负荷改变对髁突骨上组织细胞及细胞外基质的影响——超微结构的研究
作者：段小红 王惠芸
单位：西安第四军医大学口腔医学院口腔解剖生理教研室 710032
关键词：下颌骨髁状突；超微结构；胶原；蛋白聚糖类；电子显微镜检查
实用口腔医学杂志990101 〔摘要〕 目的：检测髁状突骨上组织细胞及细胞外基质超微结构在负荷改变后的变化特点。方法：4只成年家兔在被拔除双侧下颌磨牙后1月和3月，用透射电镜的方法观察组织的表现。结果：细胞发生了不同程度的改建及退行性反应，如粗面内质网的扩张，线粒体肿胀，溶酶体增多等；基质中胶原原纤维的有序排列结构消失，胶原网受到破坏，同时蛋白多糖颗粒减少；基质中脂质小体及基质小囊等成分增多；负重区较非负重区的改变更显著。结论：过重的负荷会超过组织的代偿能力，使细胞产生基质的能力下降，对细胞自身产生不利的影响，引起髁状突的弹性及抗压、抗磨擦等能力的下降。
The ultrastructure changes of cells and extracellular matrix in the supraosseous tissue of mandibular condyle following load change
, http://www.100md.com
Duan Xiaohong, Wang Huiyun.
Dept. of Oral Anatomy and Physiology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032
〔Abstract〕Objective: To observe the ultrastructure changes of the supraosseous tissues of mandibular condyle following load change.Methods:The ultrastructure of supraosseous tissues of 4 adult rabbits were observed under transmission electron microscope 1～3 months after removal of the bilateral lower molars. Result:After removal of the bilateral lower molars, the remodeling and degenerative activities in different layers of the condyles increased, such as vesiculation of endoplasmic reticulum, distortion of mitochondria and increase of lysosome. Furthermore, the sequential arrangement of collagen fibrils was disturbed, the collagen network broke down and the proteoglycan granules decreased. The number of lipid globules and matrix vesicles increased. Load-bearing areas showed more changes than unload-bearing areas. Conclusion:Overloading beyond the adaptive abilities of the tissue may cause a decrease of matrix's synthetic activity of the cells and degenerative changes of the ultrastructure of the cells and matrix.
, 百拇医药
Key words Mandibular condyle; Ultrastructure; Collagen; Proteoglycans; Electron microscopy
近年来，采用扫描电镜和透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)方法对颞下颌关节疾病的研究取得了一些结果，但关于髁状突骨上组织细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的研究甚少，尤其是在负荷改变对基质的影响方面。本研究采用拔除成年家兔双侧下颌磨牙的方法，间接造成关节负荷的加重，用TEM观察髁状突负重区和非负重区的骨上组织细胞及ECM在实验后1月和3月时的表现。
1 材料和方法
