人牙髓组织中骨形成蛋白-3基因表达的原位分子杂交研究
作者：王忠东 文玲英 金岩 顾广玉 肖明振 司晓辉
单位：王忠东(第四军医大学口腔医学院 710032)；文玲英(第四军医大学口腔医学院 710032)；金岩(第四军医大学口腔医学院 710032)；肖明振(第四军医大学口腔医学院 710032)；司晓辉(第四军医大学口腔医学院 710032)；顾广玉(第二军医大学附属长海医院病理科 200433)
关键词：牙髓；骨形成蛋白-3；原位杂交
实用口腔医学杂志000407〔摘要〕目的：研究BMP3基因在人正常、龋病及炎症状态下牙髓组织中的表达。方法：利用地高辛甙元标记的BMP3 cDNA探针对人牙髓组织进行原位分子杂交。结果：正常人牙髓组织的成牙本质细胞有弱阳性杂交信号出现。在有修复性牙本质形成的深龋牙髓组织和有脓肿形成的炎症牙髓组织中，在修复性牙本质下方的成牙本质细胞有丰富的阳性杂交信号出现，还可同时见到在血管周边有阳性杂交信号的未分化间充质样细胞。结论：成熟的功能性成牙本质细胞在一定程度的龋源性炎症刺激下，其BMP3基因激活并表达，对牙髓组织的自身修复过程具有重要意义；其表达的强弱与细胞的分化程度及所处的功能状态相关。
中图分类号：780.2 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)04-0275-04
Expressing of BMP3 mRNA in human pulp tissue
Wang Zhongdong,Wen Lingying,Jin Yan,et al.
(Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
〔Abstract〕Objective:To study the expression of BMP3 mRNA in human normal,carious and inflammatory pulp tissues.Methods:In situ hybridization was used with a digoxigenin-labelled BMP3 cDNA probe.Results:Weak BMP3 mRNA positive signal was observed in the odontoblasts of normal pulps;while stronger signal in the odontoblasts under the reparative dentin layer in the pulps of deep caries and circumscribed inflammatory tissue;BMP3 expression was also observed in mensenchymal cells.Conclusion:The difference of of BMP3 mRNA expression suggests that BMP3 may take part in the process of pulp repair and might be related to the differentiation and biological state of the cells.
Key words Dental Pulp;Bone morphogenetic protein-3;Hybridization in situ
骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)是与骨及牙齿硬组织形成关系至为密切的细胞因子。既往，有学者采用免疫组织化学、核酸分子原位杂交技术，分别研究了BMP〔1〕和BMP-2A基因〔2〕在牙胚中的分布与表达，认为它们在牙胚的发育过程中有重要意义。BMP-3即成骨素(Osteogenin)，归属于TGF-β超家族，它在机体内广泛分布于神经外胚层来源的组织及细胞，不仅具有成骨作用，而且参与胚胎分化过程上皮-间充质间的相互作用。 本文作者曾实验发现〔3〕，人牙髓血管内皮细胞能合成分泌BMP-3。本文利用地高辛甙元标记的BMP-3 cDNA探针，进一步观察了人牙髓组织在正常、龋病及炎症状态下BMP3基因的表达，以探讨BMP3基因的表达与牙髓自身修复过程的可能关系。
1 材料和方法
1.1 实验标本的选择与分组
选取本院门诊患者(20～35周岁)因治疗需要而拔除的健康第三磨牙10颗作为正常组。另取患不同程度龋病及临床诊断为牙髓炎症的第三磨牙，以龋损程度的浅、深和(或)并发牙髓炎等共分为3组，每组8～14颗牙。牙拔除后立即置入40 g/L多聚甲醛缓冲液中固定24 h(4 ℃)，Krinsten's溶液中脱钙2～3周(4 ℃)，常规石蜡包埋切片。
1.2 BMP-3 cDNA探针标记
pSP64BMP 3质粒由美国基因研究所Dr.Wozney惠赠。将含有pSP64BMP 3质粒的宿主菌经酶-氯仿抽提、EPLC-Q柱层析、乙醇沉淀获得纯化的DNA质粒，然后经EcoRI及Xba酶切鉴定。标记方法参照地高辛试剂盒(德国 Boehringe Mannheim Bio-chemica公司)说明书介绍之方法进行，用随机引物法将地高辛标记的dUTP参入到BMP3基因探针上。标记时，每μg BMP-3探针分别加入3 μl核苷酸六聚体(hexanucleotide)混合液、3 μl UTP标记混合液和1 μl Klenow酶，充分混合，37 ℃反应20 h，最后用乙醇沉淀收集，备用。
1.3 原位杂交实验
参考地高辛试剂盒使用手册进行。石蜡切片常规脱蜡至水，0.2 mol/L HCI处理和蛋白酶K消化后，2 g/l甘氨酸-PBS洗，40 g/L多聚甲醛-PBS后固定，系列乙醇脱水。加预杂交液处理(42 ℃，2 h)，加杂交液(300 ng变性探针/ml)于90 ℃蒸气浴10 min，冰上速冷，然后置于42 ℃湿盒中过夜。450 g/L甲酰胺-6×SSC漂洗后，依次经2×SSC、1×SSC、0.5×SSC溶液充分洗涤，20 g/L正常羊血清封闭，加入抗地高辛抗体(工作浓度为1：500)2 h,最后用碱性磷酸酶显色。
本组除设不加探针的空白对照和加入 PBR322探针的替代对照外，另设2个对照组，在蛋白酶K消化后，分别用DNase和RNase处理。实验以骨肉瘤标本和血管瘤标本分别作为阳性和阴性对照。每例标本均同时做HE染色。
2 结 果
用地高辛甙元标记的BMP-3 cDNA探针对人牙髓组织进行原位分子杂交，研究BMP-3基因在人牙髓组织中的表达，杂交阳性物质为蓝紫色细颗粒状。
2.1 在健康牙髓组织中，毛细血管和小动脉的血管内皮细胞有BMP-3 mRNA阳性杂交信号出现。蓝紫色细颗粒在胞浆及胞核中弥散分布，在冠髓与根髓的血管内皮细胞分布无明显差异。成牙本质细胞层之细胞有弱阳性杂交信号出现。在冠髓的多细胞层以及牙髓中央区可见到个别牙髓细胞有阳性杂交信号出现(图1)。
图1 人正常牙髓组织成牙本质细胞有BMP-3 mRNA弱阳性杂交信号(10×20)
2.2 在龋病和(或)并发炎症的牙髓组织中，其血管内皮细胞中有BMP-3 mRNA阳性杂交信号出现，并有不同程度的增强。在有修复性牙本质形成的深龋牙髓组织和有脓肿形成的炎症牙髓组织中，还可同时见到在血管周边未分化间充质细胞和其周围的梭形牙髓细胞胞浆与胞核中弥散分布着丰富的蓝紫色阳性杂交颗粒。(图2)在浅龋和有弥漫炎细胞浸润的炎性牙髓组织中，其成牙本质细胞层细胞有弱阳性杂交信号出现，下层细胞有弱阳性杂交信号出现，与正常牙髓组织比较无明显差异。在有修复性牙本质形成的深龋牙髓组织中，在修复性牙本质下方的成牙本质细胞有丰富的阳性信号出现，于胞浆及胞核中弥漫分布有致密的蓝紫色细颗粒；而在其它部位的成牙本质细胞，其阳性信号主要分布于胞核。在有脓肿形成的炎症牙髓组织中，残留的成牙本质细胞中有强阳性杂交信号分布。(图3，4)对于所研究的标本，其充血血管中的血细胞，弥漫浸润于牙髓组织中的炎细胞以及脓肿壁的纤维组织细胞均为阴性染色。
