慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及药物干预的影响
作者：宋一平 崔德健 茅培英 王德文
单位：宋一平 崔德健 茅培英(北京，解放军第304医院呼吸科 100037)；王德文(军事医学科学院)
关键词：
中华内科杂志00819 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一患病率及病死率均较高且发病机制仍未完全阐明的疾病，建立一种符合人类病变特征、制作简便的COPD动物模型，将有利于本病的基础与临床研究。
一、 材料与方法
1. 雄性二级 Wistar大鼠48只，体重 (270±20)g。随机分为4组，每组12只。(1)A组：空白对照组，大鼠不做任何处理。(2)B组：模型组，第1、14天气管内注入脂多糖(LPS)各200 μg/200 μl[1]，第2～13天、15～28天每日上午在72 L密闭箱内熏5%大前门牌香烟0.5 h；(3)C组：布地奈德组，制作模型第8天起每日下午在28 L密闭箱内以百瑞雾化器雾吸1次皮质激素布地奈德2 g/4 ml；(4)D组：异丙托品组，制作模型后第8天起雾吸支气管扩张剂溴化异丙托品1 mg/4 ml，吸入方法同上。4周后采用我们改进的小动物呼吸功能测定仪(宣武医院制)测肺功能[2]。大鼠麻醉后置体描器内，呼吸时体描器的容积变化经处理可计算出潮气量及每分钟呼气量(
E)，经自制面罩外加25 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)的压力，迫使动物深吸气，再以25 cm H2O的负压吸引，造成深呼气，能较准确地测出最大呼气流量(PEF)和0.3 s用力呼气容积(FEV0.3 ) 。行左肺支气管肺泡灌洗，作支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数和分类计数。右肺病理标本做光镜HE及PAS染色及电镜观察。
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2.统计学方法：应用SAS统计软件进行方差分析，SNK检验。
二、 结果
1. 病理形态学改变见图1～8。
2. 各组BALF中白细胞计数及分类见表1。
3. 各组体重增幅差异无显著性 (P>0.05)。呼吸功能检查结果见表2。
讨论 我们模拟人类COPD的发生、发展过程 ，首次在国内采用两次气管内注入适量LPS和反复熏香烟的方法，制作大鼠COPD模型，结果表明本模型符合COPD模型的形态学和病生理学标准，模型的制备是成功的。B组大鼠BALF中WBC计数及中性粒细胞数显著增高，巨噬细胞绝对计数增加并有胞体增大、胞浆外突及富含溶酶体等被激活的表现，表明气道腔存在以中性粒细胞及巨噬细胞为主的炎症。本模型的形成机制考虑为：LPS为革兰阴性菌的外层结构，可直接引起气道上皮损伤，又可激活巨噬细胞、淋巴细胞生成前炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1等，趋化并激活中性粒细胞，释放蛋白酶等细胞毒性物质，导致支气管慢性炎症及肺气肿形成。Stolk等[3]认为LPS引起的中性粒细胞聚集及蛋白酶释放是黏液细胞化生和肺气肿形成的重要原因。香烟烟雾中的有害物质丙烯醛、氢氰酸、甲醛及大量氧自由基等可使纤毛脱落，细胞坏死，蛋白酶/抗蛋白酶系统失衡，下呼吸道易感性增加，更加重COPD相关的支气管肺损害，形成恶性循环，致使病理不断进展。本研究结果显示，C组BALF中白细胞总数及中性粒细胞数较B组显著降低(P<0.05)，单核-巨噬细胞的构成比恢复至对照水平，提示吸入皮质激素能部分改善气道腔以中性粒细胞为主的炎症，但对组织病理学及呼吸功能的改变无明显影响，与Thompson和Rennard[4]的报道一致。吸入异丙托品具有一定的扩张支气管、促进纤毛功能及黏液清除的作用。但一些研究表明，它尚不能减慢COPD患者呼吸功能下降的趋势。我们的结果也提示，它未能显著改善COPD动物模型呼吸功能及炎症指标。
, 百拇医药
表1 各组BALF中白细胞计数及分类比较(±s) 组别
鼠
数
(只)
白细胞计数
(×108/L)
细胞分类(%)
单核-巨噬细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
A组
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12
1.66±0.56
88.25±1.54
8.08±2.07
3.80±2.01
B组
12
3.60±0.76**
72.50±6.92*
22.00±6.09**
5.40±2.32
, 百拇医药
C组
12
2.30±0.47△*
85.37±4.53△
10.75±3.86△
3.88±2.26
D组
12
3.18±0.62**
74.08±8.26*
23.42±5.92**
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5.10±4.83
注：与A组比较，*P<0.05，**P<0.01；与B组比较，△P<0.05表2 各组呼吸功能的检查结果(±s) 组别
鼠数(只)E(ml/min)
PEF(ml/s)
FEV0.3(ml)
A组
12
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202.58±38.01
