一氧化氮合酶在颌面部软组织创伤修复过程中的细胞定位
作者：朱晓天 周树夏 毛秦雯
单位：厦门口腔医院(朱晓天)；第四军医大学口腔医院(周树夏)；第四军医大学组胚教研室(毛秦雯)
关键词：
实用口腔医学杂志990540 一氧化氮(NO)生物合成的专一途径——L-精氨酸(L-Arg)/一氧化氮(NO)途径，需依赖一族特异性的酶——一氧化氮合酶(NOSs)的催化作用〔1〕。本实验用免疫组织化学方法，观察颌面部制式子弹致伤后伤道组织损伤、修复、愈合过程中一氧化氮合酶(NOSs)细胞定位，证实和明确L-精氨酸(L-Arg)/一氧化氮(NO)途径在该过程中存在的形态学基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料 抗nNOS(神经型)、iNOS(诱导型)和eNOS(内皮型)多克隆抗体为兔IgG，Santa Cruz公司产品，工作浓度为1∶200，ABC试剂盒购于Vector Lab公司。
, 百拇医药
1.2 致伤模型和动物分组 致伤武器：国产5.80 mm实验用弹道枪，5.80 mm制式枪弹，初速度=960 m/s。弹着点为嚼肌前缘中点。实验动物选择：四川产健康成年杂种犬30只，体重平均11.5 kg。致伤前2周驯养，确认身体健康无疾患。按取材时间随机分成5组。
1.3 局部组织取材 致伤后按2、6、24、72 h、7 d几个不同时间点，以伤道为中心，切取伤道周围组织，约1.5 cm×1.6 cm×0.5 cm大小，固定后逐级脱水，石蜡包埋。正常肌肉取对侧嚼肌组织。
1.4 染色石蜡组织切片 常规ABC法染色，DAB显色。硫酸镍铵250 mg，氯化铵4 mg，葡萄糖20 mg，葡萄糖氧化酶1 μg，DAB 5 mg，0.2 M醋酸缓冲液5 ml，双蒸水5 ml。显色5～10 min，阳性结果为蓝黑色。不做复染。对照包括空白对照、正常血清对照、无关抗体替代对照。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 nNOS(NOS-I) 创伤后组织内nNOS(NOS-I)主要分布在骨骼肌细胞，其他细胞少见阳性。伤后2 h，肌肉组织断裂、弯曲，可见部分呈阳性；6～24 h，阳性的肌肉组织增多，阳性结构为细颗粒状附着在肌丝上，充满肌纤维内(图1)，72 h和7 d，组织内几乎看不到阳性细胞。对照均为阴性。
2.2 iNOS(NOS-Ⅱ) iNOS(NOS-Ⅱ)阳性的细胞较多，包括炎细胞、成纤维细胞、小血管内皮细胞等。6～24 h，肌肉和结缔组织间大量的iNOS(NOS-Ⅱ)阳性炎细胞浸润，主要为巨噬细胞和中性粒细胞，阳性物质充满细胞胞浆，呈粗颗粒样，细胞核则呈空泡样(未做衬染)(图2)；24 h还可见少数阳性的成纤维细胞和内皮细胞。72 h阳性的炎细胞有所减少，胞浆呈阳性(图3)，周围肌细胞阳性较弱。7 d，组织内肌细胞，肉芽组织中成纤维细胞、血管内皮细胞阳性多见，一些血管内皮和小血管出现阳性(图4)；少数坏死灶周围的炎细胞也明显呈阳性。正常的肌肉组织中未见阳性，对照均为阴性。
, 百拇医药
图1
图2
图3
图4
2.3 eNOS(NOS-Ⅲ) 主要分布于小血管内皮；创伤后的早期，组织内少见阳性细胞；致伤后72 h，较早出现修复的组织间，新生毛细血管内皮细胞以及小血管动静脉内皮细胞部分有阳性；7 d，伤口由肉芽组织充填，新生毛细血管内皮细胞可呈阳性。正常对照中，部分肌间小血管可呈弱阳性。
3 讨 论
, 百拇医药
