细胞凝聚区的形成在C57BL/6N系小鼠下颌骨发育中的作用意义
作者：李 鑫 金 岩 董绍忠 朱萧玲
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：细胞凝聚；细胞程序性死亡；下颌骨
实用口腔医学杂志990117 〔摘要〕 目的：观察胚胎早期间充质细胞增殖、分化的改变，明确下颌骨在胚胎早期由细胞凝聚到定向分化成成骨细胞而发育形成的过程。方法：用免疫组化及TUNEL染色等方法，检测了胚龄13～19d及出生1d的小鼠下颌骨中未分化间充质细胞增殖、细胞程序性死亡(PCD)及表型转化的生物学改变。结果：胚龄13～15d，间充质细胞开始凝聚形成下颌骨始基并迅速增殖。胚龄16～19d，凝聚区细胞明显向成骨细胞表型转化并开始成骨。麦克尔软骨消失。结论：下颌骨的发育始于胚胎间充质细胞的局部凝聚，大部分细胞经历了快速增殖后逐渐分化成熟，少量细胞出现PCD以清除病变或非必需细胞并与麦克尔软骨的发生及退化有密切关系。
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The role of cell condensation in mandibular development in C57 BL/6N mouse
Li Xin， Jin Yan， Dong Shaozhong，et al.
Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi' an 710032
〔Abstract〕 Objective: To study the proliferation and differentiation of mesenchymal cells and the role of cell condensation in mandibular development during early embro stage. Methods: IHC and TUNEL staining technics were used to study the proliferation, condensation and differentiation of mesenchymal cells in palatal processes during embryonic period of 13～19 days and 1 day after birth of C57 BL/6N mice. Result: Proliferation and condensation of mesenchymal cells were observed in the embryo samples of 13～15 days of the embryos, while osteoblast-like cells and osseous tissue were observed in those of 16～19 days when Meckel cartilage could not be found. Conclusion: Mandibular development may be based on the condensation of mesenchymal cells in palatal processes when the cells proliferate rapidly and differentiate into osteoblasts. The formation and degeneration of Meckel cartilage may be related to the process.
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Key words Cell condensation; Programmed cell death; Mandible
下颌骨是全身骨骼发育中较为特殊的组织，它以早其一步形成的麦克尔软骨为支架，逐渐以膜内成骨的方式发育而成。现代观点认为，细胞凝聚区的形成、演变是胚胎发育早期组织器官形态发生的基础[1,2]。本研究采用C57BL/6N近交系小鼠标本，用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化、细胞程序性死亡及改良银染色检测方法，探讨了小鼠胚胎早期下颌骨发育中腭突间充质细胞的增殖、分化及程序性死亡的变化。
1 材料和方法
1.1标本制备 见参考文献[3]。
1.2改良银染色 同一编号的切片常规脱蜡至水，在50g/LAgNO3水溶液浸45min，暴露于强光下，蒸馏水漂洗20min，5g/LNa2S2O3.5H2O水溶液消除多余的钙离子，体积分数为0.3%番红花T水溶液衬染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。