33.51±1.61
5.58±0.33
B组
12
156.92±36.92*
29.63±3.09*
4.72±0.42*
C组
12
161.85±40.78*
, 百拇医药
29.37±2.63*
4.69±0.35*
D组
12
166.05±37.25*
30.14±2.83*
4.53±0.37*
注：与A组比较，*P<0.05
图1 A组大鼠气管黏膜纤毛柱状上皮细胞排列整齐,未见杯状细胞,管壁及周围无充血及炎症细胞
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浸润 HE染色 ×400
图2 A组大鼠小支气管及伴行的小血管壁较薄，管壁及周围较少炎
症细胞 HE染色 ×400
图3 B组大鼠气管黏膜部分纤毛上皮细胞脱落, 黏液腺腺导管腔
内有大量炎症细胞及渗出，管壁尤以腺导管周围有密集的以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润 HE
染色 ×400
图4 B组大鼠支气管黏膜杯状细胞增多, 与纤毛柱状上皮细胞的比例增至约1∶1
, 百拇医药
PAS染色 ×200
图5 B组大鼠终末细支气管狭窄，其远端的呼吸细支气管及肺泡管扩
张，肺泡壁变薄 HE染色 ×100
图6 B组大鼠周边肺组织普遍存在肺泡腔膨大,肺泡壁变薄
HE染色 ×200
图7 B组大鼠支气管纤毛柱状上皮细胞胞浆肿胀，呈大泡样向腔面突起；上皮纤毛稀少，长短不
齐 透射电镜 ×6 000
, http://www.100md.com
图8 B组大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞增生，板层小体排空 透射电镜
×5 000
参考文献
1，马楠，崔德健，梁延杰，等.气道内注入脂多糖法建立大鼠慢性支气管炎模型.中华结核和呼吸杂志，1999，22:371-372.
2，徐叔云，卞如濂，陈修,主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1991.1192-1194.
3，Roche WR.Inflammatory and structural changes in the small airways in bronchial asthma.Am J Respir Crit Care Med ,1998,157(5 Pt 2)：S191-S194.
4，Thompson AB, Rennard SI. Assessment of airways inflammation in chronic bronchitis. Eur Respir J,1993,6：461-464.
(收稿日期：2000-03-04), 百拇医药
单位：宋一平 崔德健 茅培英(北京，解放军第304医院呼吸科 100037)；王德文(军事医学科学院)
关键词：
中华内科杂志00819 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一患病率及病死率均较高且发病机制仍未完全阐明的疾病，建立一种符合人类病变特征、制作简便的COPD动物模型，将有利于本病的基础与临床研究。
一、 材料与方法
1. 雄性二级 Wistar大鼠48只，体重 (270±20)g。随机分为4组，每组12只。(1)A组：空白对照组，大鼠不做任何处理。(2)B组：模型组，第1、14天气管内注入脂多糖(LPS)各200 μg/200 μl[1]，第2～13天、15～28天每日上午在72 L密闭箱内熏5%大前门牌香烟0.5 h；(3)C组：布地奈德组，制作模型第8天起每日下午在28 L密闭箱内以百瑞雾化器雾吸1次皮质激素布地奈德2 g/4 ml；(4)D组：异丙托品组，制作模型后第8天起雾吸支气管扩张剂溴化异丙托品1 mg/4 ml，吸入方法同上。4周后采用我们改进的小动物呼吸功能测定仪(宣武医院制)测肺功能[2]。大鼠麻醉后置体描器内，呼吸时体描器的容积变化经处理可计算出潮气量及每分钟呼气量(
E)，经自制面罩外加25 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)的压力，迫使动物深吸气，再以25 cm H2O的负压吸引，造成深呼气，能较准确地测出最大呼气流量(PEF)和0.3 s用力呼气容积(FEV0.3 ) 。行左肺支气管肺泡灌洗，作支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数和分类计数。右肺病理标本做光镜HE及PAS染色及电镜观察。, http://www.100md.com
2.统计学方法：应用SAS统计软件进行方差分析，SNK检验。
二、 结果
1. 病理形态学改变见图1～8。
2. 各组BALF中白细胞计数及分类见表1。
3. 各组体重增幅差异无显著性 (P>0.05)。呼吸功能检查结果见表2。