颌面部枪弹伤后软组织创伤修复过程的调控十分复杂，尚未提及一氧化氮(NO)在其中的意义和作用。在对NO和NO生成途径及其意义的研究中，可以通过组织形态学的方法，确定NOSs在组织内的分布和细胞定位，从而明确L-Arg/NO途径存在的形态学基础，并提示组织内NO生成的细胞来源。目前已克隆的NOS有3种：nNOS，iNOS和eNOS。
实验结果显示，伤后组织内多种细胞能表达iNOS的活性，特别是伤后早期。提示此时组织内有多种细胞的iNOS被激活，启动了L-Arg/NO途径，组织内有大量的NO生成；7 d时肉芽组织内iNOS阳性的炎细胞较24 h减少，而可见成纤维细胞和部分血管内皮细胞iNOS阳性，提示这些参与组织增殖修复的主要细胞此时也生成NO，参与组织的愈合过程。组织创伤后，各种组织细胞被激活，可释放多种细胞因子如：IL、TNF、TGF及IFN等，这些因子可趋化多种细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等进入伤口组织周围，参与损伤后的炎症反应和修复愈合过程。而这些细胞因子是iNOS重要的刺激因子，在它们的协同作用下，多种类型的细胞可释放大量的NO；而组织内大量NO的生成，可能是参与组织损伤的重要因素。另外，NO的生成，能够导致生成NO的巨噬细胞、中性粒细胞等自身的凋亡，因而又可能是调控炎症消散和炎症反应自限性的原因之一〔2〕。神经型NOS也可由缺血、机械刺激等因素激活〔3〕，因而本实验中，在伤后2～24 h内，肌细胞内nNOS阳性可能由于机械损伤和组织内微循环障碍的刺激所致。eNOS在正常组织内的阳性很弱，而组织创伤后24 h扩张的小血管内皮细胞可呈阳性；组织修复时肉芽组织中，大量新生的毛细血管内皮细胞显示较强阳性，提示eNOS生成的NO，在组织增殖修复阶段，对调节小血管、新生毛细血管的扩张、血流量的增加和组织内的物质交换有重要作用。
, 百拇医药
NO作用的结果具有“两面性”，与其组织来源和生成的量关系密切。许多细胞因子介导的NO生成往往来源于iNOS，其生成NO的量大，进而能够产生组织致伤因子如羟自由基(-OH)、过氧化硝基阴离子(-ONOO)等，并可促进脂质过氧化反应等〔4〕；来源于eNOS和 nNOS的NO，对调节机体内部的生理稳态有积极作用。本实验的结果显示了颌面部枪弹伤组织中L-Arg/NO途径存在的形态基础，3种酶在不同时间和空间的表达提示了各自的生理意义；而NO对该过程的参与和调节，取决于3种酶在不同情况下生成NO的共同作用。进而也说明，颌面部枪弹伤后软组织创伤修复过程中，组织内既有导致组织进行性破坏的因素，又有有利于组织修复愈合的因素。因此，利用组织创伤修复过程中存在的L-Arg/NO途径，适时地应用L-Arg或NOS的类似物L-NMMA、L-NAME等促进或竞争抑制NO的生成，以减少组织损伤，促进伤口愈合，可能会成为治疗颌面部软组织枪弹伤的新方法。
参考文献
, 百拇医药 1 Moncada S,F.R.S,Higgs A.The L-Arginine-nitric oxide pathway.N Engl J Med,1993,329:2002
2 Albina JE,Cui S,Mateo RB,et al.Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macrophages.J Immunol,1993,150(11):5080
3 于宝生.一氧化氮合酶及其调节.国外医学生理、病理科学与临床分册,1996,16:220
4 Preiser JC,Reper P,Vlasselaer D,et al.Nitric oxide production is increased in patients after burn injury.J Trauma.1996,40:368
