狼疮性肾炎患者淋巴细胞白细胞介素-6受体(CD126与CDw130)分布的研究
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中华内科杂志 2000年第9期第39卷
作者：曾丽霞 孙林 叶任高 许韩师 余学清 孔庆瑜 周飞宇
单位：510080 广州,中山医科大学第一附属医院肾内科
关键词：狼疮性肾炎；淋巴细胞；流式细胞术
中华内科杂志000909 【摘要】 目的 了解狼疮性肾炎(LN)患者外周血淋巴细胞白细胞介素-6(IL-6)受体(CD126与CDw130)的分布情况及其意义。方法 采用流式细胞术结合微量全血双重荧光标记法检测LN患者CD+4、CD+8与CD+23淋巴细胞表面CD126与CDw130蛋白表达情况。结果 (1)与正常对照组(11例)比较，活动组(14例)与非活动组(10例)LN患者CD+4细胞百分数明显降低(均P<0.01)，CD+8细胞百分数显著增高(P<0.01；P<0.05)，CD+23细胞百分数在活动组明显升高(P<0.05)，在非活动组明显降低(P<0.01) ，三组CD+126细胞与CD+w130细胞百分数差异均无显著性 (P>0.05)。(2)与非活动组和正常组比较，活动组LN患者 CD+4CD+126与CD+4CD+w130的细胞百分数明显降低(P<0.05；P<0.01)，CD+23 CD+126与CD+23CD+w130的细胞百分数则明显增高(均P<0.05)；非活动组和正常组比较差异则无显著性 (P>0.05)；CD+8CD+126与CD+8CD+w130的细胞百分数，三组比较差异均无显著性 (P>0.05)。(3)活动组LN患者CD+23细胞表面CD126与CDw130表达呈正相关 (r=0.756，P<0.05)；非活动组和正常组CD+23细胞表面CD126与CDw130表达无显著相关性(r=0.376，P>0.05； r=0.256，P>0.05)。(4) LN患者CD+23细胞表面CD126、CDw130表达与SLE活动指数(SLEDAI)和淋巴细胞数减少有显著相关性(P<0.05，P<0.005)，但与受累脏器的数目和严重程度无相关性(P>0.05)，与血液ANA、抗dsDNA抗体及补体C3、C4减少亦无相关性(P>0.05)。结论 LN患者体内不仅存在B细胞过度活化，还存在T细胞亚群数量与功能紊乱；活动性LN患者还存在外周血淋巴细胞IL-6受体分布异常，即CD+4细胞CD126与CDw130表达低下，CD+23细胞CD126与CDw130表达增高，其中CD+23细胞CD126 与CDw130表达增高或许可作为LN患者疾病活动的指标之一。
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Distribution of interleukin-6 receptors (CD126 and CDw130) on circulating lymphocytes in patients with lupus nephritis
ZENG Lixia, SUN Lin, YE Rengao, et al.
Department of Nephrology, The First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China
【Abstract】 Objective To study the distribution of IL-6 receptors (CD126 and CDw130) on lymphocytes in patients with lupus nephritis(LN). Method The percentages of lymphocyte subsets were examined by direct two colour immunofluorescence on flow cytometry. Results (1) In active and inactive cases, the percentages of CD+4 cells obviously decreased as compared with the normal controls (P<0.01). Increased numbers of CD+8 cells could be detected in LN patients (P<0.05), especially in active cases (P<0.01). Lymphocytes of active cases contained significantly greater percentage of CD+23 cells than those of normal subjects (P<0.05). On the contrary,the percentage of CD+23 cells was statistically lower in the inactive cases than in normal subjects (P<0.01). No significant difference in the percentages of CD+126 and CD+w130 cells was observed among the active , inactive and healthy groups (P>0.05)； (2) The proportion of CD+4CD+126 and CD+4CD+w130 cells in total lymphocytes was significantly lower in the active than in the inactive ones or normal subjects (P<0.05；P<0.01), whereas that of CD+8CD+126 and CD+8CD+w130 cells was not different among the active, inactive and normal subjects (P>0.05). The proportion of CD+23CD+126 cells and CD+23CD+w130 cells augmented significantly in the active (P<0.05), whereas it lessened in the inactive without statistical meaning as compared with the normal subjects (P>0.05). (3) There was a postive correlation between the percentage of CD+23CD+126 cells and that of CD+23CD+w130 cells in total lymphocytes in the active group (r=0.756, P<0.05). However, no correlation between the percentage of CD+23CD+126 cells and that of CD+23CD+w130 cells in total lymphocytes was found in the inactive (r=0.376, P>0.05) or normal group (r=0.256, P>0.05); (4) The fraction of CD+23 cells expressing CD126 and CDw130 was related to the SLE disease activity index (SLEDAI) and lymphopenia (P<0.05, P<0.005). But it was neither associated with the number of damaged organs and the degree of damage, not with that of ANA、anti-dsDNA antibody and complements (C3 and C4) ( P>0.05). Conclusions LN patients present not only B cell hyperactivity but also T cell abnormality. In active cases, there is abnormal distribution of IL-6 receptors on lymphocytes: reduced CD126 and CDw130 expression on CD+4 cells and elevated CD126 and CDw130 expression on CD+23 cells. Detecting the proportion of CD+23CD+126 cells or CD+23 CD+w130 cells in total lymphocytes may serve as one of activity indexes for LN patients.
