肺纤维化大鼠转化生长因子β1 mRNA表达的时间性和多源性变化
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中华内科杂志 2000年第9期第39卷
作者：郑锐 许丽彦 康健 侯显明
单位：110001 沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所
关键词：
中华内科杂志000918 在多种纤维增生性疾病中，转化生长因子(TGF)-β表现出共同的促纤维化作用，尤其是TGF-β1 在肺纤维化过程中起重要作用。TGF-β1和许多细胞因子一样，它是多细胞源性细胞因子，肺泡巨噬细胞(AM)源细胞因子在肺纤维化中的作用研究较多，而间质巨噬细胞(IM)源TGF-β1 mRNA 表达鲜有报道。我们在既往提出的TGF-β1组化染色定位的基础上[1]，用逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)从时空变化上分析博莱霉素致肺纤维化大鼠AM、IM及肺组织TGF-β1 mRNA的表达，从基因水平上探讨TGF-β1在肺纤维化中的作用。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.肺纤维化动物模型的建立及分组：健康雌性Wistar大鼠40只，随机分为2组，(1)博莱霉素组：25只， 经穿刺向气管内注入含5 mg/kg博莱霉素A5(天津河北制药厂) 的生理盐水0.2～0.3 ml；(2)对照组：15只，在同样条件下向气管内注入等体积的生理盐水。两组动物分别于气管灌注后的第1、3、7、14、28天随机处死5只(博莱霉素组)和3只(对照组)。
2.AM和IM的分离与纯化：右肺用PBS(4℃，含0.6 mmol/L EDTA，pH 7.4) 行支气管肺泡灌洗(5 ml×8),回收液离心(4℃，400g×10 min)，收集细胞用以分离AM。将反复冲洗后的右肺剪碎、研磨，洗涤3次，用含胶原酶ⅠA(175 U/ml,DNAse 0.01%,10% FCS ；Sigma)的PBS消化液，于37℃水浴振荡消化1h，用RPMI-1640反复洗涤、过滤(30 μm)，离心2次，收集细胞用以分离IM。将细胞团用含10%FCS的RPMI-1640悬浮，经37℃，5%CO2，100%饱和水蒸汽，在细胞培养箱内纯化2 h，用于RNA提取[2]。左肺于液氮冻存，用于RNA提取。
, 百拇医药
3.RNA的提取：用总RNA提取试剂盒(美国Promega 公司)改良RNA提取方案。
4.RT-PCR检测TGF-β1 mRNA的表达：引物购自上海生物工程有限公司，TGF-β1有义链为5′-GCTAATGGTGGACCGC-AAC-3′，反义链为5′-GCAGTGAGCACTGAAGCGA-3′。内对照GAPDH，其有义链为5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGA-3′，反义链为5′-CACAGTCTTCTGAGTGGCA-3′。所需试剂购自美国Promega 公司。 扩增条件为： 48℃，45 min反转录；94℃预变性2 min，然后94℃ 30 s，60℃ 1 min，72℃ 2 min， 72℃延伸7 min，于PCR扩增仪(美国PE公司9600型)扩增共30个循环，扩增产物分别为340 bp和298 bp。然后于2%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ ml溴化乙锭)中电泳， GDS800凝胶成像及分析系统(英国UVP公司)下扫描分析，TGF-β1 mRNA的相对含量用 TGF-β1与GAPDH吸光度×面积的比值表示[3]。
, 百拇医药
5.统计学方法：数据用
±s表示， 非配对t检验及相关分析。
二、结果
1. AM、IM和肺组织TGF-β1 mRNA表达的动态变化：见表1。
2.AM与肺组织释放TGF-β1 mRNA呈正相关 (r=0.78, P<0.01)，而IM与肺组织释放TGF-β1 mRNA 无明显相关，说明AM可能是肺内TGF-β1 mRNA的主要来源。
讨论 TGF-β1是多细胞源性细胞因子，其在肺内的表达呈现明显的时空变化。肺实质内TGF-β1蛋白表达第7天达到高峰，而肺间质内TGF-β1蛋白表达第7天开始增多，第28天达强阳性[1]，两者的表达时相和水平呈现明显不同。Coker等[4]发现，TGF-β1 mRNA 在正常人和小鼠肺内主要位于支气管上皮细胞、AM、内皮细胞和间胚叶细胞。我所研究人员发现，TGF-β1 广泛分布于正常大鼠支气管上皮细胞、AM、支气管周围的结缔组织细胞、血管周围的结缔组织细胞和肺间质[1]。AM是肺泡腔内的常驻细胞，而IM则位于肺间质内，AM和IM在位置、形态、功能和表型上存在明显的区别[2],两者TGF-β1 mRNA的表达也存在时相和水平的不同。AM释放的TGF-β1 mRNA于第7天达到高峰，和肺组织释放的TGF-β1 mRNA呈正相关，而IM TGF-β1 mRNA的表达，从第7天开始增多，第28天达到高峰，和肺组织释放的TGF-β1 mRNA无明显相关，结合肺纤维化的病理变化，提示AM源TGF-β1 mRNA可能在肺泡炎阶段发挥重要作用，而肺内间质局部IM源TGF-β1 mRNA 可能在纤维化持续发展中发挥重要作用。
, 百拇医药
表1 AM、IM和肺组织TGF-β1 mRNA表达的动态变化(±s) 组别
鼠数
(只)
TGF-β1 mRNA
1 d
3 d
7 d
14 d
28 d
AM
博莱霉素组
, http://www.100md.com
25
0.98±
0.21
1.48±
0.28
2.10±
0.49△
1.36±
0.29
1.15±
0.30
对照组
, http://www.100md.com
