P21ras在颌骨骨折愈合过程中的表达
作者：司晓辉 金 岩 杨连甲 朱萧玲
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：骨折；愈合；原癌基因蛋白质P21(RAS)；免疫组织化学
实用口腔医学杂志990507 〔摘要〕 目的：探讨骨折愈合过程中P21ras对细胞增殖分化的调控作用。 方法：建立颌骨骨折模型，利用免疫组化法观察颌骨骨折愈合的不同阶段P21ras的表达。结果：骨折愈合早期(第1～5 d)仅见少量P21ras阳性细胞；而骨痂形成期(第7～14 d)骨断端附近的阳性细胞数量和染色强度明显增加；骨改建期(第21～28 d)阳性细胞数量和强度均减少，与正常骨基本相同。结论：P21ras参与了骨折愈合过程中细胞的增殖和分化。
Expression of P21ras in the healing of mandibular fracture
, http://www.100md.com
Si Xiaohui, Jin Yan, Yang Lianjia.Department of Oral Pathology,Stomatological College, Fourth Military
Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕 Objective: To elucidate P21ras in the regulation of cell proliferation and differentiation during bone fracture healing. Methods: An experimental model of mandibular fracture was established and the expression of P21ras in the different stages of the healing proccess was detected using immunohistochemistry. Results: A few P21ras positive cells were seen in the early stage of healing (day 1 to day 5). Both the number and the intensity of the positive cells increased evidently near bone stump in porotic stage (day 7 to day 14).Positive staining decreased and was the same as the normal bone in remodeling stage (day 21 to day 28). Conclusion: P21ras may be involved in regulating cell proliferation and differentiation during fracture healing.
, 百拇医药
Key words Fracture healing;Proto-oncogen protein P21(RAS);Immunohistochemistry
骨折后细胞接受刺激信号，产生各种各样的生物学效应，包括细胞增殖、分化及细胞外基质的合成等一系列变化过程，受到多种因素的精细调控。信息传递G蛋白类癌基因ras家族(包括H-ras, K-ras和N-ras)的表达产物P21参与膜的信号转导，在细胞信息传递过程中起着重要的作用，是参与细胞增殖的重要基因〔1〕。以往对P21ras的研究多集中在它与肿瘤的关系方面，而其在创伤愈合中的作用研究较少。本实验建立了颌骨骨折模型，用免疫组化方法观察P21ras在骨折愈合不同时期的表达，探讨其在组织修复中的作用及意义。
1 材料和方法
1.1 主要材料
, http://www.100md.com
健康成年雄性家兔(24只，1.6～2.2 kg)由第四军医大学动物中心提供；鼠抗人P21(H-ras)单克隆抗体(McAb)购自美国Oncogene Science公司；免疫组化ABC试剂盒为Dako公司产品。
1.2 骨折模型的建立及标本处理〔2〕
在30 g/L戊巴比妥(每kg体重给1 ml)全麻下，于家兔单侧下颌骨角前切迹处用牙科涡轮机造成完全性骨折，钢丝结扎固定，逐层缝合骨膜、肌肉和皮肤。分别于术后第1、3、5、7、11、14、21和28 d取材(每个时间点3只动物)。取材前用40 g/L多聚甲醛灌注固定，然后取骨断端及周围组织，后固定4 h(4 ℃)。常规脱钙，石蜡包埋，5 μm厚连续切片2张，分别行HE染色和P21免疫组化检测。
1.3 免疫组化染色方法