8只成年家兔(本校实验动物中心提供)为实验对象，分为2组，每组中2只为实验动物，另外2只为对照，雌雄随机。实验动物在846合剂麻醉下拔除双侧下颌磨牙，实验动物和对照动物在相同条件下喂养。2组动物全麻下取样，分别从左侧髁状突的前斜面和后斜面切取大小约1mm×1mm×3mm的骨上组织，30g/L戊二醛4℃条件下固定，0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗，10g/L锇酸固定，冲洗后丙酮逐级脱水，混合液浸透，Epon812包埋，光镜下定位，制备超薄切片后，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，JEM2000EX透射电镜观察。右侧髁状突做常规HE染色，光镜观察。
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2 结 果
2.1光镜结果 对照组髁状突骨上组织分纤维表层、增殖层和软骨层。前斜面和后斜面相比，后者纤维层较厚，细胞成分多，增殖层连续，软骨细胞排列较为致密。3月组比1月组细胞成分较少，余无明显差异。
1月组实验动物前斜面的增殖层细胞稀疏，软骨细胞数减少。后斜面纤维层略增厚。3月时，实验动物的前斜面纤维层变薄，细胞排列紊乱，软骨层变薄，有软骨细胞丛形成，软骨下方可见到破骨细胞；后斜面的变化较前斜面轻。
2.2电镜结果
2.2.1对照组 纤维表层的细胞较扁，细胞突起较长，胞体长轴平行于关节表面，胞浆电子致密度较高。胞周基质(pericellular matrix,PCM)较窄或缺无，胶原纤维束可直接与胞膜相接触，基质中的胶原原纤维较粗，直径35～60nm，原纤维上有暗纹，纤维成束，平行于关节表面，但纤维束彼此之间交错，起源于不同的方向，胞间基质(interterritorial matrix,ITM)较疏松，有一些无定形物和网状纤维。后斜面的基质较前斜面更为疏松，细胞较扁圆。
, 百拇医药
增殖层细胞与表层细胞相似，扁圆，胞浆内有丰富的粗面内质网，核浆比例较大。基质较表层疏松，成束的原纤维减少，细的纤维密集排列成网，增殖层深层的部分细胞周围有半透明的PCM，有少量的蛋白多糖(proteogly-can,PG)颗粒散在或与细丝相连。该层细胞成分较多。
软骨层细胞的表现具有透明软骨细胞的典型特征，细胞为圆形较透亮，胞浆内有粗面内质网、糖原颗粒、少量微丝等。细胞突起短小，呈扇贝样。PCM为半透亮的环形带，有PG颗粒和不成束的细丝。在PCM的外周是细胞的周边基质(territorial matrix,TM)，原纤维较细，密集成网，层层交错呈同心圆样环绕软骨细胞(图1)。ITM内成束的原纤维较明显。PG颗粒丰富，散布于基质之中。后斜面的软骨细胞较前斜面多，排列更密集。
接近钙化区的软骨细胞细胞器减少，PCM透亮，PG颗粒甚少或缺无。基质中有少量的脂质小体和基质小囊(matrix vesicle,MV)。
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2.2.2 1月组 纤维细胞呈不规则形，胞浆的电子致密度增高，能观察到线粒体肿胀及溶酶体样物(图2)，细胞突起短小，基质中的纤维数量减少，结构疏松，个别原纤维断裂。增殖层细胞的突起不规则，且短小，胞内糖原成分略增加。基质无明显变化。
软骨细胞有改建及退行性变的表现，如粗面内质网扩张，线粒体肿胀，溶酶体和糖原颗粒增多，细胞和细胞核形态不规整，胞内有较多的细丝出现。基质较疏松，原纤维的有序排列遭到破坏，PCM变薄，PG颗粒减少。
以上这些变化在前斜面更显著。
2.2.3 3月组 各层细胞均有退行性变的表现，较1月组更显著(图3)，一些软骨细胞胞核周围有许多微丝平行环绕，细胞器明显减少。表层及软骨深层有坏死的细胞。一些软骨细胞为不规则形，周围无透亮的PCM，细胞突起长短不一，邻近有较粗的有暗纹的胶原原纤维与细胞膜接触，个别成束。前斜面的这些变化较后斜面显著。
, http://www.100md.com
表层基质纤维排列紊乱，纤维成分减少，无定形物增多。软骨细胞周围环行的纤维排列消失，基质疏松，有许多弯曲的细小纤维。PCM不明显或消失，PG颗粒显著减少。基质中的脂质小体和结晶样物成分以及MV的数目增多，一些MV沿胶原纤维沉积。前斜面的软骨下方有破骨细胞。
图1 对照组软骨细胞较圆，周围有半透明的薄带，内有PG颗粒和不成束的细丝，原纤维紧密排列环绕细胞(×4K)
图2 1月组关节表层成纤维细胞线粒体肿胀，细胞突起缩短，原纤维无明显成束现象(×10K)
图3 3月组退变的软骨细胞(×6K)
, 百拇医药
3 讨 论
以往的研究表明，多数磨牙缺失后，会增大关节的负荷，当超过组织的改建能力时，可导致髁状突组织的病理损伤[1]，本实验亦证实了这一点。TEM水平下，骨上组织各层细胞的变化与其他学者所观察到的骨关节炎时的细胞变化基本一致[2～4]，有粗面内质网的扩张、线粒体的肿胀、溶酶体的出现等细胞退变、坏死的表现。
近年研究表明，力学刺激对细胞影响的直接结果就是引起细胞形态的改变，其机理之一在于细胞内骨架结构的重新排列[5]。本实验观察到一些细胞内微丝数量增加，但分布区域的改变无明显规律。一些软骨细胞典型形态消失，其某些特征类似于成纤维细胞，胞周有较粗的胶原原纤维，故软骨细胞为适应新的负荷环境有可能向成纤维细胞转变。