(收稿：1999-03-10), 百拇医药
单位：厦门口腔医院(朱晓天)；第四军医大学口腔医院(周树夏)；第四军医大学组胚教研室(毛秦雯)
关键词：
实用口腔医学杂志990540 一氧化氮(NO)生物合成的专一途径——L-精氨酸(L-Arg)/一氧化氮(NO)途径，需依赖一族特异性的酶——一氧化氮合酶(NOSs)的催化作用〔1〕。本实验用免疫组织化学方法，观察颌面部制式子弹致伤后伤道组织损伤、修复、愈合过程中一氧化氮合酶(NOSs)细胞定位，证实和明确L-精氨酸(L-Arg)/一氧化氮(NO)途径在该过程中存在的形态学基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料 抗nNOS(神经型)、iNOS(诱导型)和eNOS(内皮型)多克隆抗体为兔IgG，Santa Cruz公司产品，工作浓度为1∶200，ABC试剂盒购于Vector Lab公司。
, 百拇医药
1.2 致伤模型和动物分组 致伤武器：国产5.80 mm实验用弹道枪，5.80 mm制式枪弹，初速度=960 m/s。弹着点为嚼肌前缘中点。实验动物选择：四川产健康成年杂种犬30只，体重平均11.5 kg。致伤前2周驯养，确认身体健康无疾患。按取材时间随机分成5组。
1.3 局部组织取材 致伤后按2、6、24、72 h、7 d几个不同时间点，以伤道为中心，切取伤道周围组织，约1.5 cm×1.6 cm×0.5 cm大小，固定后逐级脱水，石蜡包埋。正常肌肉取对侧嚼肌组织。
1.4 染色石蜡组织切片 常规ABC法染色，DAB显色。硫酸镍铵250 mg，氯化铵4 mg，葡萄糖20 mg，葡萄糖氧化酶1 μg，DAB 5 mg，0.2 M醋酸缓冲液5 ml，双蒸水5 ml。显色5～10 min，阳性结果为蓝黑色。不做复染。对照包括空白对照、正常血清对照、无关抗体替代对照。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 nNOS(NOS-I) 创伤后组织内nNOS(NOS-I)主要分布在骨骼肌细胞，其他细胞少见阳性。伤后2 h，肌肉组织断裂、弯曲，可见部分呈阳性；6～24 h，阳性的肌肉组织增多，阳性结构为细颗粒状附着在肌丝上，充满肌纤维内(图1)，72 h和7 d，组织内几乎看不到阳性细胞。对照均为阴性。
2.2 iNOS(NOS-Ⅱ) iNOS(NOS-Ⅱ)阳性的细胞较多，包括炎细胞、成纤维细胞、小血管内皮细胞等。6～24 h，肌肉和结缔组织间大量的iNOS(NOS-Ⅱ)阳性炎细胞浸润，主要为巨噬细胞和中性粒细胞，阳性物质充满细胞胞浆，呈粗颗粒样，细胞核则呈空泡样(未做衬染)(图2)；24 h还可见少数阳性的成纤维细胞和内皮细胞。72 h阳性的炎细胞有所减少，胞浆呈阳性(图3)，周围肌细胞阳性较弱。7 d，组织内肌细胞，肉芽组织中成纤维细胞、血管内皮细胞阳性多见，一些血管内皮和小血管出现阳性(图4)；少数坏死灶周围的炎细胞也明显呈阳性。正常的肌肉组织中未见阳性，对照均为阴性。
, 百拇医药
图1
图2
图3
图4
2.3 eNOS(NOS-Ⅲ) 主要分布于小血管内皮；创伤后的早期，组织内少见阳性细胞；致伤后72 h，较早出现修复的组织间，新生毛细血管内皮细胞以及小血管动静脉内皮细胞部分有阳性；7 d，伤口由肉芽组织充填，新生毛细血管内皮细胞可呈阳性。正常对照中，部分肌间小血管可呈弱阳性。
3 讨 论
, 百拇医药
颌面部枪弹伤后软组织创伤修复过程的调控十分复杂，尚未提及一氧化氮(NO)在其中的意义和作用。在对NO和NO生成途径及其意义的研究中，可以通过组织形态学的方法，确定NOSs在组织内的分布和细胞定位，从而明确L-Arg/NO途径存在的形态学基础，并提示组织内NO生成的细胞来源。目前已克隆的NOS有3种：nNOS，iNOS和eNOS。
