颊粘膜鳞癌浸润方式与血管生成关系的研究
作者：李龙江 王莉娟 温玉明 王昌美
单位：四川成都华西医科大学口腔医学院 (李龙江 温玉明 王昌美 610041)；学校医院 (王莉娟)
关键词：癌；肿瘤侵犯；新生血管化
实用口腔医学杂志990503 〔摘要〕目的：了解癌周血管生成对颊癌局部浸润方式形成的影响和关系。方法：收集60例临床病例及病理资料，结合组织学和免疫组织化学手段，光镜下分类颊癌浸润方式并定量计数癌周微血管密度。结果：颊癌浸润生长方式主要有4种：波浪型、团块型、条索型和弥漫型。癌周血管形成与其密切相关，并直接影响颊癌浸润生长方式的形成，其中以条索型和弥漫型浸润生长血管生成最强烈，恶性程度最高，预后最差。结论：上述4种浸润方式均为颊癌局部生长的主要形式，其形成受癌周血管生成的直接影响，两者间有密切的相关关系。癌周血管生成对癌细胞恶性行为的表达及发展至关重要，两者相辅相成。
, 百拇医药
The relationships between invasion mode and angiogenesis
of buccal carcinoma
Li Longjiang,Wang Lijuan,Wen Yuming,et al.College of Stomatology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041
〔Abstract〕Objective:To study the relationships between angiogenesis and invasion mode of buccal carcinoma.Methods:The invasion mode of buccal carcinoma was studies histologically and the microvascular density around the lesion was investigated immunohistologically and quantitatively in 60 cases.Results:The invasion modes, wave,mass,code and diffuse type, were observed in the cases.Heigher microvascular density was found in code and diffuse types of the caranoma.Conclusion:Angiogenesis around carcinoma may be related to the invasion mode and play a very important role in malignant phenotype of the lesion.
, 百拇医药
Key words Carcinoma;Neoplasm invasiveness;Neovascularization
恶性肿瘤浸润生长是其发生淋巴道及血道转移的前提，也是影响患者治疗效果和预后的重要因素。肿瘤血管生成是恶性细胞进一步增殖、生长、浸润及发生转移的条件。因此，肿瘤以什么样的方式浸润生长与其诱导血管形成密切相关。本文拟通过临床病理资料结合免疫组化定量方法研究颊癌浸润方式与血管生成之间的相互关系，为阐明颊癌局部生物学行为特点及针对肿瘤血管的抗癌治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
收集1984～1988年间华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科接受手术治疗(同时行颈清扫术)的60例颊粘膜鳞癌患者的标本，其中男性33例，女性27例，年龄37～72岁.所有病例均经病理检查证实为颊癌。详细记录患者年龄、性别、肿块大小、肿瘤病理分级及随访资料，全部病例术前未经过放疗和化疗。对肿瘤已扩展到邻近一个或一个以上解剖区者均不纳入。以正常成人(8例男性，19～31岁)颊部组织标本为对照。
, 百拇医药
1.2 研究方法
1.2.1 病理切片准备 所有标本均经体积分数为10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色和ABC酶标法染色。
1.2.2 免疫组织化学染色 一抗：鼠抗人Ⅷ因子相关抗原(F8-RA)，美国Dako公司产品，工作滴度1∶80。二抗：生物素化羊抗鼠IgG，美国Dako公司产品，工作滴度1∶200。
