磁导向甲氨蝶呤缓释药物的药学参数检测
作者：张皖清 孙玉鹏 毛天球 何远辉 徐来斌
单位：张皖清(第四军医大学口腔医学院，710032；现在304医院工作)；孙玉鹏(解放军304医院骨科)；毛天球(第四军医大学口腔医学院，710032)；何远辉(西南应用磁学研究所)；徐来斌(西安近代化学研究所)
关键词：甲氨蝶呤；磁微球；靶向给药系统
实用口腔医学杂志000121 摘 要：目的：探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)的药学参数。方法：采用分光光谱法、高效液相色谱法、原子吸收光谱法检测磁导向甲氨蝶呤缓释药物的含量及组成，并对FM-MTX的比重、沸点、粒径和稳定性进行检测。结果：HPLC法检测FM-MTX中MTX药物含量为260 mg/L。Fe3O4平均含量为66.29 mg/L。FM-MTX粒度分布均匀，粒径为0.4～1.0 μm，占88.61%。FM-MTX药物含量稳定，放置6个月，含量未见明显变化。结论：应用化学交联法研制的磁导向甲氨蝶呤缓释药物基本可满足血管内给药的质控要求。
, 百拇医药
分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0065-03
Determination of pharmaceutical parameters of ferromagnetic methotrexate albumin microspheres
Zhang Wanqing Sun Yupeng Mao Tianqiu et al.
(Stomatological Hospital,Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Abstract：Objective： To determine pharmaceutical parameters of magnetic targeted ferromagnetic albumin methotrexate conjugates (FM-MTX) as a slow release antitumor drug.Methods:The pharmaceutical parameters of FM-MTX were determined with ultraviolet spectrophotometry,high performance liquid chromatography (HPLC) and atomic absorption spectrophotometry.Results:The mean content of methotrexate in FM-MTX was 260 mg/L and Fe3O4 66.29 mg/L. The diameter of FM-MTX particles was 0.8～1.0 μm.The measurements of the preparation were stable within 6 months.Conclusion:FM-MTX is stable in both contents and particle size.
, 百拇医药
Key words：Methotrexate;Magnetic microspheres; Targeting drug delivery system
甲氨蝶呤为抗代谢类抗肿瘤药物，它通过抑制二氢叶酸还原酶影响四氢叶酸的生成，阻止嘌呤环和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的合成，从而抑制肿瘤细胞DNA和RNA的合成。甲氨蝶呤在临床上广泛应用于头颈部肿瘤、成骨肉瘤、白血病、乳癌及卵巢肿瘤的化学治疗〔1〕。因其有骨髓抑制、肝肾损害及胃肠道反应，临床应用受到了限制〔2〕。虽可采用甲酰四氢叶酸CF解毒，但易产生耐药性，使临床用药剂量加大〔3〕。为了降低用药剂量，发挥药物在肿瘤组织靶区高效杀伤肿瘤细胞的作用，我们制备了磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物〔4〕。本研究对其理化性能等进行检测，为该药物建立质量控制标准提供药学参数。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 仪器与试剂
紫外分光光度计(日本 岛津UV-2201型)。高效液相色谱系统(美国Beckman GOLD系统)。色谱条件：色谱柱150 mm×4 mm，填料YWG-C18，直径10 μm；流动相：甲醇pH6.0，磷酸缓冲液v:v=40:60，流速1.0 ml/min，检测波长：306 nm，进样量100 μl。原子吸收光谱仪(日本 岛津AA-670型)。测定条件：Fe原子测定，灯电流15 mA，波长为248.3 nm，空气压力156.89 kPa，乙炔气压力25.49 kPa。
