肺癌组织中p21waf1和增殖细胞核抗原的蛋白表达
作者：丁续红 吴小军 杨炯 彭燕 张旃 李清泉
单位：武汉，湖北医科大学附属第一医院呼吸内科 430060
关键词：
中华内科杂志000820 p21waf1是近期发现的一种细胞周期素依赖性激酶抑制因子。细胞DNA损伤后p53活化，诱导p21waf1蛋白表达，p21waf1与增殖细胞核抗原 (PCNA)结合，抑制DNA复制和细胞增殖。本研究通过观察p21waf1和PCNA在肺癌中的表达，并与其在肺良性疾病中的表达进行比较，探讨良恶性细胞增殖的差异。
一、材料与方法
1.标本：肺癌组织石蜡包埋标本源自1996年10月至1999年5月间保存的纤维支气管镜活检和胸外科手术标本76例，男56例，女20例，年龄18～74岁。其中鳞癌29例，腺癌20例，大细胞癌8例，小细胞癌17例，未定型癌2例。另选同期手术的慢性肺良性疾病石蜡包埋标本59例，男42例，女17例，年龄16～70岁。其中肺结核33例，慢性支气管炎9例，肺气肿和肺大泡7例，支气管扩张症4例，炎性假瘤2例，肺脓肿2 例，肺炎1例，肺囊肿1 例。
, 百拇医药
2.试剂和方法：抗p21waf1单克隆抗体4D10和抗PCNA单克隆抗体PC10均为美国DAKO公司产品。免疫组化染色试剂盒SP Kit为美国Zymed公司产品。上述试剂均购自福州迈新生物技术有限公司。染色方法按试剂盒说明进行。p21waf1抗原修复采用高温高压修复法，PCNA无需抗原修复。两种单克隆抗体的阳性对照片由迈新公司提供。用PBS代替一抗作为阴性对照。p21waf1阳性判断标准：计数连续5个高倍镜视野中染成黄褐色的阳性细胞所占比例，以<10%为 阴性，≥10% 为阳性。 PCNA阳性判断标准：计数方法同p21waf1，以未见阳性细胞为阴性，出现阳性细胞为阳性。
3.统计学方法：各型肺癌之间p21waf1与PCNA表达比较用Ridit分析。p21waf1和PCNA蛋白表达与肿瘤TNM分期、细胞分化程度之间的关系采用Kolmoyonov-Smirnov法检验。肺癌与肺良性疾病之间p21waf1及PCNA蛋白表达比较、p21waf1蛋白表达与PCNA的关系采用χ2检验。
, 百拇医药
二、结果
1. 肺癌和肺良性疾病组织p21waf1及PCNA的蛋白表达：见表1。免疫组化结果见图1，2。
表1 肺癌与肺良性疾病组织p21waf1和PCNA蛋白表达
例
数
p21waf1
PCNA
阳性
阴性
阳性率(%)
阳性
, 百拇医药 阴性
阳性率(%)
肺癌
76
57
19
75.00
61
15
80.26
鳞癌
29
23
6
, 百拇医药
79.31
26
3
89.66
腺癌
20
16
4
80.00
17
3
85.00
大细胞癌
, 百拇医药
8
4
4
4/8
8
0
8/8
小细胞癌
17
12
5
70.59
8
9
, 百拇医药
47.06
未定型
2
2
0
2/2
2
0
2/2
肺良性疾病
59
21
38
35.59
, 百拇医药
23
36
38.98
2. p21waf1、PCNA蛋白表达与肺癌分期和分化程度的关系：见表2。 76例肺癌中有60例TNM分期明确，未发现肺癌分期和分化程度与p21waf1、PCNA蛋白表达相关(P>0.05)。
表2 p21waf1、PCNA蛋白表达与肺癌分期和分化度的关系 TNM
分期
p21waf1
PCNA
分化度
p21waf1
, 百拇医药
PCNA
阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
阴性
Ⅰ
13
2
12
3
, 百拇医药
低度
8
1
7
2
Ⅱ
16
7
21
2
中度
16
5
20
, http://www.100md.com
1
Ⅲ
14
4
12
6
高度
15
4
16
3
Ⅳ
3
1
, 百拇医药
4
0
合计
46
14
49
11
合计
39
10
43
6
3. 肺癌及肺良性疾病p21waf1与PCNA的相关性： 肺癌组织p21waf1蛋白表达与PCNA之间无相关性(χ2=0.0277,P=0.85)。PCNA呈阳性的肺良性疾病的p21waf1表达阳性率高，而PCNA阴性的p21waf1表达阳性率低，两者之间有相关性(χ2=4.52，P=0.03) 。