ABC复合物 美国Dako公司产品，工作滴度1∶200。
其它 体积分数为5%正常马血清，0.01 mol/L PBS(pH7.4)，0.5 g/L胰蛋白酶消化液(pH7.6)，DAB，二甲苯，酒精，苏木素等。
实验方法 ABC酶标法染色，染色过程中PBS代替一抗作阴性对照，人颌外动脉为阳性对照。
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1.3 微血管计量
经ABC法染色后的切片，血管内皮被褐染。血管计数：任何与附近微血管、肿瘤细胞以及其它结缔组织成分明显分离的褐染的内皮细胞或内皮细胞簇均被认为是单个的微血管。在国产MIAS-200显微图像分析仪下测量癌周区域，低倍镜(40倍)下任意寻找3个区域，再分别于高倍镜(400倍)、面积为0.502 4 mm2下依顺序测量每个区域内的3个视野，共得出9个数据，取其平均值为每个标本的血管密度。对照颊部组织测量方法相同，得出正常参考值。1.4 浸润方式
综合Jakobsson〔1〕和Yamamoto〔2〕等对头颈部鳞癌浸润方式的研究结果，将颊癌局部浸润生长分为4种类型：波浪型、团块型、条索型及弥漫型。
2 结 果
2.1 组织学检查
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光学显微镜观察所有标本均为颊粘膜鳞癌。经F8-RA免疫法染色的切片，内皮细胞胞浆阳性表达。阴性对照不显色，颌外动脉内皮细胞胞浆阳性表达，实验染色效果可靠。
2.2 颊癌浸润生长方式
组织学观察各标本切片，发现颊粘膜鳞癌局部浸润生长主要表现为4种类型，分别为：波浪型(I型)：推挤性生长，边界较清楚，浸润浅，厚度较小，多为外生型生长；团块型(Ⅱ型)：呈团、片或带状生长，浸润面积较大，浸润不深，多为溃疡型；条索型(Ⅲ型)：呈小团块或条索状生长，浸润深，厚度较大；弥漫型(Ⅳ型)：分散成单个细胞或巢状生长，浸润深，厚度大，弥散广泛。各种浸润方式见图1。
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图1 颊癌浸润方式模式图
颊癌不同生长方式临床病理资料记录见表1。
表1 颊癌浸润方式及临床病理资料 浸润
类型
n
病理分级*
淋巴结转移
远处转移
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ
, http://www.100md.com 13
11
2
0
1
0
Ⅱ
17
4
8
5
8
0
Ⅲ
, http://www.100md.com
18
3
6
9
11
1
Ⅳ
12
0
5
7
9
1
合计
, 百拇医药
60
18
21
21
29
2
*1971年WHO鳞癌病理分级
资料反映出：波浪型浸润生长占21.7%，团块型占28.3%，条索型占30%，弥漫型占20%。各型之间无明显构成优势。Ⅰ、Ⅱ型30例中，颈淋巴结转移占30%(9/30)；Ⅲ、Ⅳ型30例中，颈淋巴结转移占66%(20/30)，且有2例发生远处转移。
2.3 图像分析测量结果
微血管密度计量结果见表2、3。表2 不同浸润方式高倍镜下血管密度测量均值(条/mm2) 类型
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n
血管密度(
±s)
P值
正常人
8
9.71± 3.40
Ⅰ
13
21.64± 8.36
<0.05
Ⅱ
17
, http://www.100md.com
26.82± 9.72
<0.05
Ⅲ
18
35.31±10.14
<0.05
Ⅳ
12
36.03± 9.23
<0.05
表3 不同浸润方式血管密度两两比较q检验 对比类型
血管密度(P值)
, http://www.100md.com
Ⅰ-Ⅱ
<0.05
Ⅰ-Ⅲ
<0.05
Ⅰ-Ⅳ
<0.05
Ⅱ-Ⅲ
<0.05
Ⅱ-Ⅳ
<0.05
Ⅲ-Ⅳ
>0.05
方差齐性检验经变量代换后为齐性。两两q检验结果显示：颊癌癌周血管密度明显高于正常人颊部组织，I型增加约123%(P<0.05)；Ⅱ型增加约176%(P<0.05)；Ⅲ型增加约264%(P<0.05)；Ⅳ型增加约271%(P<0.05)。除Ⅲ型和Ⅳ型间比较无统计学差别外，其余各型间两两比较均具统计学意义(P<0.05)。
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3 讨 论