图2 人龋病牙髓组织，血管内皮细胞BMP-3 mRNA阳性杂交信号增强，→示有阳性杂交信号的未分化间充质细胞(10×40)
图3 人龋病牙髓组织，修复性牙本质下的成牙本质
细胞BMP-3 mRNA阳性杂交信号增强(10×20)
图4 人炎症牙髓组织成牙本质细胞有BMP-3 mRNA弱阳性杂交信号，少数牙髓细胞有BMP-3 mRNA阳性杂交信号(10×20)
2.3 对照组 阳性对照切片显示，在骨肉瘤肿瘤细胞的胞核与胞浆中含有丰富的阳性颗粒；而在阴性对照的血管瘤内皮细胞中未发现有阳性杂交信号出现。经DNase消化过的切片上，有阳性杂交信号分布的细胞，其胞核与胞浆中均有阳性杂交颗粒；经RNase消化过的切片上，该类细胞只在胞核上有弱阳性信号出现。空白对照及替代对照切片经72 h显色，无任何着色现象。
3 讨 论
牙髓组织在损伤、感染于一定程度范围内，具有自身修复的潜能。这也是临床工作中牙髓活髓保存治疗的理论基础。目前发现，这种潜能与牙髓自身的功能状态，细胞外基质成分(ECM)、碱性磷酸酶(ALP)、细胞因子，自由基等因素相关〔3〕。其中，BMP在牙髓自身修复中的作用，尤为引人注目。
BMP最初是从骨组织中提取的一类骨诱导因子，现在发现，它在机体的多种内脏器官、组织中分布，牙齿是人体内BMP分布最高的器官。从人及动物的牙本质中所提取的DBMP与骨BMP生物活性相同〔4〕。BMP-3亦称为成骨素，归属于TGF-β超家族的成员,与载体复合后，可诱导激活成骨细胞表型的表达，其骨诱导活性较Urist的BMP大1000倍〔5〕。我们用地高辛甙元标记的cDNA探针，研究了不同状态下牙髓组织中BMP-3 mRNA的分布特征，实验结果显示：在正常健康的牙髓组织中，血管内皮细胞，成牙本质细胞即有合成BMP-3的能力，但这种能力是潜在的。当在龋源性炎症刺激于一定程度范围内，如浅龋、深龋和(或)限局性炎症的牙髓组织BMP-3合成的量增加，由此推测：在龋源性炎症刺激下，BMP-3基因激活并表达，对于牙髓细胞的诱导分化可能有发挥重要作用。提示：BMP-3可能参与了牙髓组织的自身修复过程。
根据对BMP高效骨诱导活性的系列研究结果，一些学者把它与牙齿—这一机体内与骨组织在组织形态及胚胎发生过程最为近似的器官联系起来。特别是Butter等〔4〕从人及动物的牙本质基质中纯化了具有与骨BMP类似活性的牙本质BMP(DBMP)。这意味着BMP可能参与了牙本质的形成过程。现有的研究结果证实〔1，6〕，在牙胚发育过程中，伴随着BMP基因的激活与表达。认为成熟的功能性成牙本质细胞具有合成和分泌BMP的功能，它在牙胚发育过程中可能具有自分泌和旁分泌作用，从而参与牙本质的形态发生。Tabas的实验〔7〕，亦提示BMP-3基因的表达在牙本质形态发生和发育过程中可能发挥作用。我们既往的实验结果表明：健康的牙髓组织，BMP-3 mRNA在绝大多数成牙本质层细胞有弱表达，仅有个别成牙本质细胞和牙髓中央区牙髓细胞有BMP-3 mRNA阳性杂交信号出现；在浅龋牙髓组织中，其表达无明显变化；而在深龋和/或局限性炎症牙髓组织中，其成牙本质细胞，特别是修复性牙本质下方的成牙本质层细胞BMP-3 mRNA 表达增强；而在有弥漫性炎症的牙髓组织中，其成牙本质细胞大部分坏死脱失、残存者BMP-3 mRNA表达亦无明显变化。说明：健康牙髓的成牙本质细胞即有合成BMP-3的能力，但这种能力是潜在的。