, 百拇医药
讨论 本研究显示，肺癌组织中p21waf1蛋白表达明显增高。细胞DNA损伤后，p53活化，诱导其下游效应子p21waf1蛋白表达，因而 p21waf1蛋白表达的增高在某种程度上正是细胞DNA受损的反映。Marchetti 等[1]和Hayashi等[2]报道，p21waf1蛋白表达与肺癌TNM分期无关，但与细胞分化程度相关，分化程度低的非小细胞肺癌p21waf1蛋白表达阳性率也低。而本研究未发现p21waf1蛋白表达与肺癌TNM分期及细胞分化程度相关。不同病理类型的肺癌p21waf1蛋白表达也无差异。肺癌细胞分化程度与p21waf1蛋白表达有无关系还有待研究。有报道认为PCNA蛋白表达与肺癌的临床分期及分化程度相关，但大多数作者认为无关，我们的研究也显示PCNA蛋白表达与肺癌的临床分期及分化程度无关。不同病理类型的肺癌其PCNA蛋白表达状况不同。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助因子，它不仅参与DNA的复制，还参与DNA的核苷酸外切修复。Driscoll 等[3] 的研究发现，由于肺癌细胞的PCNA表达被完全抑制，DNA修复功能显著降低，在氧自由基损伤细胞DNA后，很快出现细胞凋亡。我们认为，鳞癌与小细胞癌之间PCNA表达水平的不同，可能正反映了这两种类型肺癌细胞的DNA损伤修复能力的不同。鳞癌细胞PCNA表达阳性率高于小细胞癌，因而其DNA损伤修复能力可能也强于后者，故其生物恶性度相对低于小细胞癌。
, 百拇医药
在肺良性疾病中，35.59%的病例p21waf1蛋白表达阳性，38.98%的病例PCNA表达阳性，其阳性率均显著低于肺癌 。慢性炎症过程中，炎性介质、氧自由基等损伤细胞DNA，启动p53-p21waf1-PCNA调控机制，因而肺良性疾病中p21waf1和PCNA蛋白表达上调以对抗炎性损伤。肺良性疾病中， p21waf1与PCNA蛋白表达相关， p21waf1与PCNA协调作用，使慢性肺良性疾病组织细胞的增殖处于控制之中。而肺癌组织中p21waf1与PCNA蛋白表达无关，p21waf1未能有效地抑制细胞增殖。虽然肺癌组织中p21waf1与PCNA蛋白表达均明显增高，但可能由于肿瘤细胞对p21waf1蛋白的反应性降低，使p21waf1蛋白的抑制作用大大减弱，肿瘤细胞得以无限制地增殖。p21waf1能否有效地发挥细胞周期调控作用可能是良恶性细胞增殖的主要区别之一。
图1 肺腺癌细胞核p21waf1染色阳性
, http://www.100md.com
图2 肺大细胞癌细胞核增殖细胞核抗原染色阳性无数为SP×100
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(96J070)
参考文献
1，Marchetti A, Doglioni C,Barbareschi M, et al. p21 RNA and protein expression in non-small cell lung carcinomas: evidence of p53-independent expression and association with tumoral differentiation. Oncogene, 1s1Waf1/Cip1 expression in normal, premalignant, and malignant cell during the development of human lung adenocarcinoma. Am J Pathol, 1997, 151:461-470.
3，Driscoll B, Buckley S, Barsky L, et al. Abrogation of cyclin D1 expression predisposes lung cancer cells to serum deprivation-induced apoptosis. Am J Physiol, 1999, 276(4 Pt 1):L679-L687.