15
0.97±
0.20
0.98±
0.18
0.91±
0.23
0.98±
0.15
1.08±
0.20
IM
博莱霉素组
, 百拇医药
25
0.98±
0.12
1.08±
0.18
1.23±
0.11
1.52±
0.18△
1.86±
0.28△
对照组
, http://www.100md.com
15
1.02±
0.10
0.90±
0.25
0.98±
0.15
1.02±
0.13
0.98±
0.17
肺组织
博莱霉素组
, 百拇医药
25
1.01±
0.15
1.24±
0.15
1.64±
0.18△
1.27±
0.24
1.04±
0.10
对照组
15
, http://www.100md.com
0.96±
0.10
0.91±
0.27
0.94±
0.16
1.04±
0.10
0.87±
0.28
注：P<0.05,△ P<0.01
肺纤维化过程中AM、IM TGF-β1 mRNA的高度表达，在激发肺泡炎和间质纤维化过程中起重要作用，提示应用基因治疗途径(如反义核糖核酸)，探求选择性地抑制及调节TGF-β1 mRNA的表达，可能有望在阻止炎症细胞的浸润、活化及影响肺纤维化进程方面获得有意义的结果。由于容易获得较纯的AM，其在肺纤维化过程中的作用得到了广泛研究，而IM则相对不易获得，其在致纤维化过程中的作用有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目( 39570332)
参考文献
1，马跃文, 佟振月, 侯显明. TGF-β1在博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织不同细胞表达的定量研究. 中国医科大学学报, 1998, 27: 467-471.
2，Johansson A, Lundborg M, Skold CM, et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997, 16:582-588.
3，Lianos EA, Liu J, Guglielmi K.Quantification of changes in transfor-ming growth factor-beta1 gene&127;expression in experimental crescentic glomerulonephritis. Proc Soc Exp Biol Med, 1997, 214:180-186.
4，Coker RK, Laurent GJ, Shahzeidi S, et al.Diverse cellular TGF-beta1 and TGF-beta3 gene expression in normal human and murine lung. Eur Respir J, 1996,9:2501-2507.
(收稿日期：1999-10-21), http://www.100md.com
单位：110001 沈阳，中国医科大学呼吸疾病研究所
关键词：
中华内科杂志000918 在多种纤维增生性疾病中，转化生长因子(TGF)-β表现出共同的促纤维化作用，尤其是TGF-β1 在肺纤维化过程中起重要作用。TGF-β1和许多细胞因子一样，它是多细胞源性细胞因子，肺泡巨噬细胞(AM)源细胞因子在肺纤维化中的作用研究较多，而间质巨噬细胞(IM)源TGF-β1 mRNA 表达鲜有报道。我们在既往提出的TGF-β1组化染色定位的基础上[1]，用逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)从时空变化上分析博莱霉素致肺纤维化大鼠AM、IM及肺组织TGF-β1 mRNA的表达，从基因水平上探讨TGF-β1在肺纤维化中的作用。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.肺纤维化动物模型的建立及分组：健康雌性Wistar大鼠40只，随机分为2组，(1)博莱霉素组：25只， 经穿刺向气管内注入含5 mg/kg博莱霉素A5(天津河北制药厂) 的生理盐水0.2～0.3 ml；(2)对照组：15只，在同样条件下向气管内注入等体积的生理盐水。两组动物分别于气管灌注后的第1、3、7、14、28天随机处死5只(博莱霉素组)和3只(对照组)。
2.AM和IM的分离与纯化：右肺用PBS(4℃，含0.6 mmol/L EDTA，pH 7.4) 行支气管肺泡灌洗(5 ml×8),回收液离心(4℃，400g×10 min)，收集细胞用以分离AM。将反复冲洗后的右肺剪碎、研磨，洗涤3次，用含胶原酶ⅠA(175 U/ml,DNAse 0.01%,10% FCS ；Sigma)的PBS消化液，于37℃水浴振荡消化1h，用RPMI-1640反复洗涤、过滤(30 μm)，离心2次，收集细胞用以分离IM。将细胞团用含10%FCS的RPMI-1640悬浮，经37℃，5%CO2，100%饱和水蒸汽，在细胞培养箱内纯化2 h，用于RNA提取[2]。左肺于液氮冻存，用于RNA提取。
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3.RNA的提取：用总RNA提取试剂盒(美国Promega 公司)改良RNA提取方案。