实体恶性肿瘤向周围组织浸润表现出复杂的生长方式，其生长特征受到癌细胞本身和宿主组织特点的共同影响，从而形成该肿瘤浸润生长的规律。本研究通过组织学观察，发现颊粘膜鳞癌浸润生长方式主要有4种，即：波浪型，团块型，条索型和弥漫型。各种浸润方式生长特点各异，波浪型表现为整体推进性生长，团块型呈多中心集中生长，条索型呈连续放散、深入生长，而弥漫型则广泛弥散于宿主组织内，浸润、破坏性生长。全部60例中团块型和条索型各占30%左右，弥漫型和波浪型各占20%左右。反映出颊癌浸润生长以条索型和团块型占多，而弥漫型和波浪型略少。但各型之间并无明显差异，表明这4种浸润方式均为颊癌局部生长的主要方式，而癌细胞诱导血管生成及发生转移确与浸润方式密切相关。
F8-RA由血管内皮、巨核细胞以及血小板生成。组织培养的内皮细胞也可分泌第Ⅷ因子前体。应用针对血管内皮细胞的单克隆抗体F8-RA免疫法染色，可特异性地使微血管内皮染色〔3〕。本实验中，F8-RA在正常颊粘膜下微血管内皮有表达，显示微血管少量散在分布，这些血管是粘膜下固有的微血管。颊癌中存在大量微血管，分布不均匀，主要集中在肿瘤的周边区和癌巢基底细胞邻近的间质内，癌巢内分布很少，证明癌周区域新生血管丰富。癌细胞以什么样方式浸润生长与癌细胞分化程度及癌周血管增生强度有关。癌细胞分化程度越差，血管密度越大，其浸润方式越复杂，主要表现为条索状或弥漫型生长，颈淋巴结转移率达66%，并出现远处转移。而分化程度较好的肿瘤主要以波浪型和团块型浸润生长，其癌周血管密度相对较低，颈淋巴结转移率仅达30%，未发现远处转移。各种浸润方式中，以波浪型浸润生长恶性程度最低，其癌细胞分化高，癌周血管密度低，几乎很少发生转移(1/13)。团块型浸润生长居中，条索型及弥漫型浸润生长恶性程度最高。因此，在临床工作中通过结合病理检查对肿瘤浸润生长进行分类，就可间接了解癌周血管生成程度及恶性潜能，对选择和制定治疗方案，尤其是手术方案提供可靠的依据。
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肿瘤诱导血管生成之所以影响肿瘤浸润生长方式乃至转移的发生，与癌细胞生长需求及宿主血管反应密切相关。Moscatelli等〔4〕研究发现，肿瘤细胞可持续释放血管生成因子，诱导癌周血管增生，以满足其代谢的需要；在生长着的毛细血管顶端的内皮细胞释放胶原酶和纤维蛋白溶酶原激活剂以便其向组织内生长，这些降解酶可以增强肿瘤细胞脱落能力，便于其向新生血管方向浸润和进入血管、转移。同时，在肿瘤血管生成现象明显加重时，癌抑制基因的功能下降，癌细胞恶性行为增强，促进了其浸润和转移的能力〔5〕。因此在癌细胞生长和宿主血管增生的相互促进下，就形成了特有的癌浸润方式和转移的发生。癌周血管生成强度受癌细胞释放血管生成因子质和量的影响，而是否产生血管生成因子和释放程度可能与癌细胞增殖和分化程度有关。
参考文献
1Jakobsson RA,Eneroh CM,Killander D,et al.Histologic classification and grading of malignancy in carcinoma of the larynx.Acta Radiol Ther Phys Biol,1973,12(1):1
, http://www.100md.com
2 Yamamoto E,Miyakawa A,Kohama G.Mode of invasion and metastasis in squamous cell carcinoma of the oral cavity.Head Neck Surg,1994,6:938
3 李龙江.肿瘤血管生成的实验研究方法.国外医学口腔医学分册，1993,20:149
4 Moscatelli D,Gross JL,Rifkon DB.Angiogenic factors stimulate plasminogen activator and collagenase production by capillary endothelial cells.J Cell Biol,1981,91:201a
5 Rastinejad F,Polverini PJ,Bouck NP.Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer suppression gene.Cell,1989,56:345
(收稿：1998-09-21), 百拇医药
单位：四川成都华西医科大学口腔医学院 (李龙江 温玉明 王昌美 610041)；学校医院 (王莉娟)