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1.3免疫组化染色 PCNA单抗购自Dako公司，常规ABC法染色，DAB显色，苏木精衬染。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.4TUNEL染色 见参考文献[3](选同一编号的切片)。
1.5免疫组化、TUNEL染色的结果观察 PCNA的阳性表达为细胞核的棕黄色染色，TUNEL为胞核的蓝色着色。按高倍镜视野(×40)下每100个细胞中阳性细胞所占比例分级。视野中无阳性细胞为“-”；阳性细胞数10%为“+”；阳性细胞在10%～40%为“++”；视野中阳性细胞>40%则为“+++”。
2 结 果
2.1HE及Mallory改良银染色 胚胎13d，下颌突间充质细胞密集，胚胎14d，麦克尔软骨形成，其远中间充质细胞凝聚，形态为扁平状。胚龄15d，靠近麦克尔软骨的凝聚区细胞逐渐变为较清楚的立方状且胞核大，胞浆嗜碱性。胚胎16～19d，凝聚区细胞形态多数为立方状，核仁明显，胞浆嗜碱性并可见小片状淡粉色骨基质形成，血管丰富。银染色可见周围有黑色矿化区并逐渐增大。麦克尔软骨中大部分细胞消失，组织结构崩解(图1〕。至出生1d，HE及银染色均显示下颌骨基本形成且矿化良好。
, 百拇医药
2.2PCNA在小鼠下颌骨及麦克尔软骨发育中的染色结果 胚龄14d，小鼠下颌处始见麦克尔软骨轮廓，其两侧远中分别见一间充质细胞凝聚区，PCNA染色阳性“+++”(图2)。麦克尔软骨细胞较密集，无明显的软骨细胞陷窝形成，PCNA强阳性着色“+++”。胚龄15d的切片中可见细胞凝聚区增大，PCNA染色“++”，由边缘向中心，细胞形态逐渐变成立方状且胞核大，麦克尔软骨细胞中PCNA着色“++”，个别细胞胞核已消失。胚龄16d，凝聚区外周细胞PCNA染色“+”，中心区域细胞胞核大，淡染。麦克尔软骨细胞着色“-”，多数麦克尔软骨细胞胞核消失(图3)。胚龄19d，已无明显的细胞凝聚区，PCNA染色阴性，麦克尔软骨消失。
2.3TUNEL染色在小鼠下颌骨及麦克尔软骨中的染色结果 胚龄14d，凝聚区的间充质细胞“+”。围绕麦克尔软骨周边的二、三层间充质细胞及软骨细胞TUNEL均为“-”。胚龄15d，下颌骨凝聚区细胞TUNEL“+”；麦克尔软骨细胞阳性细胞为“+”(图4〕，少数细胞胞核消失。胚龄16d，凝聚区细胞“+”；麦克尔软骨细胞“+”，软骨细胞结构开始崩解。胚龄19d，下颌骨区及麦克尔软骨细胞TUNEL为“-”。
, 百拇医药
图1 GD16d，下颌骨形成骨基质并出现小范围的矿化
图2 GD14d，下颌骨凝聚区，多数间充质细胞PCNA阳性着色
图3GD16d，下颌骨凝集区中心的细胞逐渐变成立方状，外周细胞PCNA阳性
图4GD15d，麦克尔软骨细胞呈程序性死亡，TUNEL阳性着色，少数软骨细胞胞核消失
3 讨 论
从受精卵发育成为一个具备多种精细器官的新个体经历了复杂的演变过程，包括细胞的增殖、分化、相互识别及凝聚组合而形成各种组织和器官。这些演变过程受发育机体自身精细而严密的调控。关于胚胎发育的调控机理尚不完全清楚，但相邻细胞之间的相互影响和相邻组织之间的诱导决定作用[4]，却是胚胎发育中一种相当普遍的现象。
, 百拇医药
从本实验结果可以看出，下颌骨的发生与麦克尔软骨之间有密切的关系。在胚胎14d麦克尔软骨刚形成时，间充质细胞开始在其远中凝聚成区域，形成下颌骨的始基。凝聚的间充质细胞发育成后来的骨原细胞，继之分化成成骨细胞，其细胞凝聚区最终发育成为下颌骨。胚龄14～15d的小鼠下颌切片的PCNA染色结果显示，凝聚区细胞开始在麦克尔软骨外侧形成凝聚区时，细胞快速增殖，凝聚区在短时间内迅速变大。至胚胎16d，接收分化信号开始向成骨细胞表型转化。这与周围继续增殖的PCNA阳性着色的间充质细胞形成了明显的不同。胚胎14d～15d凝聚区细胞TUNEL着色均为“+”，说明在细胞快速增殖期间有少数突变细胞或非必需细胞被机体有机地清除，以控制细胞的数量和质量，保证胚胎的正常发育。从麦克尔软骨的PCNA及TUNEL染色结果看，软骨细胞在胚胎14、15dPCNA强阳性着色，胚胎16d阳性信号减弱。TUNEL在麦克尔软骨中的阳性着色从胚胎15、16d为“+”，19d“-”提示软骨细胞结构崩解，软骨组织开始退化。但其结构在短时期内能自行消失而不引发周围组织的异常反应，软骨细胞可能是以一种自杀方式自动消失，提示程序性死亡在此起重要作用。实验结果显示在间充质细胞开始凝聚形成下颌骨始基时，软骨细胞也形成增殖高峰期，以此加强对凝聚区间充质细胞的诱导分化作用，促进了凝聚区的生物学功能。随着凝聚区细胞的成熟并开始向成骨细胞转化，软骨细胞逐渐发生程序性死亡，最终在胚胎发育后期下颌骨基本形成后，麦克尔软骨完全消失。
, 百拇医药
本实验结果提示，下颌骨的发育始于间充质细胞在麦克尔软骨外侧的凝聚，凝聚区中的细胞，快速增殖并形成下颌骨的始基后细胞逐渐定向分化成成骨细胞，形成后来的下颌骨。因此，凝聚区细胞的增殖、分化及细胞凝聚区的产生对日后的下颌骨发育至关重要。胚胎期的麦克尔软骨对下颌骨的发育不仅起支架作用，而且可能对其边缘的凝聚区细胞有重要的诱导分化作用。