讨论 我们模拟人类COPD的发生、发展过程 ，首次在国内采用两次气管内注入适量LPS和反复熏香烟的方法，制作大鼠COPD模型，结果表明本模型符合COPD模型的形态学和病生理学标准，模型的制备是成功的。B组大鼠BALF中WBC计数及中性粒细胞数显著增高，巨噬细胞绝对计数增加并有胞体增大、胞浆外突及富含溶酶体等被激活的表现，表明气道腔存在以中性粒细胞及巨噬细胞为主的炎症。本模型的形成机制考虑为：LPS为革兰阴性菌的外层结构，可直接引起气道上皮损伤，又可激活巨噬细胞、淋巴细胞生成前炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1等，趋化并激活中性粒细胞，释放蛋白酶等细胞毒性物质，导致支气管慢性炎症及肺气肿形成。Stolk等[3]认为LPS引起的中性粒细胞聚集及蛋白酶释放是黏液细胞化生和肺气肿形成的重要原因。香烟烟雾中的有害物质丙烯醛、氢氰酸、甲醛及大量氧自由基等可使纤毛脱落，细胞坏死，蛋白酶/抗蛋白酶系统失衡，下呼吸道易感性增加，更加重COPD相关的支气管肺损害，形成恶性循环，致使病理不断进展。本研究结果显示，C组BALF中白细胞总数及中性粒细胞数较B组显著降低(P<0.05)，单核-巨噬细胞的构成比恢复至对照水平，提示吸入皮质激素能部分改善气道腔以中性粒细胞为主的炎症，但对组织病理学及呼吸功能的改变无明显影响，与Thompson和Rennard[4]的报道一致。吸入异丙托品具有一定的扩张支气管、促进纤毛功能及黏液清除的作用。但一些研究表明，它尚不能减慢COPD患者呼吸功能下降的趋势。我们的结果也提示，它未能显著改善COPD动物模型呼吸功能及炎症指标。
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表1 各组BALF中白细胞计数及分类比较(
±s) 组别鼠
数
(只)
白细胞计数
(×108/L)
细胞分类(%)
单核-巨噬细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
A组
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12
1.66±0.56
88.25±1.54
8.08±2.07
3.80±2.01
B组
12
3.60±0.76**
72.50±6.92*
22.00±6.09**
5.40±2.32
, 百拇医药
C组
12
2.30±0.47△*
85.37±4.53△
10.75±3.86△
3.88±2.26
D组
12
3.18±0.62**
74.08±8.26*
23.42±5.92**
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5.10±4.83
注：与A组比较，*P<0.05，**P<0.01；与B组比较，△P<0.05表2 各组呼吸功能的检查结果(
±s) 组别鼠数(只)
E(ml/min)PEF(ml/s)
FEV0.3(ml)
A组
12
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202.58±38.01
33.51±1.61
5.58±0.33
B组
12
156.92±36.92*
29.63±3.09*
4.72±0.42*
C组
12
161.85±40.78*
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29.37±2.63*
4.69±0.35*
D组
12
166.05±37.25*
30.14±2.83*
4.53±0.37*
注：与A组比较，*P<0.05
图1 A组大鼠气管黏膜纤毛柱状上皮细胞排列整齐,未见杯状细胞,管壁及周围无充血及炎症细胞
, http://www.100md.com
浸润 HE染色 ×400
图2 A组大鼠小支气管及伴行的小血管壁较薄，管壁及周围较少炎
症细胞 HE染色 ×400
图3 B组大鼠气管黏膜部分纤毛上皮细胞脱落, 黏液腺腺导管腔
内有大量炎症细胞及渗出，管壁尤以腺导管周围有密集的以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润 HE
染色 ×400
图4 B组大鼠支气管黏膜杯状细胞增多, 与纤毛柱状上皮细胞的比例增至约1∶1
, 百拇医药
PAS染色 ×200
图5 B组大鼠终末细支气管狭窄，其远端的呼吸细支气管及肺泡管扩
张，肺泡壁变薄 HE染色 ×100
图6 B组大鼠周边肺组织普遍存在肺泡腔膨大,肺泡壁变薄
HE染色 ×200
图7 B组大鼠支气管纤毛柱状上皮细胞胞浆肿胀，呈大泡样向腔面突起；上皮纤毛稀少，长短不
齐 透射电镜 ×6 000
, http://www.100md.com
图8 B组大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞增生，板层小体排空 透射电镜
×5 000
参考文献
1，马楠，崔德健，梁延杰，等.气道内注入脂多糖法建立大鼠慢性支气管炎模型.中华结核和呼吸杂志，1999，22:371-372.
2，徐叔云，卞如濂，陈修,主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1991.1192-1194.
3，Roche WR.Inflammatory and structural changes in the small airways in bronchial asthma.Am J Respir Crit Care Med ,1998,157(5 Pt 2)：S191-S194.
4，Thompson AB, Rennard SI. Assessment of airways inflammation in chronic bronchitis. Eur Respir J,1993,6：461-464.
(收稿日期：2000-03-04), 百拇医药