(1)切片脱蜡至水；(2)体积分数为3% H2O2中孵育10 min；(3)切片浸入0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)中，经微波处理10 min；(4)正常羊血清37 ℃孵育20 min；(5)滴加鼠抗人P21 (H-ras) McAb，4 ℃过夜；(6)滴加生物素化的羊抗鼠IgG，37 ℃温育30 min；(7)滴加ABC复合物，37 ℃温育30 min。上述各步之间均经PBS缓冲液充分振洗；(8)显色液(终浓度为0.5 g/L DAB，体积分数为0.03% H2O2)用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)、DAB和新鲜的H2O2配制；(9)显色后用苏木精稍衬染，脱水，透明，封片。上述各步未加说明者，皆为室温条件下。染色同时用PBS代替 P21ras McAb作为阴性对照，已多次重复实验均证明为阳性的1例软骨肉瘤为阳性对照。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 骨折愈合过程的HE染色观察
骨折后第1 d，骨断端间隙由血肿充填；第3 d血肿开始机化，成纤维细胞、毛细血管芽长入血凝块，形成肉芽组织；第5 d，骨折损伤刺激骨内膜和骨外膜生发层的细胞分化增生并在骨断端附近聚集；第7 d，新生骨小梁明显增多，其外周可见成骨细胞；第11 d，软骨岛数量增多，并可见肥大的软骨细胞。膜内成骨活跃，新生骨小梁基本覆盖骨断端；第14 d，骨小梁变粗大，形成骨髓腔，可见较成熟的骨组织；第21、28 d，骨折处新骨连接成片，趋向于连接骨断端及封闭外界与骨髓腔的交通。
2.2 骨折愈合过程中P21ras的表达
阳性对照中，肿瘤性软骨细胞胞浆内可见棕黄染色。所有阴性对照均为阴性反应。骨折后第1、3 d，骨折部位血痂区的部分单核细胞呈弱阳性反应；第5 d，骨断端附近的阳性细胞较前增多；第7 d，新骨形成区内的成骨细胞呈强阳性，新骨附近的一些成纤维细胞也为阳性着色(图1)，而离骨断端较远的部位中只有个别成骨细胞为阳性；第11、14 d骨痂内的成骨细胞仍呈阳性反应，远离骨断端部位的个别成骨细胞仍为阳性，而纤维组织区和正常骨呈阴性反应；第21、28 d，阳性着色强度下降，个别成骨细胞为弱阳性，大部分成骨细胞为阴性，骨细胞和骨膜均为阴性反应，与正常骨的染色情况趋于一致。
, 百拇医药
图1骨折后第7 d，新生骨周围的成骨细胞呈P21ras
强阳性ABC法苏木精衬染 ×132
3 讨 论
原癌基因是一类与细胞生长和分化的调控有关的基因，它们在正常细胞内不仅是无害的，而且对维持细胞正常的生理功能、控制细胞生长和分化起重要作用，是细胞发育、组织再生、创伤愈合所必需的。这类基因广泛存在于生物界，具有高度的保守性，属于“看家基因”，它们在时空及表达次序和量上相互配合，维持细胞处于正常状态。一旦其结构和调节发生变化，正常的平衡遭到破坏，就会导致细胞转化。人ras原癌基因包括H-ras、N-ras和K-ras三种类型，编码产物是Mr为21 000的蛋白质(P21ras)，它位于胞膜的胞浆面，是细胞的一个重要信号转换分子，接受外界调节细胞分裂和分化的信号，参与细胞的生长及分化调控〔3〕。此蛋白可特异地与鸟嘌呤核苷酸(GTP)结合，活化腺苷酸环化酶，促使cAMP的生成，而当GTP被水解为GDP时，则无此作用。所以当ras基因发生扩增或点突变时，产生过多或异常的P21蛋白，能够抑制GTP的水解，使P21ras-GTP复合物的形式一直保持，cAMP水平大大提高，细胞持续增殖，导致癌的发生。将反义N-ras真核表达载体转染血管平滑肌细胞(VSMCs),可使细胞增殖中的胞内信息总通路受到抑制，最终抑制了成纤维细胞生长因子诱导的VSMCs的增殖〔4〕。Maher等〔5〕将含有突变的ras基因的逆转录病毒载体转染至正常人骨髓细胞，结果发现突变的ras基因的表达使得早期骨髓细胞的增殖加强，而细胞的分化过程受阻。在大鼠观察到肝脏发生补偿性增生时，伴随有ras基因表达的暂时升高，但当补偿增生恢复至肝原来体积时，ras的表达恢复至原来水平〔6〕。
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骨是再生能力较强的组织，骨折愈合在组织学上可分为肉芽组织形成期、骨痂形成期和骨改建期，涉及了细胞迁移和聚集、增殖和分化等复杂的活动。骨折发生后，对机体细胞既有物理刺激(如机械刺激等)，又有化学刺激(如激素的释放、炎症介质和细胞因子的产生等)，且各种因素互相影响，互为因果。骨折后，一方面外伤可使骨断端部位的组织细胞释放刺激信号，另一方面局部的细胞活化而能接受刺激信号，即细胞发生增殖分化并形成骨和软骨以修复骨折。P21ras作为信号转导分子，在此过程中可能发挥了承上启下的作用。本实验结果表明，在骨折愈合的骨痂形成期，即细胞增生分化最旺盛的时期，P21ras的表达在骨断端部位明显增强，在远离骨断端的部位，P21ras的表达则较弱；而在骨折愈合早期(主要是细胞的迁移和聚集)及骨改建期(主要是细胞功能的活跃)的表达较弱，与正常骨类似。作者认为，骨折局部的细胞通过P21ras接受刺激信号，使该部位的细胞活化，进而发生增生和分化，从而加速骨折的愈合，至骨改建期，P21ras又逐渐恢复至原来的水平，以防止靶分子的持续激活和细胞过度增生，维持骨折局部的组织细胞处于平衡状态。