(收稿日期：1999-10-09), 百拇医药
单位：武汉，湖北医科大学附属第一医院呼吸内科 430060
关键词：
中华内科杂志000820 p21waf1是近期发现的一种细胞周期素依赖性激酶抑制因子。细胞DNA损伤后p53活化，诱导p21waf1蛋白表达，p21waf1与增殖细胞核抗原 (PCNA)结合，抑制DNA复制和细胞增殖。本研究通过观察p21waf1和PCNA在肺癌中的表达，并与其在肺良性疾病中的表达进行比较，探讨良恶性细胞增殖的差异。
一、材料与方法
1.标本：肺癌组织石蜡包埋标本源自1996年10月至1999年5月间保存的纤维支气管镜活检和胸外科手术标本76例，男56例，女20例，年龄18～74岁。其中鳞癌29例，腺癌20例，大细胞癌8例，小细胞癌17例，未定型癌2例。另选同期手术的慢性肺良性疾病石蜡包埋标本59例，男42例，女17例，年龄16～70岁。其中肺结核33例，慢性支气管炎9例，肺气肿和肺大泡7例，支气管扩张症4例，炎性假瘤2例，肺脓肿2 例，肺炎1例，肺囊肿1 例。
, 百拇医药
2.试剂和方法：抗p21waf1单克隆抗体4D10和抗PCNA单克隆抗体PC10均为美国DAKO公司产品。免疫组化染色试剂盒SP Kit为美国Zymed公司产品。上述试剂均购自福州迈新生物技术有限公司。染色方法按试剂盒说明进行。p21waf1抗原修复采用高温高压修复法，PCNA无需抗原修复。两种单克隆抗体的阳性对照片由迈新公司提供。用PBS代替一抗作为阴性对照。p21waf1阳性判断标准：计数连续5个高倍镜视野中染成黄褐色的阳性细胞所占比例，以<10%为 阴性，≥10% 为阳性。 PCNA阳性判断标准：计数方法同p21waf1，以未见阳性细胞为阴性，出现阳性细胞为阳性。
3.统计学方法：各型肺癌之间p21waf1与PCNA表达比较用Ridit分析。p21waf1和PCNA蛋白表达与肿瘤TNM分期、细胞分化程度之间的关系采用Kolmoyonov-Smirnov法检验。肺癌与肺良性疾病之间p21waf1及PCNA蛋白表达比较、p21waf1蛋白表达与PCNA的关系采用χ2检验。
, 百拇医药
二、结果
1. 肺癌和肺良性疾病组织p21waf1及PCNA的蛋白表达：见表1。免疫组化结果见图1，2。
表1 肺癌与肺良性疾病组织p21waf1和PCNA蛋白表达
例
数
p21waf1
PCNA
阳性
阴性
阳性率(%)
阳性
, 百拇医药 阴性
阳性率(%)
肺癌
76
57
19
75.00
61
15
80.26
鳞癌
29
23
6
, 百拇医药
79.31
26
3
89.66
腺癌
20
16
4
80.00
17
3
85.00
大细胞癌
, 百拇医药
8
4
4
4/8
8
0
8/8
小细胞癌
17
12
5
70.59
8
9
, 百拇医药
47.06
未定型
2
2
0
2/2
2
0
2/2
肺良性疾病
59
21
38
35.59
, 百拇医药
23
36
38.98
2. p21waf1、PCNA蛋白表达与肺癌分期和分化程度的关系：见表2。 76例肺癌中有60例TNM分期明确，未发现肺癌分期和分化程度与p21waf1、PCNA蛋白表达相关(P>0.05)。
表2 p21waf1、PCNA蛋白表达与肺癌分期和分化度的关系 TNM
分期
p21waf1
PCNA
分化度
p21waf1
, 百拇医药
PCNA
阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
阴性
Ⅰ
13
2
12
3
, 百拇医药
低度
8
1
7
2
Ⅱ
16
7
21
2
中度
16
5
20
, http://www.100md.com
1
Ⅲ
14
4
12
6
高度
15
4
16
3
Ⅳ
3
1
, 百拇医药
4
0
合计
46
14
49
11
合计
39
10
43
6
3. 肺癌及肺良性疾病p21waf1与PCNA的相关性： 肺癌组织p21waf1蛋白表达与PCNA之间无相关性(χ2=0.0277,P=0.85)。PCNA呈阳性的肺良性疾病的p21waf1表达阳性率高，而PCNA阴性的p21waf1表达阳性率低，两者之间有相关性(χ2=4.52，P=0.03) 。