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【Key words】 Lupus nephritis; Lymphocytes; Flow cytometry
狼疮性肾炎(LN)的发病机制与T、B细胞功能异常，尤其与B细胞的多克隆激活产生过多自身抗体密切相关。研究表明, 白细胞介素-6(IL-6)可由T、B细胞生成，又可促进自身活化、增殖和分化以及促进B细胞分泌免疫球蛋白，在LN的发生、发展与转归中具有重要作用[1]。对于IL-6受体的两个成分即配体结合成分gp80 (又称α亚基或CD126)与信号传递成分 gp130(又称β亚基或CDw130)在SLE患者淋巴细胞表面的表达情况研究很少，迄今为止国外仅有3项，且结论不一，国内尚未见报道。Nagafuchi等[2]观察到部分活动性SLE患者B细胞共同表达gp80与gp130，而所有非活动者则仅表达gp80，但未作T细胞的研究；Kitani等[3]检测到活动性SLE患者T、B细胞均表达gp80，而非活动者则不表达gp80；Chan等[4]则认为SLE患者与正常人比较外周血淋巴细胞gp80表达水平差异无显著性[4]；Hara和Chan等学者未作gp130的研究。这些研究结果不一致的原因，估计与体外分离T、B细胞操作有关，而且均为定性研究。作者利用流式细胞术结合微量全血双重荧光标记法观察了24例LN患者各淋巴细胞亚群(CD+4、CD+8和CD+23)CD126与CDw130的蛋白表达水平，以了解LN患者外周血淋巴细胞IL-6受体的分布情况及其意义。
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材料与方法
一、材料
1.LN病例： 按1982年美国风湿病协会制定的判断标准确诊为SLE且伴有肾炎表现者24例，其中活动组14例，男1例，女13例，年龄17～53岁，平均年龄(30.2±10.7)岁；非活动组10例，男1例，女9例，年龄20～51岁，平均年龄 (29.7±10.1) 岁，活动性判断采用SLEDAI标准，各相关实验指标由本院检验科测定。另选取与患者年龄、性别构成相匹配的健康人员11例作对照组，男1例，女10例，年龄19～50岁，平均年龄 (32.1±9.2) 岁。LN患者检测前1个月未用免疫抑制剂或甲基泼尼松龙，检测前24 h口服泼尼松(龙)，剂量为每日0～60 mg。活动组和非活动组LN患者在年龄、性别构成及口服泼尼松(龙)剂量方面差异无显著性。
2.主要试剂：PE标记的抗人CD126单抗(小鼠IgG1)、PE 标记的小鼠IgG1、FITC标记的抗人CD4单抗(小鼠IgG1)、FITC标记的抗人CD8单抗(小鼠IgG1)和 FITC标记的小鼠IgG1均购于法国Immuno Tech SA公司，PE标记的抗人CDw130单抗(小鼠IgG1)和FITC标记的抗人CD23单抗(小鼠IgG1)分别购于美国Pharmingenhe和丹麦Dako公司，红细胞溶解液、固定液与洗涤液均购于美国Coulter公司。
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二、方法
1.各淋巴细胞亚群CD126与CDw130检测： 用微量全血直接双标记荧光染色法及流式细胞仪(EPICS ELITE,Coulter,USA)检测。即分别于100 μl肝素钠抗凝血加入荧光(PE/FITC)标记单抗各20 μl(正常小鼠IgG1为空白对照)，振荡摇匀，室温(18～25 ℃)下避光反应15～20 min，加红细胞溶解液1 ml，振匀后置室温避光10 min，立即加入250 μl固定液，震荡摇匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再以含0.1%叠氮钠的PBS 3 ml清洗1次，弃上清，细胞悬浮于400 μl PBS中，上流式细胞仪检测，以前向及侧向光散射“开窗”于淋巴细胞，以空白对照设游标，每次样品收集5 000个淋巴细胞进行分析。
2.统计学分析：所有数据应用SPSS 6.0统计软件处理。计量资料以均数±标准差表达,采用t检验、χ2检验及直线回归相关分析作统计学处理，P<0.05代表有显著意义。
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结果
一、LN患者淋巴细胞亚群检测
见表1。CD+4 细胞在活动组与非活动组中均较正常组明显降低(均P<0.01)，CD+8 细胞在上述两组中均显著高于正常组(P<0.01，P<0.05)，CD+23 细胞活动组明显高于正常组(P<0.05)，非活动组明显低于正常组(P<0.01)。三组比较，CD+126 细胞与CD+w130 细胞百分数差异均无显著性 (P>0.05)。
表1 狼疮性肾炎患者淋巴细胞亚群检测结果 (%，
±s) 组别
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例数
CD+4
CD+8
CD+23
CD+126
CDw130
活动组
14
28.0±
10.1**