正常纤维表层中胶原原纤维为致密的平行于关节表面的纤维束，有助于保护髁状突抵抗功能活动中过度的磨损和撕裂[6]。实验后1月，成束的胶原原纤维减少，基质疏松；而3月组原纤维排列紊乱，并有折断的现象以及残留的碎片，软骨细胞周围有序排列的纤维网结构也受到破坏。纤维结构的这些变化可能与压力刺激的方向和强度改变有关。
, 百拇医药
体外实验表明，力学信号可通过许多精细的途径在细胞内传导，表现在细胞合成和分泌基质的能力改变[7]。本实验软骨细胞PCM的破坏，与软骨细胞退化后合成基质的能力减弱有关，PCM和ITM完整结构的破坏会影响软骨细胞的内部环境[8]，使之遭受不利影响。
PG颗粒在增殖层细胞周围出现，表明该层细胞已具有合成软骨基质大分子的能力[9]。广泛分布的PG使软骨具有一定的弹性，软骨细胞受损时，合成PG的能力下降，故电镜下观察到PG颗粒明显减少。
对照组肥大层基质中有少量的MV，与软骨的钙化有关[10,11]，病变后MV增多，沿胶原纤维沉积，在退化的软骨细胞周围也有分布，这与软骨降解中酶活动和软骨钙化程度增加有关[2]。
光镜和电镜结果证实缺牙后前斜面的细胞和基质的变化较后斜面更显著，与前斜面为主要负重区有关。后斜面的组织变化是由于缺牙后，下颌的稳定性降低，发生移位，使后斜面的部分区域负重增大。
, 百拇医药
综上可看出，当负荷超过组织的适应能力时，细胞自身的代谢活动改变，基质随之而相应的变化，但最终髁状突组织的抗压能力和弹性仍会降低。
(特别感谢我校电镜室的李学荣、刘键、谷法有等各位老师的帮助。)
参考文献
1 Christen LV, Ziebert GJ. Effects of experimental loss of teeth on the temporomandibular joint. J Oral Rehabili, 1986,13:587
2 Lang TC, Zimny ML, Vijayagopal P. Experimental temporomandibular joint disc perforation in the rabbit. J Oral Maxillofac Surg, 1993,51(10):1115
, 百拇医药
3 谷志远，张震康，孙开华，等. 颞下颌关节紊乱综合征患者髁突与关节盘的电镜和光镜研究. 中华口腔医学杂志，1991,26(1):18
4 尤志浩，罗宗赉，徐樱华，等. 偏侧咀嚼对大鼠下颌关节的影响. 华西口腔医学杂志，1987,5(4):230
5 田卫. 内皮细胞中力学信号的传递与传导. 国外医学生物医学工程分册，1997,20(3):136
6 Copray JC, Liem RS. Ultrastructural changes associated with weaning in the mandibular condyle of the rat. Acta Anat (Basel), 1989,134(1):35
7 张文涛，卢世壁. 力学刺激与软骨细胞培养. 国外医学生物医学工程分册，1997,20(6):348
, 百拇医药
8 Greco F, Specchia N, Falciglia F, et al. Ultrastructural analysis of the adaptation of articular cartilage to mechanical stimulation. Clinica Orthop Traumatol, 1992,18(3):311
9 Livne E, Lewinson D, Dickson G, et al. Histochemical study of matrical components in the mandibular condyle of the neonatal mouse. Acta Anat, 1990,138(1):32
10 Dreessen D, Halata Z. Age-related osteo-arthrotic degeneration of the temporomandibular joint in the mouse. Acta Anat (Basel), 1990,139(1):91
11 Livne E, Oliver C, Leapman RD, et al. Age-related changes in the roles of matrix vesicles in the mandibular condyle cartilage. J Anat, 1987,150(1):66
(收稿：1998-03-30 修回：1998-07-02), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院口腔解剖生理教研室 710032
关键词：下颌骨髁状突；超微结构；胶原；蛋白聚糖类；电子显微镜检查
