口腔粘膜鳞状细胞癌基底膜蛋白的免疫组化研究——Ⅳ型胶原和LN的表达异常
作者：方 玲 郝鹏程 闫征斌 刘建林 何成群 付 君
单位：方 玲 郝鹏程 闫征斌 何成群 付 君 黑龙江大庆油田总医院口腔科 110000；刘建林 黑龙江省邮电医院
关键词：层粘连蛋白；Ⅳ型胶原；基底膜；鳞状细胞癌
口腔粘膜鳞状细胞癌基底膜蛋白的免疫组化研究
〔摘要〕 目的：了解层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原在口腔粘膜鳞状细胞癌中的表达情况。方法：采用免疫组化之SPTM法对30例口腔鳞状细胞癌，10例正常口腔粘膜染色。结果：正常口腔粘膜基底膜LN和Ⅳ型胶原染色密度高，呈连续线状。鳞状细胞癌LN和Ⅳ胶原的染色密度。基底膜的连续性与肿瘤的分化程度呈负相关。结论：LN和Ⅳ型胶原的表达异常与肿瘤分化、浸润和转移有密切关系，可作为判断肿瘤预后的一项指标。
, 百拇医药
An immunological study of basement membrane protein expression in oral squamous cell carcinoma
Fan Ling, Hao Pengcheng, Yan Zhengbin,et al.
Department of Dentistry, Daqing Petroleum Company Hospital, Daqing 163001
〔Abstract〕Objective: To observe the expression of laminin(LN) and collagen Ⅳ expression in oral squamous cell carcinoma.Method:Samples from 30 cases of oral squamous cell carcinoma and 10 cases of normal mucosa were stained with immunohistochemical SPTm method. LN and collagen Ⅳ protein expression was observed.Result:Strong expressin and continuous linear distribution of LN and collagen Ⅳ were observed in normal mucosa; while weak expression and disturbed distribution in oral squamous cell carcinoma, weaker expression and more disturbed distribution in less differentiated cases. Conclusion:The expression and distribution of LN and collagen Ⅳ is correlated with the differentiation of squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
Key words Laminin, Collagen; Basement membrane; Squamous cell carcinoma
层粘连蛋白(laminin，LN)和Ⅳ型胶原(collagen Ⅳ)是基底膜(basement membrane,BM)的主要成分，它们对于细胞的生长、分化及运动具有调节作用，与多种疾病有关。目前发现LN、Ⅳ型胶原与许多皮肤、粘膜疾病、肿瘤的发生及浸润和转移均有密切关系。
口腔粘膜鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，对人类生命健康危害极大。随着免疫学的飞速发展，鳞癌组织中基底膜蛋白成分的变化受到众多学者的重视。本文采用免疫组化技术对不同分化程度的口腔粘膜鳞状细胞癌基底膜中LN、Ⅳ型胶原进行检测，观察其表达情况。