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42.1±
9.3**
6.2±
1.9*
6.0±
2.0
16.3±
7.7
非活动组
10
32.3±
9.5**
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34.4±
9.8*△
2.5±
0.9(**)/(△△)
6.5±
1.7
14.6±
7.2
正常对
照组
11
54.9±
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16.0
28.2±
8.1
4.5±
1.7
5.9±
1.8
15.9±
6.3
与正常对照组比较, *P<0.05, **P<0.01；非活动组与活动组比较, △P<0.05,△△P<0.001
二、LN患者各细胞亚群CD126与CDw130检测
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见表2。CD+4CD+126与CD+4CD+w130 细胞数在活动组中均明显降低(P<0.05，P<0.01)，非活动组与正常组差异无显著性 (均P>0.05)，三组CD+8CD+126与CD+8CD+w130 细胞数差异均无显著性 (均P>0.05)；CD+23CD+126与CD+4CD+w130 细胞数在活动组中均明显增高(P<0.01，P<0.05)，在非活动组中均降低，但与正常组比较差异无显著性 (均P>0.05)。
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三、LN患者CD+23 细胞表面CD126与CDw130表达的相关性分析
活动组CD+23 细胞表面CD126与CDw130表达有显著相关性(r=0.756，P<0.05)，非活动组和正常组CD+23 细胞表面CD126与CDw130表达则无显著相关性(r=0.376，P>0.05；r=0.256，P>0.05)。
四、LN患者CD+23 细胞表面CD126、CDw130的表达与SLEDAI、受累脏器及免疫学指标的关系
活动性LN患者CD+23细胞表面CD126、 CDw130的表达与SLEDAI和淋巴细胞数减少呈显著相关性(P<0.05，P<0.005)，但与受累脏器的数目和严重程度则无相关性(P>0.05)，与ANA、抗dsDNA抗体以及补体C3、C4亦无相关性(P>0.05)(图1～8)。
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讨论
SLE患者外周血T细胞亚群有异常改变，但这种改变在不同表现的狼疮患者中是不同的，甚至呈截然相反的结果。Smolen等[5]分析了32例SLE患者T细胞亚群的变化，发现以肾脏受累和血小板减少为主要表现的患者，主要是总T细胞及Th细胞明显减少，Ts细胞并无变化，结果导致CD+4/CD+8 比值降低，而以脑、肺、肌肉受累为主者，该比值增高。毕黎琦等[6]则发现T4/T8比值为降低者，肾损害发生频率较高，蛋白尿也较严重，但他们未做B细胞表面标志的检测。我们选择以肾炎为主要表现的狼疮病人为研究对象，发现活动者与非活动者CD+4 细胞均降低，前者降低幅度更加显著；活动者CD+8与CD+23 细胞均增高，非活动者CD+23 细胞减少。一般认为，CD4是辅助性/诱导性T细胞的表面标志，似为MHCⅡ抗原的受体；CD8是细胞毒性/抑制性T细胞表面标志，似为MHCⅠ抗原的受体。CD4与CD8通过直接结合细胞表面MHC分子，而增强细胞间亲和力以介导免疫反应。CD23首先作为B细胞特异性活化抗原，促使B细胞转化成分泌免疫球蛋白的浆细胞，在静止或不成熟的B细胞与T细胞表面则极少表达，但CD23在B细胞发生类型转换或进一步活化后很快被下调[7]。这说明LN患者不仅存在B细胞过度活化，还存在T细胞亚群数量及功能紊乱。至于CD+4 与CD+8 比值降低的原因，推测与体内T细胞过度激活后消耗有关，也有认为与抗淋巴细胞抗体增多或细胞凋亡增多有关联，但其真正原因尚不太清楚。
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近年来，IL-6在人类多发性骨髓瘤中的自分泌作用已得到充分肯定[1]。IL-6由瘤细胞不断生成与分泌，瘤细胞本身也高表达IL-6受体，从而无限制地促进浆细胞增殖并分泌免疫球蛋白。IL-6转基因小鼠也表现为多克隆高丙种球蛋白血症与系膜增殖性肾炎[1]。对于狼疮发病机制中是否存在IL-6自分泌和(或)旁分泌，尚无统一结论。我们研究结果表明，虽然CD126、CDw130在LN患者外周血淋巴细胞表达相对值与正常人无异，并与Chan等[4]人结果相一致，但我们进一步研究了各淋巴细胞亚群CD126和CDw130的分布情况，首次发现CD126与CDw130在活动性LN患者CD+23 细胞表面的表达增加，在CD+4 细胞表面并非不表达，但表达水平是非常低下的。作者等[8]曾报道外周血单个核细胞在活动性LN患者体内高效表达IL-6 ，因而推测活动性LN患者外周血中已被活化的B细胞对T细胞或B细胞自身来源的IL-6具有高反应性，T细胞则表现低反应性。B细胞的高激活状态所造成各种自身抗体分泌过多，不仅与Th细胞增殖与活化后过度产生的IL-6密切相关，还与淋巴细胞表面CD126和CDw130的分布异常密切相关。