关键词：癌；肿瘤侵犯；新生血管化
实用口腔医学杂志990503 〔摘要〕目的：了解癌周血管生成对颊癌局部浸润方式形成的影响和关系。方法：收集60例临床病例及病理资料，结合组织学和免疫组织化学手段，光镜下分类颊癌浸润方式并定量计数癌周微血管密度。结果：颊癌浸润生长方式主要有4种：波浪型、团块型、条索型和弥漫型。癌周血管形成与其密切相关，并直接影响颊癌浸润生长方式的形成，其中以条索型和弥漫型浸润生长血管生成最强烈，恶性程度最高，预后最差。结论：上述4种浸润方式均为颊癌局部生长的主要形式，其形成受癌周血管生成的直接影响，两者间有密切的相关关系。癌周血管生成对癌细胞恶性行为的表达及发展至关重要，两者相辅相成。
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The relationships between invasion mode and angiogenesis
of buccal carcinoma
Li Longjiang,Wang Lijuan,Wen Yuming,et al.College of Stomatology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041
〔Abstract〕Objective:To study the relationships between angiogenesis and invasion mode of buccal carcinoma.Methods:The invasion mode of buccal carcinoma was studies histologically and the microvascular density around the lesion was investigated immunohistologically and quantitatively in 60 cases.Results:The invasion modes, wave,mass,code and diffuse type, were observed in the cases.Heigher microvascular density was found in code and diffuse types of the caranoma.Conclusion:Angiogenesis around carcinoma may be related to the invasion mode and play a very important role in malignant phenotype of the lesion.
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Key words Carcinoma;Neoplasm invasiveness;Neovascularization
恶性肿瘤浸润生长是其发生淋巴道及血道转移的前提，也是影响患者治疗效果和预后的重要因素。肿瘤血管生成是恶性细胞进一步增殖、生长、浸润及发生转移的条件。因此，肿瘤以什么样的方式浸润生长与其诱导血管形成密切相关。本文拟通过临床病理资料结合免疫组化定量方法研究颊癌浸润方式与血管生成之间的相互关系，为阐明颊癌局部生物学行为特点及针对肿瘤血管的抗癌治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
收集1984～1988年间华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科接受手术治疗(同时行颈清扫术)的60例颊粘膜鳞癌患者的标本，其中男性33例，女性27例，年龄37～72岁.所有病例均经病理检查证实为颊癌。详细记录患者年龄、性别、肿块大小、肿瘤病理分级及随访资料，全部病例术前未经过放疗和化疗。对肿瘤已扩展到邻近一个或一个以上解剖区者均不纳入。以正常成人(8例男性，19～31岁)颊部组织标本为对照。
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1.2 研究方法
1.2.1 病理切片准备 所有标本均经体积分数为10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色和ABC酶标法染色。