试剂：甲醇、HCl、Na2CO3均为分析纯。磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物(FM-MTX)，来源及制备方法见参考文献〔4〕。
1.2 高效液相色谱法标准曲线绘制及MTX药物含量检测〔5〕
, 百拇医药
精密称取MTX标准品1 mg，放置于20 ml容量瓶中，终浓度为50 mg/L。再依次稀释成5、4、3、2、1 mg/L。各吸取1 ml上样，在高效液相色谱仪(HPLC)上检测306 nm处的MTX峰值及峰面积。以峰高为纵坐标，MTX浓度为横坐标，拟合标准曲线方程〔3〕。精密吸取FM-MTX 0.1 ml，分别稀释成10、100、1000 ml。各取1 ml上样，在HPLC上检测MTX特征峰，以峰高及面积在标准曲线上求得MTX药物浓度。
1.3 原子吸收光谱法Fe3O4含量检测
精密吸取FM-MTX 0.1 ml3份，加10 ml HNO3-HClO4(4∶1)消化液，盖上表面皿，置电垫板上低温消化至液体透明，大火蒸干，无碳化时取下，加体积分数为0.2 HNO3溶解残渣，用去离子水定容至10 ml，在原子吸收光谱仪上进行Fe原子测定。按3份样品计算均值标准差，按Fe分子量55.847，O分子量15.9994计算Fe3O4含量。
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Fe3O4含量=(231.5386)/(167.541)×Fe含量=1.382×Fe含量
1.4 比重检测
收集不同批号样品，采用比重瓶法测定样品比重。取洁净、干燥并精密称定重量的比重瓶，装满样品，装上温度计后置25 ℃左右的水浴中浸渍10～20 min，用滤纸除去溢出测管的液体，立即盖上罩，精密称重，减去比重瓶重量，即得供试品的重量。将样品倾去，待洗净比重瓶后，装满新沸过的冷蒸馏水，再依上法测量同一温度水的重量，计算样品比重。
1.5 沸点检测
取样品装入蒸馏器中，校正到标准压力(101.3 kPa，即760 mm Hg)下，自开始馏出第5滴算起，此时的温度即为样品的沸点，馏至样品仅剩3～4 ml时的温度范围为沸程。
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1.6 粒径分析
将FM-MTX稀释20倍后，使之在10 g/L Nacl溶液中分散良好，经库尔特计数器测定其粒径。测定微球数约20000个，以粒径为横座标，微球百分率为纵座标作图，分别测定其粒径中位数。
1.7 稳定性检测
将瓶装密封的FM-MTX置于40 ℃75%RH的条件下进行稳定性检测。3个月、6个月后分别取样测定含量及粒径分布。
2 结 果
2.1 高效液相色谱测定结果
MTX分子量恒定，其极性结构在甲醇洗脱液中为恒定峰。MTX标准品在反相高效液相色谱仪上呈现恒定单峰型，样品出峰时间一致，为8.9 min〔4〕。
, 百拇医药
FM-MTX样品HPLC峰型及出峰时间与MTX标准品一致(图1)。稀释100倍的样品，以离心后过滤膜，在HPLC测得的峰高在HPLC MTX标准曲线上求得MTX含量为260 mg/L；从而证实FM-MTX样品原药中MTX含量为260 mg/L。
图1 FM-MTX HPLC峰型
2.2 FM-MTX中Fe3O4含量测定结果
取FM-MTX样品3份，每份在原子吸收光谱仪上测定3次，Fe元素含量为(47.97±0.52) mg/L，即Fe3O4平均含量为66.29 mg/L。
2.3 比重测定
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采用比重瓶法检测出FM-MTX药物在25 ℃时的比重为982.2 g/L，较25 ℃时水的比重略轻(997 g/L)。这可能是由于表面活性剂及交联剂的应用降低了药物的沉降系数，导致比重下降。
2.4 沸点测定
利用蒸馏法测出FM-MTX及FM的沸点如表1所示。FM-MTX药物的沸点与介质水非常接近。
表1 FM-MTX沸点测定结果(℃) 受检物质
沸点
FM-MTX
99.82
FM
99.45
, 百拇医药
水
99.80
2.5 粒径分布
FM-MTX粒度分布均匀，粒径为0.4～1.0 μm，占88.61%(图2)。
图2 FM-MTX粒径分布
2.6 稳定性分析结果
在40 ℃ 75%RH条件下放置6个月，含量未见明显变化。药物粒径以库尔特计数仪测定，未见颗粒明显变大和粘结现象。FM-MTX在0～6个不同粒径百分比见表2。
3 讨 论