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骨折愈合是一个动态的发展过程，多种细胞增殖分化因子在其中发挥作用，它们或协同或拮抗，最终表现出多样的细胞效应，P21ras可能参与了骨折愈合时成骨信号和细胞增生分化之间的信号转导。其它与细胞增殖相关的分子(如Cyclin-D1, Cdk4, E2F-1等)在骨折愈合中的作用以及它们之间的关系是值得进一步探讨的问题。
参考文献
1Satoch T, Nakafuku M, Kaziro Y. Function of ras as a molecular switch in signal transduction. J Biol Chem, 1992, 267: 24149
2 Si XH, Jin Y, Yang LJ. Expression of BMP2 and TGFβ mRNA during healing of the rabbit mandible. Eur J Oral Sci, 1997, 105(4): 320
, http://www.100md.com
3 徐今 主编. 基因的分子生物学. 北京: 中国科学技术出版社, 1993.290～291
4 周玉杰，汪丽蕙，周爱儒. 反义N-ras-1基因对成纤维细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用. 中华医学杂志，1998, 78(3): 227
5 Maher J, Colonna F, Baker D, et al. Retroviral-mediated gene transfer of a mutant H-ras gene into normal human bone marrow alters myeloid cell proliferation and differentiation. Exp Hematol, 1994, 22(1):8
6 陈兆聪 主编. 医学分子生物学. 武昌: 武汉大学出版社, 1988.367～368
(收稿：1999-01-28 修回：1999-04-22), http://www.100md.com
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：骨折；愈合；原癌基因蛋白质P21(RAS)；免疫组织化学
实用口腔医学杂志990507 〔摘要〕 目的：探讨骨折愈合过程中P21ras对细胞增殖分化的调控作用。 方法：建立颌骨骨折模型，利用免疫组化法观察颌骨骨折愈合的不同阶段P21ras的表达。结果：骨折愈合早期(第1～5 d)仅见少量P21ras阳性细胞；而骨痂形成期(第7～14 d)骨断端附近的阳性细胞数量和染色强度明显增加；骨改建期(第21～28 d)阳性细胞数量和强度均减少，与正常骨基本相同。结论：P21ras参与了骨折愈合过程中细胞的增殖和分化。
Expression of P21ras in the healing of mandibular fracture
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Si Xiaohui, Jin Yan, Yang Lianjia.Department of Oral Pathology,Stomatological College, Fourth Military
Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕 Objective: To elucidate P21ras in the regulation of cell proliferation and differentiation during bone fracture healing. Methods: An experimental model of mandibular fracture was established and the expression of P21ras in the different stages of the healing proccess was detected using immunohistochemistry. Results: A few P21ras positive cells were seen in the early stage of healing (day 1 to day 5). Both the number and the intensity of the positive cells increased evidently near bone stump in porotic stage (day 7 to day 14).Positive staining decreased and was the same as the normal bone in remodeling stage (day 21 to day 28). Conclusion: P21ras may be involved in regulating cell proliferation and differentiation during fracture healing.
