全反式维甲酸对舌癌细胞株抗增殖作用的研究
作者：王安训 曾融生 丁学强 李苏 黄洪章
单位：王安训 丁学强(广州中山医科大学 第一医院口腔科 510080)；曾融生 黄洪章(口腔医院口腔颌面外科)；李苏(肿瘤防治中心)
关键词：舌；癌；细胞株；维甲酸
实用口腔医学杂志000513
〔摘要〕 目的：研究全反式维甲酸(ATRA)对舌癌细胞株的体外抗增殖作用。方法：经不同浓度全反式维甲酸(10-7～10-5mol/L)处理舌癌细胞株后，应用流式细胞仪检测舌癌细胞细胞周期变化。结果：舌癌细胞株经10-7～10-5mol/L全反式维甲酸处理1～6 d后，G1/Go期比率呈上升趋势，S期和G2+M期比率呈下降趋势，与对照组相比，经全反式维甲酸处理3 d和6 d的细胞，其G1/Go期比率明显上升(P<0.01)，G2+M期比率和S期比率明显下降(P<0.01)。结论：ATRA可抑制舌癌细胞的DNA合成，改变舌癌细胞增殖动力学，抑制细胞增殖。
, 百拇医药
中图分类号：R739.8 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0372-03
Anti-proliferative activity of all-trans retinoic acid against human tongue carcinoma cell line
Wang Anxun Zeng Rongsheng Ding Xueqiang
(Department of Stomatology,First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
〔Abstract〕Objective:To study the anti-proliferative activity of all-trans retinoic acid(ATRA) against human tongue carcinoma cell in vitro.Methods:Human tongue carcinoma cells were treated by various concentrations of ATRA(10-7～10-5mol/L).Flow cytometry was used to analyse the cell cycle distribution.Results:At day 3 and 6 after treatment with ATRA,the proportion of cells in S phase and G2+M phase decreased(P<0.01),that in G1/G0 phase increased (P<0.01).Conclusion:Proliferation of human tongue carcinoma cell can be inhibited by ATRA at 10-7～10-5mol/L.
, 百拇医药
Key words Tongue; Carcinoma;Cell line; Tretinoin
研究已证实，维甲类化合物对多种恶性肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导分化作用，其中全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是迄今研究最为深入、作用最强的分化诱导剂之一。它在治疗人急性早幼粒细胞白血病方面取得了惊人的治疗效果，临床缓解率高达85%～90%〔1〕。在诱导分化其它恶性肿瘤方面的研究也取得良好效果，但在口腔鳞癌方面的研究仍较少。本实验应用不同浓度全反式维甲酸处理舌癌细胞株，从细胞增殖动力学方面观察ATRA对舌癌细胞周期的影响。
1 材料和方法
1.1 细胞株和药物
人舌癌细胞株Tca8113由上海第二医科大学何荣根教授提供，细胞株复苏后在含体积分数(φ)为15%灭活小牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的PRMI 1640培养液，37 ℃恒温密闭式培养。全反式维甲酸购自Sigma公司，使用前无水乙醇配制成1×10-2 mol/L，再用培养液配制成所需的终浓度，其中无水乙醇的终浓度≤1‰，所有操作均需避光。
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1.2 流式细胞仪(FCM)检测
取对数生长期细胞，经胰酶消化离心后配制成细胞终浓度108个/L，其中实验组加入全反式维甲酸(共3组，终浓度分别为10-5、10-6、10-7 mol/L)；对照组未加入ATRA，但含≤1‰无水乙醇，用药后第1～6 天逐日取实验组和对照组细胞，经胰酶消化离心，制成5×109/L的细胞悬液，用φ为70%冷酒精固定过夜(4 ℃)，以鸡红细胞作为内插标记，经碘化丙啶(PⅠ)对样本DNA荧光染色，应用Counter公司的FCM测定，从打印的DNA含量分布直方图分析得到细胞周期各时相细胞的百分比。
图1 舌癌细胞经ATRA处理后细胞周期的改变
2 结 果
, 百拇医药
舌癌细胞株经10-7～10-5 mol/L 的ATRA作用后，细胞周期中G1/G0期比率呈上升趋势，S期和G2+M期比率呈下降趋势，并且随着作用时间的延长或ATRA浓度的增加，这种倾向越明显(如图1)。