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表2 狼疮性肾炎患者各淋巴细胞亚群CD+126与CD+w130检测结果 (%，±s) 组别
例数
CD+4
CD+8
CD+23
CD+126
CD+w130
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CD+126
CD+w130
CD+126
CD+w130
活动组
14
3.3±1.9*
0.9±0.4**
3.6±1.3
5.8±3.1
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1.1±0.4**
6.5±3.2*△
非活动组
10
5.0±2.2
1.8±1.0
3.7±1.1
5.8±2.9
0.1±0.0
5.7±1.1
正常对照组
11
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4.9±2.3
1.7±0.9
3.5±0.9
6.0±3.2
0.2±0.1
5.8±2.0
与正常对照组比较,*P<0.05, **P<0.01；非活动组与活动组比较, △P<0.01 IL-6生物作用不仅与其自身结构有关，而且在很大程度上受其受体α亚基(CD126)与β亚基(CDw130)所组成的独特结构所决定[9]。IL-6可与细胞表面α亚基胞外区结合，但只有再与β亚基偶联，激发后者的信号传导能力才能够形成高亲合力的IL-6Rs[10]。本研究揭示，正常人与非活动性LN患者淋巴细胞IL-6 Rs的2个亚基表达不完全一致，而活动性LN患者CD+23 细胞表面CD+126 与CDw130表达密切相关，这从另一角度说明狼疮活动时患者体内细胞IL-6/IL-6 Rs系统已被激活，从而导致B细胞产生多种自身抗体。然而，本研究结果未提示活动性LN患者淋巴细胞IL-6 Rs分布异常与血液自身抗体或补体水平有密切关系，可能是因为血液自身抗体或补体水平不仅与其生成或消耗有关，还与机体对其清除或在靶器官的沉积等有关，也可能与CD+126 与CDw130在淋巴细胞表面表达后脱落以可溶性形式存在于血浆中有关。
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CD126与CDw130在活动性LN患者CD+23 细胞表面的表达增加，且与狼疮活动指数(SLEDAI)密切相关，但与累及脏器的数目和脏器受累的程度无关，提示检测CD+126 和CD+w130 的CD+23 细胞百分数在判断SLE病情活动具有重要价值，但不能作为疾病严重程度和脏器受累情况的指标。这可能与局部过多产生的IL-6和受累脏器IL-6受体的分布情况更能反映受累脏器的状况有关[1]。因此，了解受累脏器如肾、脑等IL-6受体的分布情况也是一个值得研究的课题。总之，LN患者体内存在淋巴细胞亚群数量与功能异常，其中涉及IL-6异常分泌与IL-6 Rs异常分布。这种异常是疾病的原因还是后果，调整这种异常对治疗有什么价值，尚值得进一步探讨。
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图1 正常人外周血淋巴细胞表面CD4与CD126表达的流式细胞仪检测(FITC-CD4单抗与PE-CD126单抗直接荧光双染) 图2 活动期LN患者外周血淋巴细胞表面CD4与CD126表达的流式细胞仪检测(FITC-CD4单抗与PE-CD126单抗直接荧光双染) 图3 正常人外周血淋巴细胞表面CD4与CDw130表达的流式细胞仪检测(FITC-CD4单抗与PE-CDw130单抗直接荧光双染) 图4 活动期LN患者外周血淋巴细胞表面CD4与CDw130表达的流式细胞仪检测(FITC-CD4单抗与PE-CDw130单抗直接荧光双染) 图5 正常人外周血淋巴细胞表面CD23与CD126表达的流式细胞仪检测(FITC-CD23单抗与PE-CD126单抗直接荧光双染) 图6 活动期LN患者外周血淋巴细胞表面CD23与CD126表达的流式细胞仪检测(FITC-CD23单抗与PE-CD126单抗直接荧光双染) 图7 正常人外周血淋巴细胞表面CD23与CDw130表达的流式细胞仪检测(FITC-CD23单抗与PE-CDw130单抗直接荧光双染) 图8 活动期LN患者外周血淋巴细胞表面CD23与CDw130表达的流式细胞仪检测(FITC-CD23单抗与PE-CDw130单抗直接荧光双染)
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参考文献
1，Hirano T. Interleukin-6 and its relation to inflammation and disease. Clin Immunol Immuno Pathol,1992,62:S60-65.