甲氨蝶呤磁性抗癌药FM-MTX由甲氨蝶呤通过中间载体与磁液进行化学交联制备而成。它集甲氨蝶呤的抗肿瘤药学特性和磁定位导向性于一体，是一种新型靶向抗癌药物。FM-MTX制成后，首先要对其各组成成份进行检测，包括MTX含量、白蛋白含量、Fe3O4含量；并对其理化性能及稳定进行测定。这是甲氨蝶呤磁性药物剂质量控制的重要特性参数。
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表2 FM-MTX颗粒组成(%) 粒径(μm)
时间
0月
3个月
6个月
<0.2
0.61
0.87
0.94
0.2～0.4
4.50
2.32
2.56
, 百拇医药
0.4～0.6
20.46
21.56
20.47
0.6～0.8
32.88
34.42
34.20
0.8～1.0
35.27
36.87
35.17
1.0～1.2
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4.81
3.80
4.62
1.2～1.4
1.47
0.16
1.95
甲氨蝶呤紫外光谱扫描显示，其盐酸溶液在244 nm、306 nm波长处有最大吸收，在234 nm、262 nm波长处有最小吸收。我们利用MTX的上述特性，分别进行了紫外分光光度计法测定，反相高效液相色谱法测定，结果以HPLC较佳，测得FM-MTX中MTX含量为260 mg/L。Fe3O4含量采用浓硝酸水解后其水溶液应用原子吸收光谱法测定铁离子的含量，再推算出Fe3O4的含量，并按分子量推算其克分子摩尔比。
, 百拇医药
常规的粒度分析方法有筛分法、沉降法、气隙法等。这些方法在分析粒子较大的颗粒样品是有效的，但对于颗粒粒度小于1 μm左右的试样，其分析结果不能令人满意。自然沉降法对粒度小于5 μm的样品，沉降已有困难，数据重复性很差，而气隙法得出的平均粒度则明显小于试样的实际粒度，颗粒越细其表面积越大，所引起的表面吸引力也越强。我们在X射线能谱仪的图像分析基础上，应用激光粒度分析仪对样品粒度百分比进行检测，给出粒径分布直方图，小于1 μm者占80%以上，达到满意的药用要求。
为了了解药物的元素组成，我们采用空间分辩力X射线能量色散谱(EDS)对FM-MTX进行了组成成份分析。根据不同元素电子跃迁前后的能级不同而得出特征性X射线波长，得到按能量展开的特征性X射线能量分析图，应用相应的软件处理这些能谱图，就可以进行谱峰的定性和定量分析。结果显示，FM-MTX的主成份以Fe,Na,Cl,O,C,S为主〔6〕。说明该药物基本可满足血管内给药的质控要求。
, 百拇医药 基金项目：国家自然科学基金资助项目 39070871
国家新药基金资助项目 93-(62)-N-42
参考文献：
[1]中华人民共和国药典二部.北京：人民卫生出版社,1990
[2]Friedman M,Denarvaes FN,Daly JF.Treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck with combined methotrexate and irradiation.Cancer,1970,26:711
[3]Lemberg A,Daunas JA,Brodoff BB,et al.Action of methotrexate on metabolism of lipid and carbohydrates of the perfused isolated liver.Cancer,1967,20:1668
, http://www.100md.com
[4]张皖清,毛天球,孙玉鹏,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的研制及含量测定.实用口腔医学杂志,2000,16(1):61
[5]Iven H,Bartels H.High-performance liquid chromatographic and enzyme inhibition assays of MTX concentrations in serum from patients receiving high-therapy.Cancer Treatment Report,1985,69:825
[6]张皖清,孙玉鹏,毛天球,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的形貌特征及缓释特性,实用口腔医学杂志,2000,16(1)：68
收稿日期：1998-08-24
修改日期：1999-11-01, 百拇医药
单位：张皖清(第四军医大学口腔医学院，710032；现在304医院工作)；孙玉鹏(解放军304医院骨科)；毛天球(第四军医大学口腔医学院，710032)；何远辉(西南应用磁学研究所)；徐来斌(西安近代化学研究所)
关键词：甲氨蝶呤；磁微球；靶向给药系统