对经全反式维甲酸处理3 d和6 d的实验组和对照组细胞周期的改变进行统计学分析(采用单因素方差分析)，结果可见经10-7～10-5 mol/L的ATRA处理舌癌细胞3 d和6 d后，细胞周期中G1/G0期比率明显上升(P<0.01)；G2+M期比率明显下降(P<0.01)；10-5 mol/L和10-6 mol/L组S期比率明显下降(P<0.01)。见表1和表2。
表1 经ATRA处理3 d后Tca8113细胞周期的改变(FCM%,
±s) 分组
, 百拇医药
n
G1/G0
G2+M
S
对照组
3
50.47±0.55
11.73±0.45
37.70±0.56
10-7mol/L组
3
55.03±0.35①
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9.73±0.47①
35.10±0.60
10-6 mol/L组
3
56.63±0.50①
9.00±0.60①
34.37±0.40①
10-5 mol/L组
3
58.63±0.40
, 百拇医药
8.77±0.45①
32.53±0.45①
①与对照组比较，P<0.01,下表同表2 经ATRA处理6 d后Tca8113细胞周期改变(FCM%,±s) 分组
n
G1/G0
G2+M
S
对照组
3
, 百拇医药
55.57±0.45
8.13±0.35
36.33±0.45
10-7 mol/L组
3
63.67±0.55①
6.17±0.45①
30.16±0.50
10-6 mol/L组
3
70.17±0.35①
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5.80±0.47①
23.80±0.56①
10-5mol/L组
3
72.70±0.40①
6.10±0.40①
21.30±0.56①
3 讨 论
细胞增殖周期分为有丝分裂(M期)和间期，间期又分为G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2期(DNA合成后期)，细胞经有丝分裂后可继续进行分裂，也可处于静止状态，即G0期。肿瘤细胞的细胞周期动力学特点为细胞群体主体分布于DNA合成活跃的S期，而分化细胞群体主体则分布于DNA合成静止的G1/G0期。对肿瘤细胞周期动力学的研究有助于明确抗癌药物的作用机制。诱导分化治疗是肿瘤化学治疗的一个新领域。它应用化学药物诱导肿瘤细胞分化并逆转其增殖、浸润、转移等恶性表型，使其成为正常或接近正常细胞，从而达到治疗目的[1]。维甲类化合物对肿瘤细胞具有较好的诱导分化和增殖抑制作用，其主要通过诱导核维甲酸受体的表达而起作用，同时可抑制异常角化，调节癌基因和抑癌基因的表达，它对多种恶性肿瘤均有较好的诱导分化作用[2,3]。
, 百拇医药
许多研究均发现，全反式维甲酸在诱导分化恶性肿瘤时可改变细胞的增殖周期动力学[4,5]，常表现为G1/G0期比率上升，G2+M期和S期比率下降。本研究也发现舌癌细胞经10-7～10-5 mol/L ATRA作用1～6 d后，舌癌细胞中G1/G0期细胞比率比对照组显著升高(P<0.01)，而增殖期中G2+M期细胞比率比对照组明显下降(P<0.01)，当ATRA的浓度大于10-6mol/L时S期细胞比率明显下降(P<0.01)。该结果表明，ATRA使舌癌细胞停滞于G1/G0期，而G2+M期和S细胞的比率下降，抑制了细胞的DNA合成，使舌癌细胞的增殖受到抑制，生长出现停滞。ATRA诱导下的舌癌细胞出现分化细胞特有的周期特征：即呈现出G1期延滞和G1-S期转换的抑制，这是处于分化过程中的细胞所具有的共同特征。作者的研究还发现：人舌癌细胞经ATRA体外处理后细胞生长速度减慢，群体倍增时间延长，细胞形态趋向良性分化，3H-TdR掺入率减低，抑制率为22.7%～61.5%。由此可见，ATRA除了对舌癌细胞株具有体外抗增殖作用外，还具有诱导分化作用。
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参考文献
1，Parkinson DR, Smith MA, Cheson BD, et al. Trans-retinoic acid and related differentiation agents. Semin Oncol,1992,19(6):734
2，Lutan R. Suppression of squamous cell carcinoma growth and differentiation by retinoids. Cancer Res,1994,54(1):1987
3，Mikael B, Philip F, Beverly A, et al. Retinoic acid regulates oral epithelial differentiation by two mechanisms. J Invest Dermatol,1995,104(4):546
4，陈万涛，林国础，何荣根，等.全反式维甲酸对涎腺腺样囊性癌细胞株Acc-M体外抗增殖作用的研究.口腔颌面外科杂志，1998,8(1)：12
5，黎伯铨，张雪艳，蔡岩，等.维甲酸对人肺腺癌细胞系分化作用的实验研究.中华医学杂志,1995,75(11)：638
(收稿：1999-08-10), 百拇医药
单位：王安训 丁学强(广州中山医科大学 第一医院口腔科 510080)；曾融生 黄洪章(口腔医院口腔颌面外科)；李苏(肿瘤防治中心)
关键词：舌；癌；细胞株；维甲酸
实用口腔医学杂志000513