1 材料和方法
1.1材料来源 选择我院1995～1997年间资料完整的存档蜡块，鳞状细胞癌30例，组织分化程度为高度分化(G1)10例，中度分化(G2)9例和低度分化(G3)11例。另以10例正常粘膜组织石蜡标本为对照组。
, 百拇医药
1.2主要试剂 LN多克隆抗体(1∶30)，Ⅳ型胶原单克隆抗体(1∶50)，生物素标记二抗(1∶100)，SPTM试剂盒均由北京中山生物技术有限公司提供。
1.3染色方法 主要步骤如下：①切片脱蜡至水；②3%(体积分数)过氧化氢液去除内源性过氧化物酶；③4g/L%胃蛋白酶消化，37℃，4min；④滴加正常羊血清，37℃，20min；⑤加第一抗体(LN，Ⅳ型胶原抗体)4℃过夜；⑥滴加第二抗体(羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG)37℃，30min；⑦滴加三抗(过氧化酶标记的链霉卵白素)37℃，30min；⑧0.5g/LDAB显色；⑨苏木素复染，脱水、透明、封片。①～③和⑤～⑥步后均经PBS洗3次，每次5min。用已知阳性片作对照，以PBS代替第一抗体作阴性对照。
1.4评定标准 以基底膜染色的密度和基底膜的连续性为基础来评定。染色密度以DAB显色(棕色)的深度为基础分为：缺失(-)，染色密度低(+)、染色密度高(++)。基底膜连续性分为：连续(Ⅰ)，轻度不连续(少数断裂)(Ⅱ)，重度不连续(多处基底膜断裂(Ⅲ)，基底膜缺失(Ⅳ)。
, 百拇医药
1.5统计学处理 采用秩和检验法求Hc值，推断P值范围。
2 结 果
正常口腔粘膜基底膜LN和Ⅳ型胶原染色密度高，呈连续线状(图1)；高分化鳞状细胞癌可见癌巢周围基底膜染色密度减弱，且基底膜变薄，部分基底膜断裂(图2)；中度分化鳞状细胞癌基底膜染色密度较高分化鳞癌低，多处基底膜断裂；低分化鳞状细胞癌则显示大部分病损基底膜严重破坏，甚至基底膜缺失。2种蛋白的染色密度与肿瘤的分化程度呈负相关；基底膜的破坏程度与肿瘤的分化程度呈平行增加趋势。
, 百拇医药
图1正常口腔粘膜Ⅲ型胶原 图2高分化鳞癌Ⅳ型胶原基
基底膜染色10×3.3 底膜染色10×3.3
正常粘膜上皮与不同分化程度鳞癌组织的基底膜LN和Ⅳ型胶原染色密度及基底膜连续性见表1、2，经秩和检验P?.05，有差异。
表1 LN、Ⅳ型胶原基底膜染色密度
染色
强度
LN
Ⅳ型胶原
正常
G1
, 百拇医药
G2
G3
正常
G1
G2
G3
++
10
3
2
—
10
, 百拇医药
2
2
—
+
—
7
6
11
—
8
5
5
-
—
, http://www.100md.com
—
1
—
—
—
2
6
表2 LN、Ⅳ型胶原基底膜的连续性
连续性
LN
Ⅳ型胶原
正常
G1
, 百拇医药
G2
G3
正常
G1
G2
G3
Ⅰ
10
—
2
—
10
, http://www.100md.com
—
1
—
Ⅱ
—
6
3
—
—
6
2
—
Ⅲ
—
, 百拇医药
4
3
11
—
4
4
5
Ⅳ
—
—
1
—
—
—
, http://www.100md.com
2
6
3 讨 论
基底膜是一种细胞外蛋白，它联结上皮及其下方的结缔组织，光镜下可见3层构造：透明层、致密层和纤维网状层，为连续的、厚度均一的线状结构[1]。基底膜含有多种成分，主要为Ⅳ型胶原(collagenⅣ)和层粘连蛋白(LN)。基底膜为肿瘤细胞侵袭过程中穿透的主要屏障之一。近年来人们注意到肿瘤的浸润不仅破坏基底膜的组织结构，基底膜中的蛋白成分亦随之发生改变。观察分析正常粘膜上皮与不同分化程度的鳞癌基底膜中Ⅳ型胶原和LN的分布与变化，对于认识和揭示口腔癌的浸润是有特殊意义的。
Catter等[2]对咽喉部位肿瘤的研究证明，基底膜蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关。本研究结果显示肿瘤的分化程度与上皮基底膜Ⅳ型胶原和LN的表达有关，低分化病损较高分化病损更易出现Ⅳ型胶原和LN的异常表达并显示出明显的基底膜破坏。此结果与Kannan等[3]的研究相一致。Forster等[4]根据不同分化程度癌中基底膜糖蛋白含量的差异，进一步提出分化好的细胞较分化差的细胞会更快地分泌基底膜糖蛋白的假设。