, 百拇医药
讨论 本研究显示，肺癌组织中p21waf1蛋白表达明显增高。细胞DNA损伤后，p53活化，诱导其下游效应子p21waf1蛋白表达，因而 p21waf1蛋白表达的增高在某种程度上正是细胞DNA受损的反映。Marchetti 等[1]和Hayashi等[2]报道，p21waf1蛋白表达与肺癌TNM分期无关，但与细胞分化程度相关，分化程度低的非小细胞肺癌p21waf1蛋白表达阳性率也低。而本研究未发现p21waf1蛋白表达与肺癌TNM分期及细胞分化程度相关。不同病理类型的肺癌p21waf1蛋白表达也无差异。肺癌细胞分化程度与p21waf1蛋白表达有无关系还有待研究。有报道认为PCNA蛋白表达与肺癌的临床分期及分化程度相关，但大多数作者认为无关，我们的研究也显示PCNA蛋白表达与肺癌的临床分期及分化程度无关。不同病理类型的肺癌其PCNA蛋白表达状况不同。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助因子，它不仅参与DNA的复制，还参与DNA的核苷酸外切修复。Driscoll 等[3] 的研究发现，由于肺癌细胞的PCNA表达被完全抑制，DNA修复功能显著降低，在氧自由基损伤细胞DNA后，很快出现细胞凋亡。我们认为，鳞癌与小细胞癌之间PCNA表达水平的不同，可能正反映了这两种类型肺癌细胞的DNA损伤修复能力的不同。鳞癌细胞PCNA表达阳性率高于小细胞癌，因而其DNA损伤修复能力可能也强于后者，故其生物恶性度相对低于小细胞癌。
, 百拇医药
在肺良性疾病中，35.59%的病例p21waf1蛋白表达阳性，38.98%的病例PCNA表达阳性，其阳性率均显著低于肺癌 。慢性炎症过程中，炎性介质、氧自由基等损伤细胞DNA，启动p53-p21waf1-PCNA调控机制，因而肺良性疾病中p21waf1和PCNA蛋白表达上调以对抗炎性损伤。肺良性疾病中， p21waf1与PCNA蛋白表达相关， p21waf1与PCNA协调作用，使慢性肺良性疾病组织细胞的增殖处于控制之中。而肺癌组织中p21waf1与PCNA蛋白表达无关，p21waf1未能有效地抑制细胞增殖。虽然肺癌组织中p21waf1与PCNA蛋白表达均明显增高，但可能由于肿瘤细胞对p21waf1蛋白的反应性降低，使p21waf1蛋白的抑制作用大大减弱，肿瘤细胞得以无限制地增殖。p21waf1能否有效地发挥细胞周期调控作用可能是良恶性细胞增殖的主要区别之一。
图1 肺腺癌细胞核p21waf1染色阳性
, http://www.100md.com
图2 肺大细胞癌细胞核增殖细胞核抗原染色阳性无数为SP×100
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(96J070)
参考文献
1，Marchetti A, Doglioni C,Barbareschi M, et al. p21 RNA and protein expression in non-small cell lung carcinomas: evidence of p53-independent expression and association with tumoral differentiation. Oncogene, 1s1Waf1/Cip1 expression in normal, premalignant, and malignant cell during the development of human lung adenocarcinoma. Am J Pathol, 1997, 151:461-470.
3，Driscoll B, Buckley S, Barsky L, et al. Abrogation of cyclin D1 expression predisposes lung cancer cells to serum deprivation-induced apoptosis. Am J Physiol, 1999, 276(4 Pt 1):L679-L687.
(收稿日期：1999-10-09), 百拇医药