〔摘要〕 目的：研究全反式维甲酸(ATRA)对舌癌细胞株的体外抗增殖作用。方法：经不同浓度全反式维甲酸(10-7～10-5mol/L)处理舌癌细胞株后，应用流式细胞仪检测舌癌细胞细胞周期变化。结果：舌癌细胞株经10-7～10-5mol/L全反式维甲酸处理1～6 d后，G1/Go期比率呈上升趋势，S期和G2+M期比率呈下降趋势，与对照组相比，经全反式维甲酸处理3 d和6 d的细胞，其G1/Go期比率明显上升(P<0.01)，G2+M期比率和S期比率明显下降(P<0.01)。结论：ATRA可抑制舌癌细胞的DNA合成，改变舌癌细胞增殖动力学，抑制细胞增殖。
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中图分类号：R739.8 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0372-03
Anti-proliferative activity of all-trans retinoic acid against human tongue carcinoma cell line
Wang Anxun Zeng Rongsheng Ding Xueqiang
(Department of Stomatology,First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
〔Abstract〕Objective:To study the anti-proliferative activity of all-trans retinoic acid(ATRA) against human tongue carcinoma cell in vitro.Methods:Human tongue carcinoma cells were treated by various concentrations of ATRA(10-7～10-5mol/L).Flow cytometry was used to analyse the cell cycle distribution.Results:At day 3 and 6 after treatment with ATRA,the proportion of cells in S phase and G2+M phase decreased(P<0.01),that in G1/G0 phase increased (P<0.01).Conclusion:Proliferation of human tongue carcinoma cell can be inhibited by ATRA at 10-7～10-5mol/L.
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Key words Tongue; Carcinoma;Cell line; Tretinoin
研究已证实，维甲类化合物对多种恶性肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导分化作用，其中全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是迄今研究最为深入、作用最强的分化诱导剂之一。它在治疗人急性早幼粒细胞白血病方面取得了惊人的治疗效果，临床缓解率高达85%～90%〔1〕。在诱导分化其它恶性肿瘤方面的研究也取得良好效果，但在口腔鳞癌方面的研究仍较少。本实验应用不同浓度全反式维甲酸处理舌癌细胞株，从细胞增殖动力学方面观察ATRA对舌癌细胞周期的影响。
1 材料和方法
1.1 细胞株和药物
人舌癌细胞株Tca8113由上海第二医科大学何荣根教授提供，细胞株复苏后在含体积分数(φ)为15%灭活小牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的PRMI 1640培养液，37 ℃恒温密闭式培养。全反式维甲酸购自Sigma公司，使用前无水乙醇配制成1×10-2 mol/L，再用培养液配制成所需的终浓度，其中无水乙醇的终浓度≤1‰，所有操作均需避光。
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1.2 流式细胞仪(FCM)检测
取对数生长期细胞，经胰酶消化离心后配制成细胞终浓度108个/L，其中实验组加入全反式维甲酸(共3组，终浓度分别为10-5、10-6、10-7 mol/L)；对照组未加入ATRA，但含≤1‰无水乙醇，用药后第1～6 天逐日取实验组和对照组细胞，经胰酶消化离心，制成5×109/L的细胞悬液，用φ为70%冷酒精固定过夜(4 ℃)，以鸡红细胞作为内插标记，经碘化丙啶(PⅠ)对样本DNA荧光染色，应用Counter公司的FCM测定，从打印的DNA含量分布直方图分析得到细胞周期各时相细胞的百分比。
图1 舌癌细胞经ATRA处理后细胞周期的改变
2 结 果
, 百拇医药
舌癌细胞株经10-7～10-5 mol/L 的ATRA作用后，细胞周期中G1/G0期比率呈上升趋势，S期和G2+M期比率呈下降趋势，并且随着作用时间的延长或ATRA浓度的增加，这种倾向越明显(如图1)。
