培养成骨细胞接种于天然珊瑚中再造骨组织的研究
作者：陈富林 毛天球 杨维东 王常勇 顾晓明 朱萧玲
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：组织工程；成骨细胞；珊瑚
实用口腔医学杂志990522 〔摘要〕 目的：对成骨细胞接种于天然珊瑚中的再造骨组织进行组织学观察。方法：体外分离、培养扩增兔成骨细胞，将细胞接种于多孔珊瑚中，然后植入兔背部皮下组织，术后4、8、12周取材，通过组织学、扫描电镜观察新骨的形成情况。结果：表明培养的兔成骨细胞可以在珊瑚表面良好生长，成骨细胞/珊瑚复合物植入皮下 4周，局部形成骨样组织，可见大量成骨细胞，胞浆丰富，某些部位可见红色的骨基质形成；8周时，形成大量新骨组织，但不成熟；12周时板层骨形成，扫描电镜观察见大量成骨细胞位于基质中。结论：用这种方法进行骨再造和骨缺损修复有很多优点，具有广阔的应用前景。
Experimental research of bone regeneration with osteoblasts seeded
, http://www.100md.com
in natural coral
Chen Fulin， Mao Tianqiu，Yang Weidong, et al.Stomatologyical College, Fourth Military Medical University， Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To study the possibility of regeneration of bone tissue with osteoblasts seeded in natural coral. Methods: Rabbit osteoblasts were isolated, expanded in vitro,and then seeded into porous coral, the osteoblasts/coral constructs were implanted subcutaneously into rabbit back.Bone regeneration was observed 4, 8, 12 weeks after implantation by histological and scanning electronic microscope examination. Results : Osteoblasts could adhere and proliferate well on the surface of natural coral， 4 weeks after implantation osteoid tissue was observed; 8 weeks after implantation large amount of new bone were found;12 weeks after implantation， lamellar bone was observed; many osteoblasts could be seen in bone matrix by scanning electronic microscope. Conclusions: Osteoblasts/coral construct may be used for bone tissue enginneering.
, 百拇医药
Key words Tissue engineering; Osteoblast;Coral
近年来学者们尝试用组织工程方法进行了生物性的人工软骨、骨、皮肤、心脏瓣膜、血管乃至人工肝、人工胰等的研制，取得了可喜的成果。其中软骨由于组织结构和细胞成分相对简单，研究进行得较为成功〔1〕。本研究采用天然珊瑚作为支架材料，接种成骨细胞后移植，对骨组织的形成情况进行了观察。
1 材料和方法
1.1 材料
滨珊瑚(海南三亚)，按张森林〔2〕介绍的方法进行处理。 同窝同性别新西兰幼兔 5只(第四军医大学动物中心), DMEM培养液(Gibco), 胎牛血清(浙江清湖犊牛利用研究所)。胰蛋白酶(Sigma)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 兔颅骨成骨细胞的培养 取 1只幼兔，按酶消化法进行颅骨成骨细胞的原代培养〔3〕，原代培养成功后，细胞进行扩增传代，获得大量细胞供移植用。其余动物作为珊瑚/成骨细胞移植的受体。
将多孔珊瑚制成直径8 mm、厚1 mm的盘状，蒸汽消毒后用培养液预湿备用。细胞用2.5 g/L胰酶消化，1000 r/min离心3 min，收集细胞，用培养液调整细胞浓度至 5×106/ml，每块材料上接种细胞液30 μl，放回 25 ml培养瓶中，细胞孵箱培养4 h后，加入4 ml培养液继续培养。