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Key words Fracture healing;Proto-oncogen protein P21(RAS);Immunohistochemistry
骨折后细胞接受刺激信号，产生各种各样的生物学效应，包括细胞增殖、分化及细胞外基质的合成等一系列变化过程，受到多种因素的精细调控。信息传递G蛋白类癌基因ras家族(包括H-ras, K-ras和N-ras)的表达产物P21参与膜的信号转导，在细胞信息传递过程中起着重要的作用，是参与细胞增殖的重要基因〔1〕。以往对P21ras的研究多集中在它与肿瘤的关系方面，而其在创伤愈合中的作用研究较少。本实验建立了颌骨骨折模型，用免疫组化方法观察P21ras在骨折愈合不同时期的表达，探讨其在组织修复中的作用及意义。
1 材料和方法
1.1 主要材料
, http://www.100md.com
健康成年雄性家兔(24只，1.6～2.2 kg)由第四军医大学动物中心提供；鼠抗人P21(H-ras)单克隆抗体(McAb)购自美国Oncogene Science公司；免疫组化ABC试剂盒为Dako公司产品。
1.2 骨折模型的建立及标本处理〔2〕
在30 g/L戊巴比妥(每kg体重给1 ml)全麻下，于家兔单侧下颌骨角前切迹处用牙科涡轮机造成完全性骨折，钢丝结扎固定，逐层缝合骨膜、肌肉和皮肤。分别于术后第1、3、5、7、11、14、21和28 d取材(每个时间点3只动物)。取材前用40 g/L多聚甲醛灌注固定，然后取骨断端及周围组织，后固定4 h(4 ℃)。常规脱钙，石蜡包埋，5 μm厚连续切片2张，分别行HE染色和P21免疫组化检测。
1.3 免疫组化染色方法
(1)切片脱蜡至水；(2)体积分数为3% H2O2中孵育10 min；(3)切片浸入0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)中，经微波处理10 min；(4)正常羊血清37 ℃孵育20 min；(5)滴加鼠抗人P21 (H-ras) McAb，4 ℃过夜；(6)滴加生物素化的羊抗鼠IgG，37 ℃温育30 min；(7)滴加ABC复合物，37 ℃温育30 min。上述各步之间均经PBS缓冲液充分振洗；(8)显色液(终浓度为0.5 g/L DAB，体积分数为0.03% H2O2)用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)、DAB和新鲜的H2O2配制；(9)显色后用苏木精稍衬染，脱水，透明，封片。上述各步未加说明者，皆为室温条件下。染色同时用PBS代替 P21ras McAb作为阴性对照，已多次重复实验均证明为阳性的1例软骨肉瘤为阳性对照。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 骨折愈合过程的HE染色观察
骨折后第1 d，骨断端间隙由血肿充填；第3 d血肿开始机化，成纤维细胞、毛细血管芽长入血凝块，形成肉芽组织；第5 d，骨折损伤刺激骨内膜和骨外膜生发层的细胞分化增生并在骨断端附近聚集；第7 d，新生骨小梁明显增多，其外周可见成骨细胞；第11 d，软骨岛数量增多，并可见肥大的软骨细胞。膜内成骨活跃，新生骨小梁基本覆盖骨断端；第14 d，骨小梁变粗大，形成骨髓腔，可见较成熟的骨组织；第21、28 d，骨折处新骨连接成片，趋向于连接骨断端及封闭外界与骨髓腔的交通。
2.2 骨折愈合过程中P21ras的表达
阳性对照中，肿瘤性软骨细胞胞浆内可见棕黄染色。所有阴性对照均为阴性反应。骨折后第1、3 d，骨折部位血痂区的部分单核细胞呈弱阳性反应；第5 d，骨断端附近的阳性细胞较前增多；第7 d，新骨形成区内的成骨细胞呈强阳性，新骨附近的一些成纤维细胞也为阳性着色(图1)，而离骨断端较远的部位中只有个别成骨细胞为阳性；第11、14 d骨痂内的成骨细胞仍呈阳性反应，远离骨断端部位的个别成骨细胞仍为阳性，而纤维组织区和正常骨呈阴性反应；第21、28 d，阳性着色强度下降，个别成骨细胞为弱阳性，大部分成骨细胞为阴性，骨细胞和骨膜均为阴性反应，与正常骨的染色情况趋于一致。
, 百拇医药
图1骨折后第7 d，新生骨周围的成骨细胞呈P21ras
强阳性ABC法苏木精衬染 ×132
3 讨 论