参考文献
1 Kiyoto I, Yuji H, Heitai K, et al. High-density culture of mouse meckel's cartilage cell stimulates phenotypic conversion to osteocyte-like cells. J Bone Miner Metab, 1996, 14: 202
2 Tacchetti C, Tavella S, Cancedda R, et al. Cell condensation in chondrogenic differentiation. Exp Cell Res, 1992, 200: 26
3 金岩，李鑫，董绍忠，等. 细胞程序性死亡在颌面部细胞凝聚区形成中的作用. 实用口医学腔杂志，1999,15(1):42
4 Dunlop LL, Hall BK. Relationships between cellular condensation, prosteoblast formation and epithelial-mesenchymal interactions in initiation of osteogenesis. Int J Dev Biol, 1995, 39(2): 357
(收稿：1998-10-19), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：细胞凝聚；细胞程序性死亡；下颌骨
实用口腔医学杂志990117 〔摘要〕 目的：观察胚胎早期间充质细胞增殖、分化的改变，明确下颌骨在胚胎早期由细胞凝聚到定向分化成成骨细胞而发育形成的过程。方法：用免疫组化及TUNEL染色等方法，检测了胚龄13～19d及出生1d的小鼠下颌骨中未分化间充质细胞增殖、细胞程序性死亡(PCD)及表型转化的生物学改变。结果：胚龄13～15d，间充质细胞开始凝聚形成下颌骨始基并迅速增殖。胚龄16～19d，凝聚区细胞明显向成骨细胞表型转化并开始成骨。麦克尔软骨消失。结论：下颌骨的发育始于胚胎间充质细胞的局部凝聚，大部分细胞经历了快速增殖后逐渐分化成熟，少量细胞出现PCD以清除病变或非必需细胞并与麦克尔软骨的发生及退化有密切关系。
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The role of cell condensation in mandibular development in C57 BL/6N mouse
Li Xin， Jin Yan， Dong Shaozhong，et al.
Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi' an 710032
〔Abstract〕 Objective: To study the proliferation and differentiation of mesenchymal cells and the role of cell condensation in mandibular development during early embro stage. Methods: IHC and TUNEL staining technics were used to study the proliferation, condensation and differentiation of mesenchymal cells in palatal processes during embryonic period of 13～19 days and 1 day after birth of C57 BL/6N mice. Result: Proliferation and condensation of mesenchymal cells were observed in the embryo samples of 13～15 days of the embryos, while osteoblast-like cells and osseous tissue were observed in those of 16～19 days when Meckel cartilage could not be found. Conclusion: Mandibular development may be based on the condensation of mesenchymal cells in palatal processes when the cells proliferate rapidly and differentiate into osteoblasts. The formation and degeneration of Meckel cartilage may be related to the process.