, 百拇医药
Varani等[5]在实验中证明鳞状细胞癌及黑色素瘤均能产生血纤维蛋白溶解酶原激活物(plasminogenactivator,PAS)，PAS可将血纤维蛋白酶原激活为血纤维蛋白酶，血纤维蛋白酶活化Ⅳ型胶原酶从而溶解Ⅳ型胶原的网状结构，降解非胶原成分如LN，粘蛋白中心蛋白等。本实验观察到癌巢周围的基底膜多数很薄弱，并有多处断裂或消失，癌细胞从这些缺少基底膜的部位侵入间质，表明由于基底膜的蛋白成分被活跃浸润的癌细胞分泌的蛋白水解酶消化的结果。
本实验结果提示，不同分化程度鳞状细胞癌上皮基底膜Ⅳ型胶原、LN可显示特征性表达。上皮基底膜蛋白的表达形式可能作为监测肿瘤生物学行为的一种标志，作者认为深入对基底膜细胞外蛋白的免疫组化研究，不仅为肿瘤的早期诊断提供有利依据，而且对临床上判断肿瘤的预后具有重要参考价值。
参考文献
1 藤田佑一，坂仓照好. “基底膜と细胞外マトソツヶス”. 医学のあゆみ, 1996,117(1):3
, 百拇医药
2 Carter RL, Burman JF, Barr L, et al. Immunohistochemical localization of basement membrane type Ⅳ collagen invasive and metastatic squamous carcinomas of the head and neck. J Pathol, 1985,147:159
3 Kannany S, Balarm P, Chandran GJ, et al. Alterations in expression of basement membrane proteins during tumor progress in oral mucosa. Histopathology, 1994,24:531
4 Forster SJ, Talbot IC, Ckayton DG, et al. Tumor basement membrane laminin in adenocarcinoma of rectum: An immunohistochemical study of biological and clinical significance. Int J Cancer, 1986,37:813
5 Varaniy J. Plasminogen activator production by human tumor cells: Effect on tumor cell extracellular matrix interaction. Int J Cancer, 1987,40:772
(收稿：1998-01-21 修回：1998-08-10), 百拇医药
单位：方 玲 郝鹏程 闫征斌 何成群 付 君 黑龙江大庆油田总医院口腔科 110000；刘建林 黑龙江省邮电医院
关键词：层粘连蛋白；Ⅳ型胶原；基底膜；鳞状细胞癌
口腔粘膜鳞状细胞癌基底膜蛋白的免疫组化研究
〔摘要〕 目的：了解层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原在口腔粘膜鳞状细胞癌中的表达情况。方法：采用免疫组化之SPTM法对30例口腔鳞状细胞癌，10例正常口腔粘膜染色。结果：正常口腔粘膜基底膜LN和Ⅳ型胶原染色密度高，呈连续线状。鳞状细胞癌LN和Ⅳ胶原的染色密度。基底膜的连续性与肿瘤的分化程度呈负相关。结论：LN和Ⅳ型胶原的表达异常与肿瘤分化、浸润和转移有密切关系，可作为判断肿瘤预后的一项指标。
, 百拇医药
An immunological study of basement membrane protein expression in oral squamous cell carcinoma
Fan Ling, Hao Pengcheng, Yan Zhengbin,et al.