1.2.2 免疫组织化学染色 一抗：鼠抗人Ⅷ因子相关抗原(F8-RA)，美国Dako公司产品，工作滴度1∶80。二抗：生物素化羊抗鼠IgG，美国Dako公司产品，工作滴度1∶200。
ABC复合物 美国Dako公司产品，工作滴度1∶200。
其它 体积分数为5%正常马血清，0.01 mol/L PBS(pH7.4)，0.5 g/L胰蛋白酶消化液(pH7.6)，DAB，二甲苯，酒精，苏木素等。
实验方法 ABC酶标法染色，染色过程中PBS代替一抗作阴性对照，人颌外动脉为阳性对照。
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1.3 微血管计量
经ABC法染色后的切片，血管内皮被褐染。血管计数：任何与附近微血管、肿瘤细胞以及其它结缔组织成分明显分离的褐染的内皮细胞或内皮细胞簇均被认为是单个的微血管。在国产MIAS-200显微图像分析仪下测量癌周区域，低倍镜(40倍)下任意寻找3个区域，再分别于高倍镜(400倍)、面积为0.502 4 mm2下依顺序测量每个区域内的3个视野，共得出9个数据，取其平均值为每个标本的血管密度。对照颊部组织测量方法相同，得出正常参考值。1.4 浸润方式
综合Jakobsson〔1〕和Yamamoto〔2〕等对头颈部鳞癌浸润方式的研究结果，将颊癌局部浸润生长分为4种类型：波浪型、团块型、条索型及弥漫型。
2 结 果
2.1 组织学检查
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光学显微镜观察所有标本均为颊粘膜鳞癌。经F8-RA免疫法染色的切片，内皮细胞胞浆阳性表达。阴性对照不显色，颌外动脉内皮细胞胞浆阳性表达，实验染色效果可靠。
2.2 颊癌浸润生长方式
组织学观察各标本切片，发现颊粘膜鳞癌局部浸润生长主要表现为4种类型，分别为：波浪型(I型)：推挤性生长，边界较清楚，浸润浅，厚度较小，多为外生型生长；团块型(Ⅱ型)：呈团、片或带状生长，浸润面积较大，浸润不深，多为溃疡型；条索型(Ⅲ型)：呈小团块或条索状生长，浸润深，厚度较大；弥漫型(Ⅳ型)：分散成单个细胞或巢状生长，浸润深，厚度大，弥散广泛。各种浸润方式见图1。
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图1 颊癌浸润方式模式图
颊癌不同生长方式临床病理资料记录见表1。
表1 颊癌浸润方式及临床病理资料 浸润
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病理分级*
淋巴结转移
远处转移
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*1971年WHO鳞癌病理分级
资料反映出：波浪型浸润生长占21.7%，团块型占28.3%，条索型占30%，弥漫型占20%。各型之间无明显构成优势。Ⅰ、Ⅱ型30例中，颈淋巴结转移占30%(9/30)；Ⅲ、Ⅳ型30例中，颈淋巴结转移占66%(20/30)，且有2例发生远处转移。
2.3 图像分析测量结果
微血管密度计量结果见表2、3。表2 不同浸润方式高倍镜下血管密度测量均值(条/mm2) 类型
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n
血管密度(
±s)P值
正常人
8
9.71± 3.40
Ⅰ
13
21.64± 8.36
<0.05
Ⅱ
17
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26.82± 9.72
<0.05
Ⅲ
18
35.31±10.14
<0.05
Ⅳ
12
36.03± 9.23
<0.05
表3 不同浸润方式血管密度两两比较q检验 对比类型
血管密度(P值)
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Ⅰ-Ⅱ
<0.05
Ⅰ-Ⅲ
<0.05
Ⅰ-Ⅳ
<0.05
Ⅱ-Ⅲ
<0.05
Ⅱ-Ⅳ
<0.05
Ⅲ-Ⅳ
>0.05
方差齐性检验经变量代换后为齐性。两两q检验结果显示：颊癌癌周血管密度明显高于正常人颊部组织，I型增加约123%(P<0.05)；Ⅱ型增加约176%(P<0.05)；Ⅲ型增加约264%(P<0.05)；Ⅳ型增加约271%(P<0.05)。除Ⅲ型和Ⅳ型间比较无统计学差别外，其余各型间两两比较均具统计学意义(P<0.05)。
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3 讨 论