实验结果显示，伤后组织内多种细胞能表达iNOS的活性，特别是伤后早期。提示此时组织内有多种细胞的iNOS被激活，启动了L-Arg/NO途径，组织内有大量的NO生成；7 d时肉芽组织内iNOS阳性的炎细胞较24 h减少，而可见成纤维细胞和部分血管内皮细胞iNOS阳性，提示这些参与组织增殖修复的主要细胞此时也生成NO，参与组织的愈合过程。组织创伤后，各种组织细胞被激活，可释放多种细胞因子如：IL、TNF、TGF及IFN等，这些因子可趋化多种细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等进入伤口组织周围，参与损伤后的炎症反应和修复愈合过程。而这些细胞因子是iNOS重要的刺激因子，在它们的协同作用下，多种类型的细胞可释放大量的NO；而组织内大量NO的生成，可能是参与组织损伤的重要因素。另外，NO的生成，能够导致生成NO的巨噬细胞、中性粒细胞等自身的凋亡，因而又可能是调控炎症消散和炎症反应自限性的原因之一〔2〕。神经型NOS也可由缺血、机械刺激等因素激活〔3〕，因而本实验中，在伤后2～24 h内，肌细胞内nNOS阳性可能由于机械损伤和组织内微循环障碍的刺激所致。eNOS在正常组织内的阳性很弱，而组织创伤后24 h扩张的小血管内皮细胞可呈阳性；组织修复时肉芽组织中，大量新生的毛细血管内皮细胞显示较强阳性，提示eNOS生成的NO，在组织增殖修复阶段，对调节小血管、新生毛细血管的扩张、血流量的增加和组织内的物质交换有重要作用。
, 百拇医药
NO作用的结果具有“两面性”，与其组织来源和生成的量关系密切。许多细胞因子介导的NO生成往往来源于iNOS，其生成NO的量大，进而能够产生组织致伤因子如羟自由基(-OH)、过氧化硝基阴离子(-ONOO)等，并可促进脂质过氧化反应等〔4〕；来源于eNOS和 nNOS的NO，对调节机体内部的生理稳态有积极作用。本实验的结果显示了颌面部枪弹伤组织中L-Arg/NO途径存在的形态基础，3种酶在不同时间和空间的表达提示了各自的生理意义；而NO对该过程的参与和调节，取决于3种酶在不同情况下生成NO的共同作用。进而也说明，颌面部枪弹伤后软组织创伤修复过程中，组织内既有导致组织进行性破坏的因素，又有有利于组织修复愈合的因素。因此，利用组织创伤修复过程中存在的L-Arg/NO途径，适时地应用L-Arg或NOS的类似物L-NMMA、L-NAME等促进或竞争抑制NO的生成，以减少组织损伤，促进伤口愈合，可能会成为治疗颌面部软组织枪弹伤的新方法。
参考文献
, 百拇医药 1 Moncada S,F.R.S,Higgs A.The L-Arginine-nitric oxide pathway.N Engl J Med,1993,329:2002
2 Albina JE,Cui S,Mateo RB,et al.Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macrophages.J Immunol,1993,150(11):5080
3 于宝生.一氧化氮合酶及其调节.国外医学生理、病理科学与临床分册,1996,16:220
4 Preiser JC,Reper P,Vlasselaer D,et al.Nitric oxide production is increased in patients after burn injury.J Trauma.1996,40:368
(收稿：1999-03-10), 百拇医药