2，Nagafuchi H,Suzuki N,Mizushima Y,et al.Constitutive expression of IL-6 receptors and their role in the excessive B cell funtion in patients with systemic lupus erythematosus .J Immunol, 1993,151:6525-6534.
3，Kitani A, Hara M,Hirose T,et al.Autostimulatory effects of IL-6 on excessive B cell differentiation in patients with systemic lupus erythematosus:analysis of IL-6 production and IL-6R expression.Clin Exp Immunol, 1992,88:75-83.
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4，Chan EY,Lau CS,Zola H.Expression of IL-2R,IL-4R,IL-6R on peripheral blood lymphocytes in systemic lupus erythematosus and correlation with disease activity:a prospective study. J Clin Pathol, 1996,49:660-663.
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6，毕黎琦,张英平,刘继文,等.免疫调节T细胞的检测在LN诊治中的意义. 中国实验临床免疫学杂志, 1996,8:34-36.
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8，曾丽霞,叶任高,孙林,等. 外周血单个核细胞在狼疮性肾炎患者体内高效表达IL-6的观察. 中华微生物和免疫学杂志,1997,17：442-445.
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10，Wijdenes J,Heinrich PC,Muller-Newen G,et al. Interleukin-6 signal transducer gp130 has specific binding sites for different cytokines as determined by antagonistic and agonistic anti-gp130 monoclonal antibodies. Eur J Immunol, 1995,25:3474-3481.
(收稿日期：1999-10-13), http://www.100md.com
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Distribution of interleukin-6 receptors (CD126 and CDw130) on circulating lymphocytes in patients with lupus nephritis
ZENG Lixia, SUN Lin, YE Rengao, et al.
Department of Nephrology, The First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China
【Abstract】 Objective To study the distribution of IL-6 receptors (CD126 and CDw130) on lymphocytes in patients with lupus nephritis(LN). Method The percentages of lymphocyte subsets were examined by direct two colour immunofluorescence on flow cytometry. Results (1) In active and inactive cases, the percentages of CD+4 cells obviously decreased as compared with the normal controls (P<0.01). Increased numbers of CD+8 cells could be detected in LN patients (P<0.05), especially in active cases (P<0.01). Lymphocytes of active cases contained significantly greater percentage of CD+23 cells than those of normal subjects (P<0.05). On the contrary,the percentage of CD+23 cells was statistically lower in the inactive cases than in normal subjects (P<0.01). No significant difference in the percentages of CD+126 and CD+w130 cells was observed among the active , inactive and healthy groups (P>0.05)； (2) The proportion of CD+4CD+126 and CD+4CD+w130 cells in total lymphocytes was significantly lower in the active than in the inactive ones or normal subjects (P<0.05；P<0.01), whereas that of CD+8CD+126 and CD+8CD+w130 cells was not different among the active, inactive and normal subjects (P>0.05). The proportion of CD+23CD+126 cells and CD+23CD+w130 cells augmented significantly in the active (P<0.05), whereas it lessened in the inactive without statistical meaning as compared with the normal subjects (P>0.05). (3) There was a postive correlation between the percentage of CD+23CD+126 cells and that of CD+23CD+w130 cells in total lymphocytes in the active group (r=0.756, P<0.05). However, no correlation between the percentage of CD+23CD+126 cells and that of CD+23CD+w130 cells in total lymphocytes was found in the inactive (r=0.376, P>0.05) or normal group (r=0.256, P>0.05); (4) The fraction of CD+23 cells expressing CD126 and CDw130 was related to the SLE disease activity index (SLEDAI) and lymphopenia (P<0.05, P<0.005). But it was neither associated with the number of damaged organs and the degree of damage, not with that of ANA、anti-dsDNA antibody and complements (C3 and C4) ( P>0.05). Conclusions LN patients present not only B cell hyperactivity but also T cell abnormality. In active cases, there is abnormal distribution of IL-6 receptors on lymphocytes: reduced CD126 and CDw130 expression on CD+4 cells and elevated CD126 and CDw130 expression on CD+23 cells. Detecting the proportion of CD+23CD+126 cells or CD+23 CD+w130 cells in total lymphocytes may serve as one of activity indexes for LN patients.