实体恶性肿瘤向周围组织浸润表现出复杂的生长方式，其生长特征受到癌细胞本身和宿主组织特点的共同影响，从而形成该肿瘤浸润生长的规律。本研究通过组织学观察，发现颊粘膜鳞癌浸润生长方式主要有4种，即：波浪型，团块型，条索型和弥漫型。各种浸润方式生长特点各异，波浪型表现为整体推进性生长，团块型呈多中心集中生长，条索型呈连续放散、深入生长，而弥漫型则广泛弥散于宿主组织内，浸润、破坏性生长。全部60例中团块型和条索型各占30%左右，弥漫型和波浪型各占20%左右。反映出颊癌浸润生长以条索型和团块型占多，而弥漫型和波浪型略少。但各型之间并无明显差异，表明这4种浸润方式均为颊癌局部生长的主要方式，而癌细胞诱导血管生成及发生转移确与浸润方式密切相关。
F8-RA由血管内皮、巨核细胞以及血小板生成。组织培养的内皮细胞也可分泌第Ⅷ因子前体。应用针对血管内皮细胞的单克隆抗体F8-RA免疫法染色，可特异性地使微血管内皮染色〔3〕。本实验中，F8-RA在正常颊粘膜下微血管内皮有表达，显示微血管少量散在分布，这些血管是粘膜下固有的微血管。颊癌中存在大量微血管，分布不均匀，主要集中在肿瘤的周边区和癌巢基底细胞邻近的间质内，癌巢内分布很少，证明癌周区域新生血管丰富。癌细胞以什么样方式浸润生长与癌细胞分化程度及癌周血管增生强度有关。癌细胞分化程度越差，血管密度越大，其浸润方式越复杂，主要表现为条索状或弥漫型生长，颈淋巴结转移率达66%，并出现远处转移。而分化程度较好的肿瘤主要以波浪型和团块型浸润生长，其癌周血管密度相对较低，颈淋巴结转移率仅达30%，未发现远处转移。各种浸润方式中，以波浪型浸润生长恶性程度最低，其癌细胞分化高，癌周血管密度低，几乎很少发生转移(1/13)。团块型浸润生长居中，条索型及弥漫型浸润生长恶性程度最高。因此，在临床工作中通过结合病理检查对肿瘤浸润生长进行分类，就可间接了解癌周血管生成程度及恶性潜能，对选择和制定治疗方案，尤其是手术方案提供可靠的依据。
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肿瘤诱导血管生成之所以影响肿瘤浸润生长方式乃至转移的发生，与癌细胞生长需求及宿主血管反应密切相关。Moscatelli等〔4〕研究发现，肿瘤细胞可持续释放血管生成因子，诱导癌周血管增生，以满足其代谢的需要；在生长着的毛细血管顶端的内皮细胞释放胶原酶和纤维蛋白溶酶原激活剂以便其向组织内生长，这些降解酶可以增强肿瘤细胞脱落能力，便于其向新生血管方向浸润和进入血管、转移。同时，在肿瘤血管生成现象明显加重时，癌抑制基因的功能下降，癌细胞恶性行为增强，促进了其浸润和转移的能力〔5〕。因此在癌细胞生长和宿主血管增生的相互促进下，就形成了特有的癌浸润方式和转移的发生。癌周血管生成强度受癌细胞释放血管生成因子质和量的影响，而是否产生血管生成因子和释放程度可能与癌细胞增殖和分化程度有关。
参考文献
1Jakobsson RA,Eneroh CM,Killander D,et al.Histologic classification and grading of malignancy in carcinoma of the larynx.Acta Radiol Ther Phys Biol,1973,12(1):1
, http://www.100md.com
2 Yamamoto E,Miyakawa A,Kohama G.Mode of invasion and metastasis in squamous cell carcinoma of the oral cavity.Head Neck Surg,1994,6:938
3 李龙江.肿瘤血管生成的实验研究方法.国外医学口腔医学分册，1993,20:149
4 Moscatelli D,Gross JL,Rifkon DB.Angiogenic factors stimulate plasminogen activator and collagenase production by capillary endothelial cells.J Cell Biol,1981,91:201a
5 Rastinejad F,Polverini PJ,Bouck NP.Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer suppression gene.Cell,1989,56:345
(收稿：1998-09-21), 百拇医药