1.2.3 移植 接种细胞后 5 d取出材料，无菌条件下植入其余动物背部皮下。一块标本进行扫描电镜观察。
1.2.4 取材及观察 术后 4、 8、12周取材，甲酸 -甲酸钠脱钙液脱钙，常规石蜡切片，HE染色后观察。另取12周标本， 体积分数为3%戊二醛固定，乙腈系列脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 组织学检查 成骨细胞/珊瑚复合物植入后 4周，在皮下组织中复合物形成骨样组织，表现为大量的成骨细胞聚集，胞浆丰富，某些区域可以观察到红色的骨基质形成，但无板层结构，并能观察到成骨细胞位于陷窝内的典型的组织学表现，珊瑚表面已有吸收。植入后8周，在珊瑚表面和孔洞内均可观察到大量新骨形成，但不太成熟。12周时，骨组织变得成熟，珊瑚表面和孔洞中均有板层骨形成(图1)。
图1 植入12周时，珊瑚孔洞中有板层骨形成(HE, ×40)
2.2 扫描电镜观察 成骨细胞接种后 5 d， 细胞为多边形，贴附伸展良好，长满珊瑚表面和孔洞中(图2)，并开始合成细胞外基质；12周标本，材料的边缘已有吸收，珊瑚表面可见圆形成骨细胞位于束状排列的胶原基质中，孔洞中也可见大量的骨组织。
, 百拇医药
图2 成骨细胞接种后 5 d， 细胞长满珊瑚表面和孔洞(SEM, ×300)
3 讨 论
某些特殊部位的植骨有很高的要求，如眶底、眶下区、鼻背等，必须恢复适当的外形，才能获得满意的治疗效果。现有的各种生物性植骨材料，如自体骨、异体骨等，植入后要发生部分吸收〔4〕，复合BMP的植骨材料植入，新骨的外形也不可控制，因而均不能满足临床需要。用组织工程方法则有可能获得具有精确外形的骨组织，将成骨细胞接种到具有一定外形的支架材料上，等细胞长满材料表面后进行移植，将来形成新骨的形状就是支架的形状。
Kim等〔5〕将软骨细胞植入多孔的三角形、正方形、十字形的聚乙醇酸(PGA)中，成功地获得了三角形、正方形、十字形的软骨块，并进行了骨缺损修复的研究〔6〕，认为：这种方法为软骨移植提供了大量的组织来源，如果能辅以控释的生长因子、细胞因子，将有很大的发展前途，对骨科、整形外科、颌面外科等的发展会产生巨大的影响。
, 百拇医药
应用陶瓷类材料为支架接种成骨细胞建造组织工程骨的研究较少。珊瑚为海洋生物珊瑚虫死亡后形成的沉积物，主要成分为碳酸钙，处理后的珊瑚具有良好的生物相容性和可降解性。其三维相通的孔隙结构不仅能为成骨细胞的贴附、增殖提供较大的表面，而且有利于营养成分的渗透和血管化形成，因此适宜于作为成骨细胞接种的支架材料。
根据本研究的结果，培养的成骨细胞可以在珊瑚表面良好地贴附和生长，并形成细胞外基质。成骨细胞/珊瑚复合物植入皮下4周，局部形成骨样组织，可见大量成骨细胞，胞桨丰富，某些部位开始有骨基质形成。8周时，在珊瑚表面和孔洞内均可观察到大量新骨形成。12周时板层骨已经形成，扫描电镜观察见大量成骨细胞位于基质中，表明用组织工程方法再造新骨组织是完全可行的。
以往研究中，新骨的形成主要依靠附近骨床的爬行或诱导成骨。用组织工程方法则完全不同，它是通过将成骨细胞体外扩增，获得大量具有形成功能的细胞用于移植，在植入部位直接形成骨组织，因而与以往的方法有本质的差别。本实验对用成骨细胞移植形成骨组织进行了初步研究，在移植模型建立、细胞培养、细胞接种等方法上积累了一些经验，为进一步的工作打下了基础。
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本项目由国家自然科学基金(编号 39779762)和军队医药卫生科研基金(编号98M104)资助
参考文献
1陈富林，毛天球.组织工程学的现在与未来. 医学信息,1997,10(12)：29
2 张森林,毛天球,王会信,等.重组人骨形成蛋白-2/珊瑚复合人工骨的研究及在诱导成骨的实验研究.实用口腔医学杂志，1998,14(2):97
3 司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养. 西安: 世界图书出版公司，1996.112
4 杨维东，彭品祥，马振国. 异体脱矿骨修复创伤性眶底缺损. 实用口腔医学杂志,1994, 10(3)：175
5 Kim WS,Vacanti JP,Cima L, et al. Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on sythetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg, 1994,94:233
6 Kim WS,Vacanti CA,Upton J, et al. Bone defect repair with tissue engineered cartilage. Plast Reconstr Surg,1994,94:580
(收稿：1999-07-26), http://www.100md.com