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【Key words】 Lupus nephritis; Lymphocytes; Flow cytometry
狼疮性肾炎(LN)的发病机制与T、B细胞功能异常，尤其与B细胞的多克隆激活产生过多自身抗体密切相关。研究表明, 白细胞介素-6(IL-6)可由T、B细胞生成，又可促进自身活化、增殖和分化以及促进B细胞分泌免疫球蛋白，在LN的发生、发展与转归中具有重要作用[1]。对于IL-6受体的两个成分即配体结合成分gp80 (又称α亚基或CD126)与信号传递成分 gp130(又称β亚基或CDw130)在SLE患者淋巴细胞表面的表达情况研究很少，迄今为止国外仅有3项，且结论不一，国内尚未见报道。Nagafuchi等[2]观察到部分活动性SLE患者B细胞共同表达gp80与gp130，而所有非活动者则仅表达gp80，但未作T细胞的研究；Kitani等[3]检测到活动性SLE患者T、B细胞均表达gp80，而非活动者则不表达gp80；Chan等[4]则认为SLE患者与正常人比较外周血淋巴细胞gp80表达水平差异无显著性[4]；Hara和Chan等学者未作gp130的研究。这些研究结果不一致的原因，估计与体外分离T、B细胞操作有关，而且均为定性研究。作者利用流式细胞术结合微量全血双重荧光标记法观察了24例LN患者各淋巴细胞亚群(CD+4、CD+8和CD+23)CD126与CDw130的蛋白表达水平，以了解LN患者外周血淋巴细胞IL-6受体的分布情况及其意义。
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材料与方法
一、材料
1.LN病例： 按1982年美国风湿病协会制定的判断标准确诊为SLE且伴有肾炎表现者24例，其中活动组14例，男1例，女13例，年龄17～53岁，平均年龄(30.2±10.7)岁；非活动组10例，男1例，女9例，年龄20～51岁，平均年龄 (29.7±10.1) 岁，活动性判断采用SLEDAI标准，各相关实验指标由本院检验科测定。另选取与患者年龄、性别构成相匹配的健康人员11例作对照组，男1例，女10例，年龄19～50岁，平均年龄 (32.1±9.2) 岁。LN患者检测前1个月未用免疫抑制剂或甲基泼尼松龙，检测前24 h口服泼尼松(龙)，剂量为每日0～60 mg。活动组和非活动组LN患者在年龄、性别构成及口服泼尼松(龙)剂量方面差异无显著性。
2.主要试剂：PE标记的抗人CD126单抗(小鼠IgG1)、PE 标记的小鼠IgG1、FITC标记的抗人CD4单抗(小鼠IgG1)、FITC标记的抗人CD8单抗(小鼠IgG1)和 FITC标记的小鼠IgG1均购于法国Immuno Tech SA公司，PE标记的抗人CDw130单抗(小鼠IgG1)和FITC标记的抗人CD23单抗(小鼠IgG1)分别购于美国Pharmingenhe和丹麦Dako公司，红细胞溶解液、固定液与洗涤液均购于美国Coulter公司。
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二、方法
1.各淋巴细胞亚群CD126与CDw130检测： 用微量全血直接双标记荧光染色法及流式细胞仪(EPICS ELITE,Coulter,USA)检测。即分别于100 μl肝素钠抗凝血加入荧光(PE/FITC)标记单抗各20 μl(正常小鼠IgG1为空白对照)，振荡摇匀，室温(18～25 ℃)下避光反应15～20 min，加红细胞溶解液1 ml，振匀后置室温避光10 min，立即加入250 μl固定液，震荡摇匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再以含0.1%叠氮钠的PBS 3 ml清洗1次，弃上清，细胞悬浮于400 μl PBS中，上流式细胞仪检测，以前向及侧向光散射“开窗”于淋巴细胞，以空白对照设游标，每次样品收集5 000个淋巴细胞进行分析。
2.统计学分析：所有数据应用SPSS 6.0统计软件处理。计量资料以均数±标准差表达,采用t检验、χ2检验及直线回归相关分析作统计学处理，P<0.05代表有显著意义。
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结果
一、LN患者淋巴细胞亚群检测
见表1。CD+4 细胞在活动组与非活动组中均较正常组明显降低(均P<0.01)，CD+8 细胞在上述两组中均显著高于正常组(P<0.01，P<0.05)，CD+23 细胞活动组明显高于正常组(P<0.05)，非活动组明显低于正常组(P<0.01)。三组比较，CD+126 细胞与CD+w130 细胞百分数差异均无显著性 (P>0.05)。
表1 狼疮性肾炎患者淋巴细胞亚群检测结果 (%，
±s) 组别, http://www.100md.com
例数
CD+4
CD+8
CD+23
CD+126
CDw130
活动组
14
28.0±
10.1**