4.RT-PCR检测TGF-β1 mRNA的表达：引物购自上海生物工程有限公司，TGF-β1有义链为5′-GCTAATGGTGGACCGC-AAC-3′，反义链为5′-GCAGTGAGCACTGAAGCGA-3′。内对照GAPDH，其有义链为5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGA-3′，反义链为5′-CACAGTCTTCTGAGTGGCA-3′。所需试剂购自美国Promega 公司。 扩增条件为： 48℃，45 min反转录；94℃预变性2 min，然后94℃ 30 s，60℃ 1 min，72℃ 2 min， 72℃延伸7 min，于PCR扩增仪(美国PE公司9600型)扩增共30个循环，扩增产物分别为340 bp和298 bp。然后于2%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ ml溴化乙锭)中电泳， GDS800凝胶成像及分析系统(英国UVP公司)下扫描分析，TGF-β1 mRNA的相对含量用 TGF-β1与GAPDH吸光度×面积的比值表示[3]。
, 百拇医药
5.统计学方法：数据用
±s表示， 非配对t检验及相关分析。二、结果
1. AM、IM和肺组织TGF-β1 mRNA表达的动态变化：见表1。
2.AM与肺组织释放TGF-β1 mRNA呈正相关 (r=0.78, P<0.01)，而IM与肺组织释放TGF-β1 mRNA 无明显相关，说明AM可能是肺内TGF-β1 mRNA的主要来源。
讨论 TGF-β1是多细胞源性细胞因子，其在肺内的表达呈现明显的时空变化。肺实质内TGF-β1蛋白表达第7天达到高峰，而肺间质内TGF-β1蛋白表达第7天开始增多，第28天达强阳性[1]，两者的表达时相和水平呈现明显不同。Coker等[4]发现，TGF-β1 mRNA 在正常人和小鼠肺内主要位于支气管上皮细胞、AM、内皮细胞和间胚叶细胞。我所研究人员发现，TGF-β1 广泛分布于正常大鼠支气管上皮细胞、AM、支气管周围的结缔组织细胞、血管周围的结缔组织细胞和肺间质[1]。AM是肺泡腔内的常驻细胞，而IM则位于肺间质内，AM和IM在位置、形态、功能和表型上存在明显的区别[2],两者TGF-β1 mRNA的表达也存在时相和水平的不同。AM释放的TGF-β1 mRNA于第7天达到高峰，和肺组织释放的TGF-β1 mRNA呈正相关，而IM TGF-β1 mRNA的表达，从第7天开始增多，第28天达到高峰，和肺组织释放的TGF-β1 mRNA无明显相关，结合肺纤维化的病理变化，提示AM源TGF-β1 mRNA可能在肺泡炎阶段发挥重要作用，而肺内间质局部IM源TGF-β1 mRNA 可能在纤维化持续发展中发挥重要作用。
, 百拇医药
表1 AM、IM和肺组织TGF-β1 mRNA表达的动态变化(
±s) 组别鼠数
(只)
TGF-β1 mRNA
1 d
3 d
7 d
14 d
28 d
AM
博莱霉素组
, http://www.100md.com
25
0.98±
0.21
1.48±
0.28
2.10±
0.49△
1.36±
0.29
1.15±
0.30
对照组
, http://www.100md.com
15
0.97±
0.20
0.98±
0.18
0.91±
0.23
0.98±
0.15
1.08±
0.20
IM
博莱霉素组
, 百拇医药
25
0.98±
0.12
1.08±
0.18
1.23±
0.11
1.52±
0.18△
1.86±
0.28△
对照组
, http://www.100md.com
15
1.02±
0.10
0.90±
0.25
0.98±
0.15
1.02±
0.13
0.98±
0.17
肺组织
博莱霉素组
, 百拇医药
25
1.01±
0.15
1.24±
0.15
1.64±
0.18△
1.27±
0.24
1.04±
0.10
对照组
15
, http://www.100md.com
0.96±
0.10
0.91±
0.27
0.94±
0.16
1.04±
0.10
0.87±
0.28
注：P<0.05,△ P<0.01
肺纤维化过程中AM、IM TGF-β1 mRNA的高度表达，在激发肺泡炎和间质纤维化过程中起重要作用，提示应用基因治疗途径(如反义核糖核酸)，探求选择性地抑制及调节TGF-β1 mRNA的表达，可能有望在阻止炎症细胞的浸润、活化及影响肺纤维化进程方面获得有意义的结果。由于容易获得较纯的AM，其在肺纤维化过程中的作用得到了广泛研究，而IM则相对不易获得，其在致纤维化过程中的作用有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目( 39570332)
参考文献
1，马跃文, 佟振月, 侯显明. TGF-β1在博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织不同细胞表达的定量研究. 中国医科大学学报, 1998, 27: 467-471.
2，Johansson A, Lundborg M, Skold CM, et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997, 16:582-588.
3，Lianos EA, Liu J, Guglielmi K.Quantification of changes in transfor-ming growth factor-beta1 gene&127;expression in experimental crescentic glomerulonephritis. Proc Soc Exp Biol Med, 1997, 214:180-186.
4，Coker RK, Laurent GJ, Shahzeidi S, et al.Diverse cellular TGF-beta1 and TGF-beta3 gene expression in normal human and murine lung. Eur Respir J, 1996,9:2501-2507.
(收稿日期：1999-10-21), http://www.100md.com