实用口腔医学杂志990101 〔摘要〕 目的：检测髁状突骨上组织细胞及细胞外基质超微结构在负荷改变后的变化特点。方法：4只成年家兔在被拔除双侧下颌磨牙后1月和3月，用透射电镜的方法观察组织的表现。结果：细胞发生了不同程度的改建及退行性反应，如粗面内质网的扩张，线粒体肿胀，溶酶体增多等；基质中胶原原纤维的有序排列结构消失，胶原网受到破坏，同时蛋白多糖颗粒减少；基质中脂质小体及基质小囊等成分增多；负重区较非负重区的改变更显著。结论：过重的负荷会超过组织的代偿能力，使细胞产生基质的能力下降，对细胞自身产生不利的影响，引起髁状突的弹性及抗压、抗磨擦等能力的下降。
The ultrastructure changes of cells and extracellular matrix in the supraosseous tissue of mandibular condyle following load change
, http://www.100md.com
Duan Xiaohong, Wang Huiyun.
Dept. of Oral Anatomy and Physiology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032
〔Abstract〕Objective: To observe the ultrastructure changes of the supraosseous tissues of mandibular condyle following load change.Methods:The ultrastructure of supraosseous tissues of 4 adult rabbits were observed under transmission electron microscope 1～3 months after removal of the bilateral lower molars. Result:After removal of the bilateral lower molars, the remodeling and degenerative activities in different layers of the condyles increased, such as vesiculation of endoplasmic reticulum, distortion of mitochondria and increase of lysosome. Furthermore, the sequential arrangement of collagen fibrils was disturbed, the collagen network broke down and the proteoglycan granules decreased. The number of lipid globules and matrix vesicles increased. Load-bearing areas showed more changes than unload-bearing areas. Conclusion:Overloading beyond the adaptive abilities of the tissue may cause a decrease of matrix's synthetic activity of the cells and degenerative changes of the ultrastructure of the cells and matrix.
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Key words Mandibular condyle; Ultrastructure; Collagen; Proteoglycans; Electron microscopy
近年来，采用扫描电镜和透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)方法对颞下颌关节疾病的研究取得了一些结果，但关于髁状突骨上组织细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的研究甚少，尤其是在负荷改变对基质的影响方面。本研究采用拔除成年家兔双侧下颌磨牙的方法，间接造成关节负荷的加重，用TEM观察髁状突负重区和非负重区的骨上组织细胞及ECM在实验后1月和3月时的表现。
1 材料和方法
8只成年家兔(本校实验动物中心提供)为实验对象，分为2组，每组中2只为实验动物，另外2只为对照，雌雄随机。实验动物在846合剂麻醉下拔除双侧下颌磨牙，实验动物和对照动物在相同条件下喂养。2组动物全麻下取样，分别从左侧髁状突的前斜面和后斜面切取大小约1mm×1mm×3mm的骨上组织，30g/L戊二醛4℃条件下固定，0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗，10g/L锇酸固定，冲洗后丙酮逐级脱水，混合液浸透，Epon812包埋，光镜下定位，制备超薄切片后，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，JEM2000EX透射电镜观察。右侧髁状突做常规HE染色，光镜观察。