原癌基因是一类与细胞生长和分化的调控有关的基因，它们在正常细胞内不仅是无害的，而且对维持细胞正常的生理功能、控制细胞生长和分化起重要作用，是细胞发育、组织再生、创伤愈合所必需的。这类基因广泛存在于生物界，具有高度的保守性，属于“看家基因”，它们在时空及表达次序和量上相互配合，维持细胞处于正常状态。一旦其结构和调节发生变化，正常的平衡遭到破坏，就会导致细胞转化。人ras原癌基因包括H-ras、N-ras和K-ras三种类型，编码产物是Mr为21 000的蛋白质(P21ras)，它位于胞膜的胞浆面，是细胞的一个重要信号转换分子，接受外界调节细胞分裂和分化的信号，参与细胞的生长及分化调控〔3〕。此蛋白可特异地与鸟嘌呤核苷酸(GTP)结合，活化腺苷酸环化酶，促使cAMP的生成，而当GTP被水解为GDP时，则无此作用。所以当ras基因发生扩增或点突变时，产生过多或异常的P21蛋白，能够抑制GTP的水解，使P21ras-GTP复合物的形式一直保持，cAMP水平大大提高，细胞持续增殖，导致癌的发生。将反义N-ras真核表达载体转染血管平滑肌细胞(VSMCs),可使细胞增殖中的胞内信息总通路受到抑制，最终抑制了成纤维细胞生长因子诱导的VSMCs的增殖〔4〕。Maher等〔5〕将含有突变的ras基因的逆转录病毒载体转染至正常人骨髓细胞，结果发现突变的ras基因的表达使得早期骨髓细胞的增殖加强，而细胞的分化过程受阻。在大鼠观察到肝脏发生补偿性增生时，伴随有ras基因表达的暂时升高，但当补偿增生恢复至肝原来体积时，ras的表达恢复至原来水平〔6〕。
, http://www.100md.com
骨是再生能力较强的组织，骨折愈合在组织学上可分为肉芽组织形成期、骨痂形成期和骨改建期，涉及了细胞迁移和聚集、增殖和分化等复杂的活动。骨折发生后，对机体细胞既有物理刺激(如机械刺激等)，又有化学刺激(如激素的释放、炎症介质和细胞因子的产生等)，且各种因素互相影响，互为因果。骨折后，一方面外伤可使骨断端部位的组织细胞释放刺激信号，另一方面局部的细胞活化而能接受刺激信号，即细胞发生增殖分化并形成骨和软骨以修复骨折。P21ras作为信号转导分子，在此过程中可能发挥了承上启下的作用。本实验结果表明，在骨折愈合的骨痂形成期，即细胞增生分化最旺盛的时期，P21ras的表达在骨断端部位明显增强，在远离骨断端的部位，P21ras的表达则较弱；而在骨折愈合早期(主要是细胞的迁移和聚集)及骨改建期(主要是细胞功能的活跃)的表达较弱，与正常骨类似。作者认为，骨折局部的细胞通过P21ras接受刺激信号，使该部位的细胞活化，进而发生增生和分化，从而加速骨折的愈合，至骨改建期，P21ras又逐渐恢复至原来的水平，以防止靶分子的持续激活和细胞过度增生，维持骨折局部的组织细胞处于平衡状态。
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骨折愈合是一个动态的发展过程，多种细胞增殖分化因子在其中发挥作用，它们或协同或拮抗，最终表现出多样的细胞效应，P21ras可能参与了骨折愈合时成骨信号和细胞增生分化之间的信号转导。其它与细胞增殖相关的分子(如Cyclin-D1, Cdk4, E2F-1等)在骨折愈合中的作用以及它们之间的关系是值得进一步探讨的问题。
参考文献
1Satoch T, Nakafuku M, Kaziro Y. Function of ras as a molecular switch in signal transduction. J Biol Chem, 1992, 267: 24149
2 Si XH, Jin Y, Yang LJ. Expression of BMP2 and TGFβ mRNA during healing of the rabbit mandible. Eur J Oral Sci, 1997, 105(4): 320
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3 徐今 主编. 基因的分子生物学. 北京: 中国科学技术出版社, 1993.290～291
4 周玉杰，汪丽蕙，周爱儒. 反义N-ras-1基因对成纤维细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用. 中华医学杂志，1998, 78(3): 227
5 Maher J, Colonna F, Baker D, et al. Retroviral-mediated gene transfer of a mutant H-ras gene into normal human bone marrow alters myeloid cell proliferation and differentiation. Exp Hematol, 1994, 22(1):8
6 陈兆聪 主编. 医学分子生物学. 武昌: 武汉大学出版社, 1988.367～368
(收稿：1999-01-28 修回：1999-04-22), http://www.100md.com