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Key words Cell condensation; Programmed cell death; Mandible
下颌骨是全身骨骼发育中较为特殊的组织，它以早其一步形成的麦克尔软骨为支架，逐渐以膜内成骨的方式发育而成。现代观点认为，细胞凝聚区的形成、演变是胚胎发育早期组织器官形态发生的基础[1,2]。本研究采用C57BL/6N近交系小鼠标本，用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化、细胞程序性死亡及改良银染色检测方法，探讨了小鼠胚胎早期下颌骨发育中腭突间充质细胞的增殖、分化及程序性死亡的变化。
1 材料和方法
1.1标本制备 见参考文献[3]。
1.2改良银染色 同一编号的切片常规脱蜡至水，在50g/LAgNO3水溶液浸45min，暴露于强光下，蒸馏水漂洗20min，5g/LNa2S2O3.5H2O水溶液消除多余的钙离子，体积分数为0.3%番红花T水溶液衬染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。
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1.3免疫组化染色 PCNA单抗购自Dako公司，常规ABC法染色，DAB显色，苏木精衬染。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.4TUNEL染色 见参考文献[3](选同一编号的切片)。
1.5免疫组化、TUNEL染色的结果观察 PCNA的阳性表达为细胞核的棕黄色染色，TUNEL为胞核的蓝色着色。按高倍镜视野(×40)下每100个细胞中阳性细胞所占比例分级。视野中无阳性细胞为“-”；阳性细胞数10%为“+”；阳性细胞在10%～40%为“++”；视野中阳性细胞>40%则为“+++”。
2 结 果
2.1HE及Mallory改良银染色 胚胎13d，下颌突间充质细胞密集，胚胎14d，麦克尔软骨形成，其远中间充质细胞凝聚，形态为扁平状。胚龄15d，靠近麦克尔软骨的凝聚区细胞逐渐变为较清楚的立方状且胞核大，胞浆嗜碱性。胚胎16～19d，凝聚区细胞形态多数为立方状，核仁明显，胞浆嗜碱性并可见小片状淡粉色骨基质形成，血管丰富。银染色可见周围有黑色矿化区并逐渐增大。麦克尔软骨中大部分细胞消失，组织结构崩解(图1〕。至出生1d，HE及银染色均显示下颌骨基本形成且矿化良好。
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2.2PCNA在小鼠下颌骨及麦克尔软骨发育中的染色结果 胚龄14d，小鼠下颌处始见麦克尔软骨轮廓，其两侧远中分别见一间充质细胞凝聚区，PCNA染色阳性“+++”(图2)。麦克尔软骨细胞较密集，无明显的软骨细胞陷窝形成，PCNA强阳性着色“+++”。胚龄15d的切片中可见细胞凝聚区增大，PCNA染色“++”，由边缘向中心，细胞形态逐渐变成立方状且胞核大，麦克尔软骨细胞中PCNA着色“++”，个别细胞胞核已消失。胚龄16d，凝聚区外周细胞PCNA染色“+”，中心区域细胞胞核大，淡染。麦克尔软骨细胞着色“-”，多数麦克尔软骨细胞胞核消失(图3)。胚龄19d，已无明显的细胞凝聚区，PCNA染色阴性，麦克尔软骨消失。
2.3TUNEL染色在小鼠下颌骨及麦克尔软骨中的染色结果 胚龄14d，凝聚区的间充质细胞“+”。围绕麦克尔软骨周边的二、三层间充质细胞及软骨细胞TUNEL均为“-”。胚龄15d，下颌骨凝聚区细胞TUNEL“+”；麦克尔软骨细胞阳性细胞为“+”(图4〕，少数细胞胞核消失。胚龄16d，凝聚区细胞“+”；麦克尔软骨细胞“+”，软骨细胞结构开始崩解。胚龄19d，下颌骨区及麦克尔软骨细胞TUNEL为“-”。
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图1 GD16d，下颌骨形成骨基质并出现小范围的矿化