实用口腔医学杂志000121 摘 要：目的：探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)的药学参数。方法：采用分光光谱法、高效液相色谱法、原子吸收光谱法检测磁导向甲氨蝶呤缓释药物的含量及组成，并对FM-MTX的比重、沸点、粒径和稳定性进行检测。结果：HPLC法检测FM-MTX中MTX药物含量为260 mg/L。Fe3O4平均含量为66.29 mg/L。FM-MTX粒度分布均匀，粒径为0.4～1.0 μm，占88.61%。FM-MTX药物含量稳定，放置6个月，含量未见明显变化。结论：应用化学交联法研制的磁导向甲氨蝶呤缓释药物基本可满足血管内给药的质控要求。
, 百拇医药
分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0065-03
Determination of pharmaceutical parameters of ferromagnetic methotrexate albumin microspheres
Zhang Wanqing Sun Yupeng Mao Tianqiu et al.
(Stomatological Hospital,Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Abstract：Objective： To determine pharmaceutical parameters of magnetic targeted ferromagnetic albumin methotrexate conjugates (FM-MTX) as a slow release antitumor drug.Methods:The pharmaceutical parameters of FM-MTX were determined with ultraviolet spectrophotometry,high performance liquid chromatography (HPLC) and atomic absorption spectrophotometry.Results:The mean content of methotrexate in FM-MTX was 260 mg/L and Fe3O4 66.29 mg/L. The diameter of FM-MTX particles was 0.8～1.0 μm.The measurements of the preparation were stable within 6 months.Conclusion:FM-MTX is stable in both contents and particle size.
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Key words：Methotrexate;Magnetic microspheres; Targeting drug delivery system
甲氨蝶呤为抗代谢类抗肿瘤药物，它通过抑制二氢叶酸还原酶影响四氢叶酸的生成，阻止嘌呤环和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的合成，从而抑制肿瘤细胞DNA和RNA的合成。甲氨蝶呤在临床上广泛应用于头颈部肿瘤、成骨肉瘤、白血病、乳癌及卵巢肿瘤的化学治疗〔1〕。因其有骨髓抑制、肝肾损害及胃肠道反应，临床应用受到了限制〔2〕。虽可采用甲酰四氢叶酸CF解毒，但易产生耐药性，使临床用药剂量加大〔3〕。为了降低用药剂量，发挥药物在肿瘤组织靶区高效杀伤肿瘤细胞的作用，我们制备了磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物〔4〕。本研究对其理化性能等进行检测，为该药物建立质量控制标准提供药学参数。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 仪器与试剂
紫外分光光度计(日本 岛津UV-2201型)。高效液相色谱系统(美国Beckman GOLD系统)。色谱条件：色谱柱150 mm×4 mm，填料YWG-C18，直径10 μm；流动相：甲醇pH6.0，磷酸缓冲液v:v=40:60，流速1.0 ml/min，检测波长：306 nm，进样量100 μl。原子吸收光谱仪(日本 岛津AA-670型)。测定条件：Fe原子测定，灯电流15 mA，波长为248.3 nm，空气压力156.89 kPa，乙炔气压力25.49 kPa。