Department of Dentistry, Daqing Petroleum Company Hospital, Daqing 163001
〔Abstract〕Objective: To observe the expression of laminin(LN) and collagen Ⅳ expression in oral squamous cell carcinoma.Method:Samples from 30 cases of oral squamous cell carcinoma and 10 cases of normal mucosa were stained with immunohistochemical SPTm method. LN and collagen Ⅳ protein expression was observed.Result:Strong expressin and continuous linear distribution of LN and collagen Ⅳ were observed in normal mucosa; while weak expression and disturbed distribution in oral squamous cell carcinoma, weaker expression and more disturbed distribution in less differentiated cases. Conclusion:The expression and distribution of LN and collagen Ⅳ is correlated with the differentiation of squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
Key words Laminin, Collagen; Basement membrane; Squamous cell carcinoma
层粘连蛋白(laminin，LN)和Ⅳ型胶原(collagen Ⅳ)是基底膜(basement membrane,BM)的主要成分，它们对于细胞的生长、分化及运动具有调节作用，与多种疾病有关。目前发现LN、Ⅳ型胶原与许多皮肤、粘膜疾病、肿瘤的发生及浸润和转移均有密切关系。
口腔粘膜鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，对人类生命健康危害极大。随着免疫学的飞速发展，鳞癌组织中基底膜蛋白成分的变化受到众多学者的重视。本文采用免疫组化技术对不同分化程度的口腔粘膜鳞状细胞癌基底膜中LN、Ⅳ型胶原进行检测，观察其表达情况。
1 材料和方法
1.1材料来源 选择我院1995～1997年间资料完整的存档蜡块，鳞状细胞癌30例，组织分化程度为高度分化(G1)10例，中度分化(G2)9例和低度分化(G3)11例。另以10例正常粘膜组织石蜡标本为对照组。
, 百拇医药
1.2主要试剂 LN多克隆抗体(1∶30)，Ⅳ型胶原单克隆抗体(1∶50)，生物素标记二抗(1∶100)，SPTM试剂盒均由北京中山生物技术有限公司提供。
1.3染色方法 主要步骤如下：①切片脱蜡至水；②3%(体积分数)过氧化氢液去除内源性过氧化物酶；③4g/L%胃蛋白酶消化，37℃，4min；④滴加正常羊血清，37℃，20min；⑤加第一抗体(LN，Ⅳ型胶原抗体)4℃过夜；⑥滴加第二抗体(羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG)37℃，30min；⑦滴加三抗(过氧化酶标记的链霉卵白素)37℃，30min；⑧0.5g/LDAB显色；⑨苏木素复染，脱水、透明、封片。①～③和⑤～⑥步后均经PBS洗3次，每次5min。用已知阳性片作对照，以PBS代替第一抗体作阴性对照。
1.4评定标准 以基底膜染色的密度和基底膜的连续性为基础来评定。染色密度以DAB显色(棕色)的深度为基础分为：缺失(-)，染色密度低(+)、染色密度高(++)。基底膜连续性分为：连续(Ⅰ)，轻度不连续(少数断裂)(Ⅱ)，重度不连续(多处基底膜断裂(Ⅲ)，基底膜缺失(Ⅳ)。
, 百拇医药
1.5统计学处理 采用秩和检验法求Hc值，推断P值范围。
2 结 果
正常口腔粘膜基底膜LN和Ⅳ型胶原染色密度高，呈连续线状(图1)；高分化鳞状细胞癌可见癌巢周围基底膜染色密度减弱，且基底膜变薄，部分基底膜断裂(图2)；中度分化鳞状细胞癌基底膜染色密度较高分化鳞癌低，多处基底膜断裂；低分化鳞状细胞癌则显示大部分病损基底膜严重破坏，甚至基底膜缺失。2种蛋白的染色密度与肿瘤的分化程度呈负相关；基底膜的破坏程度与肿瘤的分化程度呈平行增加趋势。
, 百拇医药
图1正常口腔粘膜Ⅲ型胶原 图2高分化鳞癌Ⅳ型胶原基