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42.1±
9.3**
6.2±
1.9*
6.0±
2.0
16.3±
7.7
非活动组
10
32.3±
9.5**
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34.4±
9.8*△
2.5±
0.9(**)/(△△)
6.5±
1.7
14.6±
7.2
正常对
照组
11
54.9±
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16.0
28.2±
8.1
4.5±
1.7
5.9±
1.8
15.9±
6.3
与正常对照组比较, *P<0.05, **P<0.01；非活动组与活动组比较, △P<0.05,△△P<0.001
二、LN患者各细胞亚群CD126与CDw130检测
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见表2。CD+4CD+126与CD+4CD+w130 细胞数在活动组中均明显降低(P<0.05，P<0.01)，非活动组与正常组差异无显著性 (均P>0.05)，三组CD+8CD+126与CD+8CD+w130 细胞数差异均无显著性 (均P>0.05)；CD+23CD+126与CD+4CD+w130 细胞数在活动组中均明显增高(P<0.01，P<0.05)，在非活动组中均降低，但与正常组比较差异无显著性 (均P>0.05)。
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三、LN患者CD+23 细胞表面CD126与CDw130表达的相关性分析
活动组CD+23 细胞表面CD126与CDw130表达有显著相关性(r=0.756，P<0.05)，非活动组和正常组CD+23 细胞表面CD126与CDw130表达则无显著相关性(r=0.376，P>0.05；r=0.256，P>0.05)。
四、LN患者CD+23 细胞表面CD126、CDw130的表达与SLEDAI、受累脏器及免疫学指标的关系
活动性LN患者CD+23细胞表面CD126、 CDw130的表达与SLEDAI和淋巴细胞数减少呈显著相关性(P<0.05，P<0.005)，但与受累脏器的数目和严重程度则无相关性(P>0.05)，与ANA、抗dsDNA抗体以及补体C3、C4亦无相关性(P>0.05)(图1～8)。
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讨论
SLE患者外周血T细胞亚群有异常改变，但这种改变在不同表现的狼疮患者中是不同的，甚至呈截然相反的结果。Smolen等[5]分析了32例SLE患者T细胞亚群的变化，发现以肾脏受累和血小板减少为主要表现的患者，主要是总T细胞及Th细胞明显减少，Ts细胞并无变化，结果导致CD+4/CD+8 比值降低，而以脑、肺、肌肉受累为主者，该比值增高。毕黎琦等[6]则发现T4/T8比值为降低者，肾损害发生频率较高，蛋白尿也较严重，但他们未做B细胞表面标志的检测。我们选择以肾炎为主要表现的狼疮病人为研究对象，发现活动者与非活动者CD+4 细胞均降低，前者降低幅度更加显著；活动者CD+8与CD+23 细胞均增高，非活动者CD+23 细胞减少。一般认为，CD4是辅助性/诱导性T细胞的表面标志，似为MHCⅡ抗原的受体；CD8是细胞毒性/抑制性T细胞表面标志，似为MHCⅠ抗原的受体。CD4与CD8通过直接结合细胞表面MHC分子，而增强细胞间亲和力以介导免疫反应。CD23首先作为B细胞特异性活化抗原，促使B细胞转化成分泌免疫球蛋白的浆细胞，在静止或不成熟的B细胞与T细胞表面则极少表达，但CD23在B细胞发生类型转换或进一步活化后很快被下调[7]。这说明LN患者不仅存在B细胞过度活化，还存在T细胞亚群数量及功能紊乱。至于CD+4 与CD+8 比值降低的原因，推测与体内T细胞过度激活后消耗有关，也有认为与抗淋巴细胞抗体增多或细胞凋亡增多有关联，但其真正原因尚不太清楚。
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近年来，IL-6在人类多发性骨髓瘤中的自分泌作用已得到充分肯定[1]。IL-6由瘤细胞不断生成与分泌，瘤细胞本身也高表达IL-6受体，从而无限制地促进浆细胞增殖并分泌免疫球蛋白。IL-6转基因小鼠也表现为多克隆高丙种球蛋白血症与系膜增殖性肾炎[1]。对于狼疮发病机制中是否存在IL-6自分泌和(或)旁分泌，尚无统一结论。我们研究结果表明，虽然CD126、CDw130在LN患者外周血淋巴细胞表达相对值与正常人无异，并与Chan等[4]人结果相一致，但我们进一步研究了各淋巴细胞亚群CD126和CDw130的分布情况，首次发现CD126与CDw130在活动性LN患者CD+23 细胞表面的表达增加，在CD+4 细胞表面并非不表达，但表达水平是非常低下的。作者等[8]曾报道外周血单个核细胞在活动性LN患者体内高效表达IL-6 ，因而推测活动性LN患者外周血中已被活化的B细胞对T细胞或B细胞自身来源的IL-6具有高反应性，T细胞则表现低反应性。B细胞的高激活状态所造成各种自身抗体分泌过多，不仅与Th细胞增殖与活化后过度产生的IL-6密切相关，还与淋巴细胞表面CD126和CDw130的分布异常密切相关。