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2 结 果
2.1光镜结果 对照组髁状突骨上组织分纤维表层、增殖层和软骨层。前斜面和后斜面相比，后者纤维层较厚，细胞成分多，增殖层连续，软骨细胞排列较为致密。3月组比1月组细胞成分较少，余无明显差异。
1月组实验动物前斜面的增殖层细胞稀疏，软骨细胞数减少。后斜面纤维层略增厚。3月时，实验动物的前斜面纤维层变薄，细胞排列紊乱，软骨层变薄，有软骨细胞丛形成，软骨下方可见到破骨细胞；后斜面的变化较前斜面轻。
2.2电镜结果
2.2.1对照组 纤维表层的细胞较扁，细胞突起较长，胞体长轴平行于关节表面，胞浆电子致密度较高。胞周基质(pericellular matrix,PCM)较窄或缺无，胶原纤维束可直接与胞膜相接触，基质中的胶原原纤维较粗，直径35～60nm，原纤维上有暗纹，纤维成束，平行于关节表面，但纤维束彼此之间交错，起源于不同的方向，胞间基质(interterritorial matrix,ITM)较疏松，有一些无定形物和网状纤维。后斜面的基质较前斜面更为疏松，细胞较扁圆。
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增殖层细胞与表层细胞相似，扁圆，胞浆内有丰富的粗面内质网，核浆比例较大。基质较表层疏松，成束的原纤维减少，细的纤维密集排列成网，增殖层深层的部分细胞周围有半透明的PCM，有少量的蛋白多糖(proteogly-can,PG)颗粒散在或与细丝相连。该层细胞成分较多。
软骨层细胞的表现具有透明软骨细胞的典型特征，细胞为圆形较透亮，胞浆内有粗面内质网、糖原颗粒、少量微丝等。细胞突起短小，呈扇贝样。PCM为半透亮的环形带，有PG颗粒和不成束的细丝。在PCM的外周是细胞的周边基质(territorial matrix,TM)，原纤维较细，密集成网，层层交错呈同心圆样环绕软骨细胞(图1)。ITM内成束的原纤维较明显。PG颗粒丰富，散布于基质之中。后斜面的软骨细胞较前斜面多，排列更密集。
接近钙化区的软骨细胞细胞器减少，PCM透亮，PG颗粒甚少或缺无。基质中有少量的脂质小体和基质小囊(matrix vesicle,MV)。
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2.2.2 1月组 纤维细胞呈不规则形，胞浆的电子致密度增高，能观察到线粒体肿胀及溶酶体样物(图2)，细胞突起短小，基质中的纤维数量减少，结构疏松，个别原纤维断裂。增殖层细胞的突起不规则，且短小，胞内糖原成分略增加。基质无明显变化。
软骨细胞有改建及退行性变的表现，如粗面内质网扩张，线粒体肿胀，溶酶体和糖原颗粒增多，细胞和细胞核形态不规整，胞内有较多的细丝出现。基质较疏松，原纤维的有序排列遭到破坏，PCM变薄，PG颗粒减少。
以上这些变化在前斜面更显著。
2.2.3 3月组 各层细胞均有退行性变的表现，较1月组更显著(图3)，一些软骨细胞胞核周围有许多微丝平行环绕，细胞器明显减少。表层及软骨深层有坏死的细胞。一些软骨细胞为不规则形，周围无透亮的PCM，细胞突起长短不一，邻近有较粗的有暗纹的胶原原纤维与细胞膜接触，个别成束。前斜面的这些变化较后斜面显著。
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表层基质纤维排列紊乱，纤维成分减少，无定形物增多。软骨细胞周围环行的纤维排列消失，基质疏松，有许多弯曲的细小纤维。PCM不明显或消失，PG颗粒显著减少。基质中的脂质小体和结晶样物成分以及MV的数目增多，一些MV沿胶原纤维沉积。前斜面的软骨下方有破骨细胞。
图1 对照组软骨细胞较圆，周围有半透明的薄带，内有PG颗粒和不成束的细丝，原纤维紧密排列环绕细胞(×4K)
图2 1月组关节表层成纤维细胞线粒体肿胀，细胞突起缩短，原纤维无明显成束现象(×10K)
图3 3月组退变的软骨细胞(×6K)
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3 讨 论
以往的研究表明，多数磨牙缺失后，会增大关节的负荷，当超过组织的改建能力时，可导致髁状突组织的病理损伤[1]，本实验亦证实了这一点。TEM水平下，骨上组织各层细胞的变化与其他学者所观察到的骨关节炎时的细胞变化基本一致[2～4]，有粗面内质网的扩张、线粒体的肿胀、溶酶体的出现等细胞退变、坏死的表现。
近年研究表明，力学刺激对细胞影响的直接结果就是引起细胞形态的改变，其机理之一在于细胞内骨架结构的重新排列[5]。本实验观察到一些细胞内微丝数量增加，但分布区域的改变无明显规律。一些软骨细胞典型形态消失，其某些特征类似于成纤维细胞，胞周有较粗的胶原原纤维，故软骨细胞为适应新的负荷环境有可能向成纤维细胞转变。