基底膜染色10×3.3 底膜染色10×3.3
正常粘膜上皮与不同分化程度鳞癌组织的基底膜LN和Ⅳ型胶原染色密度及基底膜连续性见表1、2，经秩和检验P?.05，有差异。
表1 LN、Ⅳ型胶原基底膜染色密度
染色
强度
LN
Ⅳ型胶原
正常
G1
, 百拇医药
G2
G3
正常
G1
G2
G3
++
10
3
2
—
10
, 百拇医药
2
2
—
+
—
7
6
11
—
8
5
5
-
—
, http://www.100md.com
—
1
—
—
—
2
6
表2 LN、Ⅳ型胶原基底膜的连续性
连续性
LN
Ⅳ型胶原
正常
G1
, 百拇医药
G2
G3
正常
G1
G2
G3
Ⅰ
10
—
2
—
10
, http://www.100md.com
—
1
—
Ⅱ
—
6
3
—
—
6
2
—
Ⅲ
—
, 百拇医药
4
3
11
—
4
4
5
Ⅳ
—
—
1
—
—
—
, http://www.100md.com
2
6
3 讨 论
基底膜是一种细胞外蛋白，它联结上皮及其下方的结缔组织，光镜下可见3层构造：透明层、致密层和纤维网状层，为连续的、厚度均一的线状结构[1]。基底膜含有多种成分，主要为Ⅳ型胶原(collagenⅣ)和层粘连蛋白(LN)。基底膜为肿瘤细胞侵袭过程中穿透的主要屏障之一。近年来人们注意到肿瘤的浸润不仅破坏基底膜的组织结构，基底膜中的蛋白成分亦随之发生改变。观察分析正常粘膜上皮与不同分化程度的鳞癌基底膜中Ⅳ型胶原和LN的分布与变化，对于认识和揭示口腔癌的浸润是有特殊意义的。
Catter等[2]对咽喉部位肿瘤的研究证明，基底膜蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关。本研究结果显示肿瘤的分化程度与上皮基底膜Ⅳ型胶原和LN的表达有关，低分化病损较高分化病损更易出现Ⅳ型胶原和LN的异常表达并显示出明显的基底膜破坏。此结果与Kannan等[3]的研究相一致。Forster等[4]根据不同分化程度癌中基底膜糖蛋白含量的差异，进一步提出分化好的细胞较分化差的细胞会更快地分泌基底膜糖蛋白的假设。
, 百拇医药
Varani等[5]在实验中证明鳞状细胞癌及黑色素瘤均能产生血纤维蛋白溶解酶原激活物(plasminogenactivator,PAS)，PAS可将血纤维蛋白酶原激活为血纤维蛋白酶，血纤维蛋白酶活化Ⅳ型胶原酶从而溶解Ⅳ型胶原的网状结构，降解非胶原成分如LN，粘蛋白中心蛋白等。本实验观察到癌巢周围的基底膜多数很薄弱，并有多处断裂或消失，癌细胞从这些缺少基底膜的部位侵入间质，表明由于基底膜的蛋白成分被活跃浸润的癌细胞分泌的蛋白水解酶消化的结果。
本实验结果提示，不同分化程度鳞状细胞癌上皮基底膜Ⅳ型胶原、LN可显示特征性表达。上皮基底膜蛋白的表达形式可能作为监测肿瘤生物学行为的一种标志，作者认为深入对基底膜细胞外蛋白的免疫组化研究，不仅为肿瘤的早期诊断提供有利依据，而且对临床上判断肿瘤的预后具有重要参考价值。
参考文献
1 藤田佑一，坂仓照好. “基底膜と细胞外マトソツヶス”. 医学のあゆみ, 1996,117(1):3
, 百拇医药
2 Carter RL, Burman JF, Barr L, et al. Immunohistochemical localization of basement membrane type Ⅳ collagen invasive and metastatic squamous carcinomas of the head and neck. J Pathol, 1985,147:159
3 Kannany S, Balarm P, Chandran GJ, et al. Alterations in expression of basement membrane proteins during tumor progress in oral mucosa. Histopathology, 1994,24:531
4 Forster SJ, Talbot IC, Ckayton DG, et al. Tumor basement membrane laminin in adenocarcinoma of rectum: An immunohistochemical study of biological and clinical significance. Int J Cancer, 1986,37:813
5 Varaniy J. Plasminogen activator production by human tumor cells: Effect on tumor cell extracellular matrix interaction. Int J Cancer, 1987,40:772
(收稿：1998-01-21 修回：1998-08-10), 百拇医药