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表2 狼疮性肾炎患者各淋巴细胞亚群CD+126与CD+w130检测结果 (%，
±s) 组别例数
CD+4
CD+8
CD+23
CD+126
CD+w130
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CD+126
CD+w130
CD+126
CD+w130
活动组
14
3.3±1.9*
0.9±0.4**
3.6±1.3
5.8±3.1
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1.1±0.4**
6.5±3.2*△
非活动组
10
5.0±2.2
1.8±1.0
3.7±1.1
5.8±2.9
0.1±0.0
5.7±1.1
正常对照组
11
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4.9±2.3
1.7±0.9
3.5±0.9
6.0±3.2
0.2±0.1
5.8±2.0
与正常对照组比较,*P<0.05, **P<0.01；非活动组与活动组比较, △P<0.01 IL-6生物作用不仅与其自身结构有关，而且在很大程度上受其受体α亚基(CD126)与β亚基(CDw130)所组成的独特结构所决定[9]。IL-6可与细胞表面α亚基胞外区结合，但只有再与β亚基偶联，激发后者的信号传导能力才能够形成高亲合力的IL-6Rs[10]。本研究揭示，正常人与非活动性LN患者淋巴细胞IL-6 Rs的2个亚基表达不完全一致，而活动性LN患者CD+23 细胞表面CD+126 与CDw130表达密切相关，这从另一角度说明狼疮活动时患者体内细胞IL-6/IL-6 Rs系统已被激活，从而导致B细胞产生多种自身抗体。然而，本研究结果未提示活动性LN患者淋巴细胞IL-6 Rs分布异常与血液自身抗体或补体水平有密切关系，可能是因为血液自身抗体或补体水平不仅与其生成或消耗有关，还与机体对其清除或在靶器官的沉积等有关，也可能与CD+126 与CDw130在淋巴细胞表面表达后脱落以可溶性形式存在于血浆中有关。
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CD126与CDw130在活动性LN患者CD+23 细胞表面的表达增加，且与狼疮活动指数(SLEDAI)密切相关，但与累及脏器的数目和脏器受累的程度无关，提示检测CD+126 和CD+w130 的CD+23 细胞百分数在判断SLE病情活动具有重要价值，但不能作为疾病严重程度和脏器受累情况的指标。这可能与局部过多产生的IL-6和受累脏器IL-6受体的分布情况更能反映受累脏器的状况有关[1]。因此，了解受累脏器如肾、脑等IL-6受体的分布情况也是一个值得研究的课题。总之，LN患者体内存在淋巴细胞亚群数量与功能异常，其中涉及IL-6异常分泌与IL-6 Rs异常分布。这种异常是疾病的原因还是后果，调整这种异常对治疗有什么价值，尚值得进一步探讨。
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图1 正常人外周血淋巴细胞表面CD4与CD126表达的流式细胞仪检测(FITC-CD4单抗与PE-CD126单抗直接荧光双染) 图2 活动期LN患者外周血淋巴细胞表面CD4与CD126表达的流式细胞仪检测(FITC-CD4单抗与PE-CD126单抗直接荧光双染) 图3 正常人外周血淋巴细胞表面CD4与CDw130表达的流式细胞仪检测(FITC-CD4单抗与PE-CDw130单抗直接荧光双染) 图4 活动期LN患者外周血淋巴细胞表面CD4与CDw130表达的流式细胞仪检测(FITC-CD4单抗与PE-CDw130单抗直接荧光双染) 图5 正常人外周血淋巴细胞表面CD23与CD126表达的流式细胞仪检测(FITC-CD23单抗与PE-CD126单抗直接荧光双染) 图6 活动期LN患者外周血淋巴细胞表面CD23与CD126表达的流式细胞仪检测(FITC-CD23单抗与PE-CD126单抗直接荧光双染) 图7 正常人外周血淋巴细胞表面CD23与CDw130表达的流式细胞仪检测(FITC-CD23单抗与PE-CDw130单抗直接荧光双染) 图8 活动期LN患者外周血淋巴细胞表面CD23与CDw130表达的流式细胞仪检测(FITC-CD23单抗与PE-CDw130单抗直接荧光双染)
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参考文献
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(收稿日期：1999-10-13), http://www.100md.com