试剂：甲醇、HCl、Na2CO3均为分析纯。磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物(FM-MTX)，来源及制备方法见参考文献〔4〕。
1.2 高效液相色谱法标准曲线绘制及MTX药物含量检测〔5〕
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精密称取MTX标准品1 mg，放置于20 ml容量瓶中，终浓度为50 mg/L。再依次稀释成5、4、3、2、1 mg/L。各吸取1 ml上样，在高效液相色谱仪(HPLC)上检测306 nm处的MTX峰值及峰面积。以峰高为纵坐标，MTX浓度为横坐标，拟合标准曲线方程〔3〕。精密吸取FM-MTX 0.1 ml，分别稀释成10、100、1000 ml。各取1 ml上样，在HPLC上检测MTX特征峰，以峰高及面积在标准曲线上求得MTX药物浓度。
1.3 原子吸收光谱法Fe3O4含量检测
精密吸取FM-MTX 0.1 ml3份，加10 ml HNO3-HClO4(4∶1)消化液，盖上表面皿，置电垫板上低温消化至液体透明，大火蒸干，无碳化时取下，加体积分数为0.2 HNO3溶解残渣，用去离子水定容至10 ml，在原子吸收光谱仪上进行Fe原子测定。按3份样品计算均值标准差，按Fe分子量55.847，O分子量15.9994计算Fe3O4含量。
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Fe3O4含量=(231.5386)/(167.541)×Fe含量=1.382×Fe含量
1.4 比重检测
收集不同批号样品，采用比重瓶法测定样品比重。取洁净、干燥并精密称定重量的比重瓶，装满样品，装上温度计后置25 ℃左右的水浴中浸渍10～20 min，用滤纸除去溢出测管的液体，立即盖上罩，精密称重，减去比重瓶重量，即得供试品的重量。将样品倾去，待洗净比重瓶后，装满新沸过的冷蒸馏水，再依上法测量同一温度水的重量，计算样品比重。
1.5 沸点检测
取样品装入蒸馏器中，校正到标准压力(101.3 kPa，即760 mm Hg)下，自开始馏出第5滴算起，此时的温度即为样品的沸点，馏至样品仅剩3～4 ml时的温度范围为沸程。
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1.6 粒径分析
将FM-MTX稀释20倍后，使之在10 g/L Nacl溶液中分散良好，经库尔特计数器测定其粒径。测定微球数约20000个，以粒径为横座标，微球百分率为纵座标作图，分别测定其粒径中位数。
1.7 稳定性检测
将瓶装密封的FM-MTX置于40 ℃75%RH的条件下进行稳定性检测。3个月、6个月后分别取样测定含量及粒径分布。
2 结 果
2.1 高效液相色谱测定结果
MTX分子量恒定，其极性结构在甲醇洗脱液中为恒定峰。MTX标准品在反相高效液相色谱仪上呈现恒定单峰型，样品出峰时间一致，为8.9 min〔4〕。
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FM-MTX样品HPLC峰型及出峰时间与MTX标准品一致(图1)。稀释100倍的样品，以离心后过滤膜，在HPLC测得的峰高在HPLC MTX标准曲线上求得MTX含量为260 mg/L；从而证实FM-MTX样品原药中MTX含量为260 mg/L。
图1 FM-MTX HPLC峰型
2.2 FM-MTX中Fe3O4含量测定结果
取FM-MTX样品3份，每份在原子吸收光谱仪上测定3次，Fe元素含量为(47.97±0.52) mg/L，即Fe3O4平均含量为66.29 mg/L。
2.3 比重测定
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采用比重瓶法检测出FM-MTX药物在25 ℃时的比重为982.2 g/L，较25 ℃时水的比重略轻(997 g/L)。这可能是由于表面活性剂及交联剂的应用降低了药物的沉降系数，导致比重下降。
2.4 沸点测定
利用蒸馏法测出FM-MTX及FM的沸点如表1所示。FM-MTX药物的沸点与介质水非常接近。
表1 FM-MTX沸点测定结果(℃) 受检物质
沸点
FM-MTX
99.82
FM
99.45
, 百拇医药
水
99.80
2.5 粒径分布
FM-MTX粒度分布均匀，粒径为0.4～1.0 μm，占88.61%(图2)。
图2 FM-MTX粒径分布
2.6 稳定性分析结果
在40 ℃ 75%RH条件下放置6个月，含量未见明显变化。药物粒径以库尔特计数仪测定，未见颗粒明显变大和粘结现象。FM-MTX在0～6个不同粒径百分比见表2。
3 讨 论