正常纤维表层中胶原原纤维为致密的平行于关节表面的纤维束，有助于保护髁状突抵抗功能活动中过度的磨损和撕裂[6]。实验后1月，成束的胶原原纤维减少，基质疏松；而3月组原纤维排列紊乱，并有折断的现象以及残留的碎片，软骨细胞周围有序排列的纤维网结构也受到破坏。纤维结构的这些变化可能与压力刺激的方向和强度改变有关。
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体外实验表明，力学信号可通过许多精细的途径在细胞内传导，表现在细胞合成和分泌基质的能力改变[7]。本实验软骨细胞PCM的破坏，与软骨细胞退化后合成基质的能力减弱有关，PCM和ITM完整结构的破坏会影响软骨细胞的内部环境[8]，使之遭受不利影响。
PG颗粒在增殖层细胞周围出现，表明该层细胞已具有合成软骨基质大分子的能力[9]。广泛分布的PG使软骨具有一定的弹性，软骨细胞受损时，合成PG的能力下降，故电镜下观察到PG颗粒明显减少。
对照组肥大层基质中有少量的MV，与软骨的钙化有关[10,11]，病变后MV增多，沿胶原纤维沉积，在退化的软骨细胞周围也有分布，这与软骨降解中酶活动和软骨钙化程度增加有关[2]。
光镜和电镜结果证实缺牙后前斜面的细胞和基质的变化较后斜面更显著，与前斜面为主要负重区有关。后斜面的组织变化是由于缺牙后，下颌的稳定性降低，发生移位，使后斜面的部分区域负重增大。
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综上可看出，当负荷超过组织的适应能力时，细胞自身的代谢活动改变，基质随之而相应的变化，但最终髁状突组织的抗压能力和弹性仍会降低。
(特别感谢我校电镜室的李学荣、刘键、谷法有等各位老师的帮助。)
参考文献
1 Christen LV, Ziebert GJ. Effects of experimental loss of teeth on the temporomandibular joint. J Oral Rehabili, 1986,13:587
2 Lang TC, Zimny ML, Vijayagopal P. Experimental temporomandibular joint disc perforation in the rabbit. J Oral Maxillofac Surg, 1993,51(10):1115
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3 谷志远，张震康，孙开华，等. 颞下颌关节紊乱综合征患者髁突与关节盘的电镜和光镜研究. 中华口腔医学杂志，1991,26(1):18
4 尤志浩，罗宗赉，徐樱华，等. 偏侧咀嚼对大鼠下颌关节的影响. 华西口腔医学杂志，1987,5(4):230
5 田卫. 内皮细胞中力学信号的传递与传导. 国外医学生物医学工程分册，1997,20(3):136
6 Copray JC, Liem RS. Ultrastructural changes associated with weaning in the mandibular condyle of the rat. Acta Anat (Basel), 1989,134(1):35
7 张文涛，卢世壁. 力学刺激与软骨细胞培养. 国外医学生物医学工程分册，1997,20(6):348
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8 Greco F, Specchia N, Falciglia F, et al. Ultrastructural analysis of the adaptation of articular cartilage to mechanical stimulation. Clinica Orthop Traumatol, 1992,18(3):311
9 Livne E, Lewinson D, Dickson G, et al. Histochemical study of matrical components in the mandibular condyle of the neonatal mouse. Acta Anat, 1990,138(1):32
10 Dreessen D, Halata Z. Age-related osteo-arthrotic degeneration of the temporomandibular joint in the mouse. Acta Anat (Basel), 1990,139(1):91
11 Livne E, Oliver C, Leapman RD, et al. Age-related changes in the roles of matrix vesicles in the mandibular condyle cartilage. J Anat, 1987,150(1):66
(收稿：1998-03-30 修回：1998-07-02), 百拇医药