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：组织工程；成骨细胞；珊瑚
实用口腔医学杂志990522 〔摘要〕 目的：对成骨细胞接种于天然珊瑚中的再造骨组织进行组织学观察。方法：体外分离、培养扩增兔成骨细胞，将细胞接种于多孔珊瑚中，然后植入兔背部皮下组织，术后4、8、12周取材，通过组织学、扫描电镜观察新骨的形成情况。结果：表明培养的兔成骨细胞可以在珊瑚表面良好生长，成骨细胞/珊瑚复合物植入皮下 4周，局部形成骨样组织，可见大量成骨细胞，胞浆丰富，某些部位可见红色的骨基质形成；8周时，形成大量新骨组织，但不成熟；12周时板层骨形成，扫描电镜观察见大量成骨细胞位于基质中。结论：用这种方法进行骨再造和骨缺损修复有很多优点，具有广阔的应用前景。
Experimental research of bone regeneration with osteoblasts seeded
, http://www.100md.com
in natural coral
Chen Fulin， Mao Tianqiu，Yang Weidong, et al.Stomatologyical College, Fourth Military Medical University， Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To study the possibility of regeneration of bone tissue with osteoblasts seeded in natural coral. Methods: Rabbit osteoblasts were isolated, expanded in vitro,and then seeded into porous coral, the osteoblasts/coral constructs were implanted subcutaneously into rabbit back.Bone regeneration was observed 4, 8, 12 weeks after implantation by histological and scanning electronic microscope examination. Results : Osteoblasts could adhere and proliferate well on the surface of natural coral， 4 weeks after implantation osteoid tissue was observed; 8 weeks after implantation large amount of new bone were found;12 weeks after implantation， lamellar bone was observed; many osteoblasts could be seen in bone matrix by scanning electronic microscope. Conclusions: Osteoblasts/coral construct may be used for bone tissue enginneering.
, 百拇医药
Key words Tissue engineering; Osteoblast;Coral
近年来学者们尝试用组织工程方法进行了生物性的人工软骨、骨、皮肤、心脏瓣膜、血管乃至人工肝、人工胰等的研制，取得了可喜的成果。其中软骨由于组织结构和细胞成分相对简单，研究进行得较为成功〔1〕。本研究采用天然珊瑚作为支架材料，接种成骨细胞后移植，对骨组织的形成情况进行了观察。
1 材料和方法
1.1 材料
滨珊瑚(海南三亚)，按张森林〔2〕介绍的方法进行处理。 同窝同性别新西兰幼兔 5只(第四军医大学动物中心), DMEM培养液(Gibco), 胎牛血清(浙江清湖犊牛利用研究所)。胰蛋白酶(Sigma)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 兔颅骨成骨细胞的培养 取 1只幼兔，按酶消化法进行颅骨成骨细胞的原代培养〔3〕，原代培养成功后，细胞进行扩增传代，获得大量细胞供移植用。其余动物作为珊瑚/成骨细胞移植的受体。
将多孔珊瑚制成直径8 mm、厚1 mm的盘状，蒸汽消毒后用培养液预湿备用。细胞用2.5 g/L胰酶消化，1000 r/min离心3 min，收集细胞，用培养液调整细胞浓度至 5×106/ml，每块材料上接种细胞液30 μl，放回 25 ml培养瓶中，细胞孵箱培养4 h后，加入4 ml培养液继续培养。
1.2.3 移植 接种细胞后 5 d取出材料，无菌条件下植入其余动物背部皮下。一块标本进行扫描电镜观察。