甲氨蝶呤磁性抗癌药FM-MTX由甲氨蝶呤通过中间载体与磁液进行化学交联制备而成。它集甲氨蝶呤的抗肿瘤药学特性和磁定位导向性于一体，是一种新型靶向抗癌药物。FM-MTX制成后，首先要对其各组成成份进行检测，包括MTX含量、白蛋白含量、Fe3O4含量；并对其理化性能及稳定进行测定。这是甲氨蝶呤磁性药物剂质量控制的重要特性参数。
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表2 FM-MTX颗粒组成(%) 粒径(μm)
时间
0月
3个月
6个月
<0.2
0.61
0.87
0.94
0.2～0.4
4.50
2.32
2.56
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0.4～0.6
20.46
21.56
20.47
0.6～0.8
32.88
34.42
34.20
0.8～1.0
35.27
36.87
35.17
1.0～1.2
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4.81
3.80
4.62
1.2～1.4
1.47
0.16
1.95
甲氨蝶呤紫外光谱扫描显示，其盐酸溶液在244 nm、306 nm波长处有最大吸收，在234 nm、262 nm波长处有最小吸收。我们利用MTX的上述特性，分别进行了紫外分光光度计法测定，反相高效液相色谱法测定，结果以HPLC较佳，测得FM-MTX中MTX含量为260 mg/L。Fe3O4含量采用浓硝酸水解后其水溶液应用原子吸收光谱法测定铁离子的含量，再推算出Fe3O4的含量，并按分子量推算其克分子摩尔比。
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常规的粒度分析方法有筛分法、沉降法、气隙法等。这些方法在分析粒子较大的颗粒样品是有效的，但对于颗粒粒度小于1 μm左右的试样，其分析结果不能令人满意。自然沉降法对粒度小于5 μm的样品，沉降已有困难，数据重复性很差，而气隙法得出的平均粒度则明显小于试样的实际粒度，颗粒越细其表面积越大，所引起的表面吸引力也越强。我们在X射线能谱仪的图像分析基础上，应用激光粒度分析仪对样品粒度百分比进行检测，给出粒径分布直方图，小于1 μm者占80%以上，达到满意的药用要求。
为了了解药物的元素组成，我们采用空间分辩力X射线能量色散谱(EDS)对FM-MTX进行了组成成份分析。根据不同元素电子跃迁前后的能级不同而得出特征性X射线波长，得到按能量展开的特征性X射线能量分析图，应用相应的软件处理这些能谱图，就可以进行谱峰的定性和定量分析。结果显示，FM-MTX的主成份以Fe,Na,Cl,O,C,S为主〔6〕。说明该药物基本可满足血管内给药的质控要求。
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国家新药基金资助项目 93-(62)-N-42
参考文献：
[1]中华人民共和国药典二部.北京：人民卫生出版社,1990
[2]Friedman M,Denarvaes FN,Daly JF.Treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck with combined methotrexate and irradiation.Cancer,1970,26:711
[3]Lemberg A,Daunas JA,Brodoff BB,et al.Action of methotrexate on metabolism of lipid and carbohydrates of the perfused isolated liver.Cancer,1967,20:1668
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[4]张皖清,毛天球,孙玉鹏,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的研制及含量测定.实用口腔医学杂志,2000,16(1):61
[5]Iven H,Bartels H.High-performance liquid chromatographic and enzyme inhibition assays of MTX concentrations in serum from patients receiving high-therapy.Cancer Treatment Report,1985,69:825
[6]张皖清,孙玉鹏,毛天球,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的形貌特征及缓释特性,实用口腔医学杂志,2000,16(1)：68
收稿日期：1998-08-24
修改日期：1999-11-01, 百拇医药