCTGTTTAGTC
70℃,1′(40cycles)；72℃,10′
图1 一家系发病图谱
参考文献
, 百拇医药
1，Thierfelder L,Watkins H,MacRae C,et al.Alpha-Tropomyosin and cardiac troponin T mutations cause familial hypertropic cardiomyopathy:a disease of the sarcomere.Cell,1994,77:701-712.
2，况少青,于金德,陆林,等.肥厚性心肌病患者心脏β-肌凝蛋白重链基因点突变的研究.中华心血管病杂志,1996,24:111-114.
3，张之炯,张修武,雷蓓蕾,等.家族性肥厚型心肌病患者β型肌凝蛋白重链基因突变研究.中国心血管杂志,1998,3:80-83.
4，Hwang DS,Chen YT,Su JS,et al.Evidence of genetic heterogeneity of hypertrophic cardiomyopathy in eight Chinese patients.Chung Hua I Hsueh Tsa Chih(Taipei),1996,57:315-321.
收稿日期：1999-09-15, 百拇医药