当在慢性炎症刺激下，于一定程度范围内，该潜力得以发挥，成牙本质层细胞，特别是修复性牙本质下方的成牙本质细胞，其BMP-3合成异常活跃。以往所进行的体外牙髓细胞培养和体内盖髓术〔8〕的研究结果证实：BMP可以促进牙髓细胞的增殖，诱导牙髓细胞由低分化状态向高分化状态的分化。我们的实验亦发现在血管周边及周围出现BMP-3 mRNA阳性杂交信号的未分化间充质样细胞和牙髓细胞。由此，我们推测：成熟的功能性成牙本质细胞在一定程度的龋源性炎症刺激下，其BMP3基因激活并表达，参与牙髓细胞的诱导分化过程，对牙髓组织的自身修复过程可能具有重要意义，同时亦提示BMP-3基因表达的强弱与细胞的分化程度及所处的功能状态相关。
以往，关于BMP与牙本质形成之间关系的研究，多限于牙胚的发育过程、体外牙髓细胞的培养，体内盖髓术后的组织学观察等〔1，6，7，8〕。关于其作用机制，目前研究尚少。我们的实验结果提示BMP-3在已萌出牙齿牙髓的自身修复过程中可能具有重要意义。Vukicevic等〔9〕实验发现：BMP-3 mRNA主要分布于神经外胚层来源的组织及细胞，而其成熟蛋白(成骨素)结合位点富含于中胚层来源的组织。他在另一份实验报告〔5〕中发现：在人胚肺、肾的上皮细胞，BMP-3 mRNA的表达水平较骨组织中还要高，认为BMP-3在表皮一间充质交互作用中可能具有重要意义，并由此参与人胚肺、肾的形态发生和/或功能调节。我们的实验发现：在一定程度的龋源性炎症刺激下，成牙本质细胞和血管内皮细胞BMP-3 mRNA表达增强，并发现血管内皮细胞和其周围的牙髓细胞均有BMP-3 mRNA表达。既往，对牙胚发育过程的研究发现〔6〕：牙齿发育中生长中心的成釉细胞早于成牙本质细胞出现，并且成釉细胞中的BMP含量总是较成牙本质细胞丰富，而且在其相对部位的成牙本质细胞出现前胞浆中就有BMP的存在，认为成釉细胞通过合成和分泌BMP，诱导成牙本质细胞的分化，进而形成牙本质。由此，我们推测：正常的牙髓组织，其成牙本质细胞和血管内皮细胞具有合成BMP-3的潜力。在某种特定条件下BMP-3基因被激活、表达，可能起到类似于牙胚发育早期成釉细胞的作用，通过内分泌和旁分泌作用参与成熟的功能性成牙本质细胞的诱导和分化，进一步形成修复性牙本质。
目前，可以较为肯定的是，BMP3作用的靶细胞是牙髓组织的未分化间充质细胞,Paralkar等〔10〕实验发现这些细胞表面有特异的高亲和性BMP受体存在。由此，我们推测：BMP3可与这种受体结合，通过第二信使,在分子水平上调控牙髓细胞的诱导和分化过程。
参考文献
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3，王忠东，文玲英，金岩，等。人牙髓血管内皮细胞骨形成蛋白-3基因表达的研究。牙体牙髓牙周病学杂志，1997，7(4)：231
4，Wozney JM,Rosen V,Celeste AJ,et al.Novel regulators of bone formation:Molecular clones and activities.Science,1988，242:1528
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10，Paralkar VM,Hammonds RG，Reddi AH.Identification and characterization of cellular binding proteins(receptors)for recombinant human bone morphogenetic protein 2B,an initiator of bone differentiation cascade.Proc Natl Acad Ssi USA,1991，88:3397
收稿：2000-05-25