1.2.4 取材及观察 术后 4、 8、12周取材，甲酸 -甲酸钠脱钙液脱钙，常规石蜡切片，HE染色后观察。另取12周标本， 体积分数为3%戊二醛固定，乙腈系列脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察。
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2 结 果
2.1 组织学检查 成骨细胞/珊瑚复合物植入后 4周，在皮下组织中复合物形成骨样组织，表现为大量的成骨细胞聚集，胞浆丰富，某些区域可以观察到红色的骨基质形成，但无板层结构，并能观察到成骨细胞位于陷窝内的典型的组织学表现，珊瑚表面已有吸收。植入后8周，在珊瑚表面和孔洞内均可观察到大量新骨形成，但不太成熟。12周时，骨组织变得成熟，珊瑚表面和孔洞中均有板层骨形成(图1)。
图1 植入12周时，珊瑚孔洞中有板层骨形成(HE, ×40)
2.2 扫描电镜观察 成骨细胞接种后 5 d， 细胞为多边形，贴附伸展良好，长满珊瑚表面和孔洞中(图2)，并开始合成细胞外基质；12周标本，材料的边缘已有吸收，珊瑚表面可见圆形成骨细胞位于束状排列的胶原基质中，孔洞中也可见大量的骨组织。
, 百拇医药
图2 成骨细胞接种后 5 d， 细胞长满珊瑚表面和孔洞(SEM, ×300)
3 讨 论
某些特殊部位的植骨有很高的要求，如眶底、眶下区、鼻背等，必须恢复适当的外形，才能获得满意的治疗效果。现有的各种生物性植骨材料，如自体骨、异体骨等，植入后要发生部分吸收〔4〕，复合BMP的植骨材料植入，新骨的外形也不可控制，因而均不能满足临床需要。用组织工程方法则有可能获得具有精确外形的骨组织，将成骨细胞接种到具有一定外形的支架材料上，等细胞长满材料表面后进行移植，将来形成新骨的形状就是支架的形状。
Kim等〔5〕将软骨细胞植入多孔的三角形、正方形、十字形的聚乙醇酸(PGA)中，成功地获得了三角形、正方形、十字形的软骨块，并进行了骨缺损修复的研究〔6〕，认为：这种方法为软骨移植提供了大量的组织来源，如果能辅以控释的生长因子、细胞因子，将有很大的发展前途，对骨科、整形外科、颌面外科等的发展会产生巨大的影响。
, 百拇医药
应用陶瓷类材料为支架接种成骨细胞建造组织工程骨的研究较少。珊瑚为海洋生物珊瑚虫死亡后形成的沉积物，主要成分为碳酸钙，处理后的珊瑚具有良好的生物相容性和可降解性。其三维相通的孔隙结构不仅能为成骨细胞的贴附、增殖提供较大的表面，而且有利于营养成分的渗透和血管化形成，因此适宜于作为成骨细胞接种的支架材料。
根据本研究的结果，培养的成骨细胞可以在珊瑚表面良好地贴附和生长，并形成细胞外基质。成骨细胞/珊瑚复合物植入皮下4周，局部形成骨样组织，可见大量成骨细胞，胞桨丰富，某些部位开始有骨基质形成。8周时，在珊瑚表面和孔洞内均可观察到大量新骨形成。12周时板层骨已经形成，扫描电镜观察见大量成骨细胞位于基质中，表明用组织工程方法再造新骨组织是完全可行的。
以往研究中，新骨的形成主要依靠附近骨床的爬行或诱导成骨。用组织工程方法则完全不同，它是通过将成骨细胞体外扩增，获得大量具有形成功能的细胞用于移植，在植入部位直接形成骨组织，因而与以往的方法有本质的差别。本实验对用成骨细胞移植形成骨组织进行了初步研究，在移植模型建立、细胞培养、细胞接种等方法上积累了一些经验，为进一步的工作打下了基础。
, http://www.100md.com
本项目由国家自然科学基金(编号 39779762)和军队医药卫生科研基金(编号98M104)资助
参考文献
1陈富林，毛天球.组织工程学的现在与未来. 医学信息,1997,10(12)：29
2 张森林,毛天球,王会信,等.重组人骨形成蛋白-2/珊瑚复合人工骨的研究及在诱导成骨的实验研究.实用口腔医学杂志，1998,14(2):97
3 司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养. 西安: 世界图书出版公司，1996.112
4 杨维东，彭品祥，马振国. 异体脱矿骨修复创伤性眶底缺损. 实用口腔医学杂志,1994, 10(3)：175
5 Kim WS,Vacanti JP,Cima L, et al. Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on sythetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg, 1994,94:233
6 Kim WS,Vacanti CA,Upton J, et al. Bone defect repair with tissue engineered cartilage. Plast Reconstr Surg,1994,94:580
(收稿：1999-07-26), http://www.100md.com