对经全反式维甲酸处理3 d和6 d的实验组和对照组细胞周期的改变进行统计学分析(采用单因素方差分析)，结果可见经10-7～10-5 mol/L的ATRA处理舌癌细胞3 d和6 d后，细胞周期中G1/G0期比率明显上升(P<0.01)；G2+M期比率明显下降(P<0.01)；10-5 mol/L和10-6 mol/L组S期比率明显下降(P<0.01)。见表1和表2。
表1 经ATRA处理3 d后Tca8113细胞周期的改变(FCM%,
±s) 分组, 百拇医药
n
G1/G0
G2+M
S
对照组
3
50.47±0.55
11.73±0.45
37.70±0.56
10-7mol/L组
3
55.03±0.35①
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9.73±0.47①
35.10±0.60
10-6 mol/L组
3
56.63±0.50①
9.00±0.60①
34.37±0.40①
10-5 mol/L组
3
58.63±0.40
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8.77±0.45①
32.53±0.45①
①与对照组比较，P<0.01,下表同表2 经ATRA处理6 d后Tca8113细胞周期改变(FCM%,
±s) 分组n
G1/G0
G2+M
S
对照组
3
, 百拇医药
55.57±0.45
8.13±0.35
36.33±0.45
10-7 mol/L组
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63.67±0.55①
6.17±0.45①
30.16±0.50
10-6 mol/L组
3
70.17±0.35①
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5.80±0.47①
23.80±0.56①
10-5mol/L组
3
72.70±0.40①
6.10±0.40①
21.30±0.56①
3 讨 论
细胞增殖周期分为有丝分裂(M期)和间期，间期又分为G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2期(DNA合成后期)，细胞经有丝分裂后可继续进行分裂，也可处于静止状态，即G0期。肿瘤细胞的细胞周期动力学特点为细胞群体主体分布于DNA合成活跃的S期，而分化细胞群体主体则分布于DNA合成静止的G1/G0期。对肿瘤细胞周期动力学的研究有助于明确抗癌药物的作用机制。诱导分化治疗是肿瘤化学治疗的一个新领域。它应用化学药物诱导肿瘤细胞分化并逆转其增殖、浸润、转移等恶性表型，使其成为正常或接近正常细胞，从而达到治疗目的[1]。维甲类化合物对肿瘤细胞具有较好的诱导分化和增殖抑制作用，其主要通过诱导核维甲酸受体的表达而起作用，同时可抑制异常角化，调节癌基因和抑癌基因的表达，它对多种恶性肿瘤均有较好的诱导分化作用[2,3]。
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许多研究均发现，全反式维甲酸在诱导分化恶性肿瘤时可改变细胞的增殖周期动力学[4,5]，常表现为G1/G0期比率上升，G2+M期和S期比率下降。本研究也发现舌癌细胞经10-7～10-5 mol/L ATRA作用1～6 d后，舌癌细胞中G1/G0期细胞比率比对照组显著升高(P<0.01)，而增殖期中G2+M期细胞比率比对照组明显下降(P<0.01)，当ATRA的浓度大于10-6mol/L时S期细胞比率明显下降(P<0.01)。该结果表明，ATRA使舌癌细胞停滞于G1/G0期，而G2+M期和S细胞的比率下降，抑制了细胞的DNA合成，使舌癌细胞的增殖受到抑制，生长出现停滞。ATRA诱导下的舌癌细胞出现分化细胞特有的周期特征：即呈现出G1期延滞和G1-S期转换的抑制，这是处于分化过程中的细胞所具有的共同特征。作者的研究还发现：人舌癌细胞经ATRA体外处理后细胞生长速度减慢，群体倍增时间延长，细胞形态趋向良性分化，3H-TdR掺入率减低，抑制率为22.7%～61.5%。由此可见，ATRA除了对舌癌细胞株具有体外抗增殖作用外，还具有诱导分化作用。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Parkinson DR, Smith MA, Cheson BD, et al. Trans-retinoic acid and related differentiation agents. Semin Oncol,1992,19(6):734
2，Lutan R. Suppression of squamous cell carcinoma growth and differentiation by retinoids. Cancer Res,1994,54(1):1987
3，Mikael B, Philip F, Beverly A, et al. Retinoic acid regulates oral epithelial differentiation by two mechanisms. J Invest Dermatol,1995,104(4):546
4，陈万涛，林国础，何荣根，等.全反式维甲酸对涎腺腺样囊性癌细胞株Acc-M体外抗增殖作用的研究.口腔颌面外科杂志，1998,8(1)：12
5，黎伯铨，张雪艳，蔡岩，等.维甲酸对人肺腺癌细胞系分化作用的实验研究.中华医学杂志,1995,75(11)：638
(收稿：1999-08-10), 百拇医药