图2 GD14d，下颌骨凝聚区，多数间充质细胞PCNA阳性着色
图3GD16d，下颌骨凝集区中心的细胞逐渐变成立方状，外周细胞PCNA阳性
图4GD15d，麦克尔软骨细胞呈程序性死亡，TUNEL阳性着色，少数软骨细胞胞核消失
3 讨 论
从受精卵发育成为一个具备多种精细器官的新个体经历了复杂的演变过程，包括细胞的增殖、分化、相互识别及凝聚组合而形成各种组织和器官。这些演变过程受发育机体自身精细而严密的调控。关于胚胎发育的调控机理尚不完全清楚，但相邻细胞之间的相互影响和相邻组织之间的诱导决定作用[4]，却是胚胎发育中一种相当普遍的现象。
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从本实验结果可以看出，下颌骨的发生与麦克尔软骨之间有密切的关系。在胚胎14d麦克尔软骨刚形成时，间充质细胞开始在其远中凝聚成区域，形成下颌骨的始基。凝聚的间充质细胞发育成后来的骨原细胞，继之分化成成骨细胞，其细胞凝聚区最终发育成为下颌骨。胚龄14～15d的小鼠下颌切片的PCNA染色结果显示，凝聚区细胞开始在麦克尔软骨外侧形成凝聚区时，细胞快速增殖，凝聚区在短时间内迅速变大。至胚胎16d，接收分化信号开始向成骨细胞表型转化。这与周围继续增殖的PCNA阳性着色的间充质细胞形成了明显的不同。胚胎14d～15d凝聚区细胞TUNEL着色均为“+”，说明在细胞快速增殖期间有少数突变细胞或非必需细胞被机体有机地清除，以控制细胞的数量和质量，保证胚胎的正常发育。从麦克尔软骨的PCNA及TUNEL染色结果看，软骨细胞在胚胎14、15dPCNA强阳性着色，胚胎16d阳性信号减弱。TUNEL在麦克尔软骨中的阳性着色从胚胎15、16d为“+”，19d“-”提示软骨细胞结构崩解，软骨组织开始退化。但其结构在短时期内能自行消失而不引发周围组织的异常反应，软骨细胞可能是以一种自杀方式自动消失，提示程序性死亡在此起重要作用。实验结果显示在间充质细胞开始凝聚形成下颌骨始基时，软骨细胞也形成增殖高峰期，以此加强对凝聚区间充质细胞的诱导分化作用，促进了凝聚区的生物学功能。随着凝聚区细胞的成熟并开始向成骨细胞转化，软骨细胞逐渐发生程序性死亡，最终在胚胎发育后期下颌骨基本形成后，麦克尔软骨完全消失。
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本实验结果提示，下颌骨的发育始于间充质细胞在麦克尔软骨外侧的凝聚，凝聚区中的细胞，快速增殖并形成下颌骨的始基后细胞逐渐定向分化成成骨细胞，形成后来的下颌骨。因此，凝聚区细胞的增殖、分化及细胞凝聚区的产生对日后的下颌骨发育至关重要。胚胎期的麦克尔软骨对下颌骨的发育不仅起支架作用，而且可能对其边缘的凝聚区细胞有重要的诱导分化作用。
参考文献
1 Kiyoto I, Yuji H, Heitai K, et al. High-density culture of mouse meckel's cartilage cell stimulates phenotypic conversion to osteocyte-like cells. J Bone Miner Metab, 1996, 14: 202
2 Tacchetti C, Tavella S, Cancedda R, et al. Cell condensation in chondrogenic differentiation. Exp Cell Res, 1992, 200: 26
3 金岩，李鑫，董绍忠，等. 细胞程序性死亡在颌面部细胞凝聚区形成中的作用. 实用口医学腔杂志，1999,15(1):42
4 Dunlop LL, Hall BK. Relationships between cellular condensation, prosteoblast formation and epithelial-mesenchymal interactions in initiation of osteogenesis. Int J Dev Biol, 1995, 39(2): 357
(收稿：1998-10-19), 百拇医药