环孢霉素A治疗哮喘的实验研究
作者：姚德胜 李伯埙 徐启勇
单位：(解放军第371医院呼吸内科，河南新乡 453000)
关键词：环孢霉素A；哮喘；支气管肺泡灌洗；T淋巴细胞增殖反应
中国新药杂志990410 摘要 目的：探讨环孢霉素A对哮喘的治疗作用及机制。方法：21只豚鼠随机分为正常组、模型组及环孢霉素A组。用卵白蛋白制作豚鼠哮喘模型。用环孢霉素A 25 mg/(kg。d)连续腹腔注射3d，检测外周血T淋巴细胞增殖反应，右侧肺脏做支气管肺泡灌洗液中细胞成分分析，左侧肺脏做组织学检查。结果：环孢霉素A组T细胞增殖刺激指数显著低于模型组(P<0.01)；支气管肺泡灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞计数也显著低于模型组(P<0.01)；气道壁炎症反应减轻；且刺激指数与支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞计数之间呈显著正相关。结论：环孢霉素A通过抑制T细胞活化增殖抑制气道炎症，对豚鼠哮喘有效。
, http://www.100md.com
EXPERIMENTAL STUDY OF THE THERAPEUTIC EFFECT OF CYCLOSPORIN A ON ASTHMA
Yao Desheng,Li Boxun,Xu Qiyong
(Department of Respiratory,The PLA 371th Hospital,Xin Xiang 453000)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the therapeutic effect of cyclosporin A on asthma in guinea pigs.METHODS:The model of asthma was established.The T lymphocyte proliferative response was measured,inflammatory response in the airway was assessed by both examination of the cells of bronchoalveolar lavage fluid and the lung histology.RESULTS:The total cell number,the eosinophil number in bronchoalveolar lavage fluid of cyclosporin A-treated group were significantly lower than those of the model group.The stimulation index of T lymphocyte proliferative respose of cyclosporin A-treated group was also significantly lower than that of the model group.The eosinophil infiltration within airway walls was markedly inhibited compared with the model group.The stimulation index was positively correlated with the number of eosinophil in bronchoalveolar lavage fluid.CONCLUSION:Cyclosporin A can inhibit the eosinophil infiltration within airway walls by suppressing T-cell proliferation and activation;cyclosporin A have potential therapeutic effect for asthma.
, 百拇医药
KEY WORDS Cyclosporin A;Asthma;Bronchoalveolar lavage;T-lymphocyte proliferative response
哮喘是一种慢性气道炎症性疾病。多种炎症细胞及其释放的细胞因子参与气道炎症的形成及哮喘的病理生理过程，其中T淋巴细胞及嗜酸性粒细胞之间的相互作用尤其重要[1]。环孢霉素A是一种抗炎免疫抑制药物，抑制一些细胞因子的转录和T细胞活化。本实验探讨环孢霉素A对豚鼠哮喘的疗效及机制。
材料与方法
1 仪器与试剂
CO2培养箱(GCA型，美国Precission公司)，微量多头细胞收集器(QYQ-Ⅲ型，上海医科大学监制)，液闪测定仪(2000CA、Tricarb型，美国Packard公司)，卵白蛋白(德国E。Mark公司)，环孢霉素A(瑞士Sandoz药厂)，PRMI-1640细胞培养液(美国Gibco公司)。
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2 方法
将健康雄性Hartley豚鼠21只(体重300～450g)
随机分为3组：模型组(n＝7)，哮喘模型建立参照Gulbenkian方法[2]，致敏豚鼠，3周后用0.25%卵白蛋白溶液雾化吸入激发哮喘发作；环孢霉素A组(n＝7)，模型建立同模型组，在卵白蛋白激发前2d予环孢霉素A 25 mg/(kg。d)，ip，激发后1 h重复注射1次；正常组(n＝7)，致敏及激发均以生理盐水代替。3组动物均在激发后24 h用戊巴比妥钠麻醉，气管切开插入套管。自中线打开胸腔，由心脏无菌采血5 ml做T淋巴细胞增殖实验。每只动物右侧肺脏做支气管肺泡灌洗，左侧肺脏做组织学检查。
3 检测项目
3.1 激发后速发型哮喘反应观察 在抗原激发后1 h内观察动物哮喘反应及一般情况。
, 百拇医药
3.2 T淋巴细胞增殖实验 用比重为1.090的淋巴细胞分层液常规分离外周血淋巴细胞。用RPMI-1640细胞培养液配制细胞悬液，使其终浓度为1×106个/ml。将细胞悬液加入96孔培养板100 μl/孔，每份细胞悬液分装6个孔，其中3孔为实验孔，每孔加终浓度为50 μg/ml的PHA(植物血凝素)，另外3孔为对照孔不加PHA，总体积用细胞培养液补至200 μl/孔。置37℃、5% CO2培养箱培养72 h，培养结束前18 h每孔加 3 H-TdR 1 uci，用多头细胞收集器收集细胞，用液闪测定仪测定每孔相对放射性(以CPM表示)。结果以刺激指数表示：刺激指数＝实验孔平均CPM值/对照孔CPM值。
3.3 支气管肺泡灌洗液中细胞成分分析 心脏放血处死动物后，结扎左侧支气管，通过气管套管用生理盐水灌洗右侧肺脏1.5 ml/次，共3次。回收支气管肺泡灌洗液，用血细胞计数板进行细胞总数计数。细胞离心涂片，Wright+Giemsa染色，进行细胞分类。
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3.4 组织学检查 用10%福尔马林1.5 ml经左侧支气管灌注固定肺组织，摘除左肺，石蜡包埋切片，HE染色，观察气道病理改变。
4 统计学处理
所有数据均以x±s表示，统计应用计量资料t检验和直线相关分析。总体比较采用方差分析。
结 果
1 激发后速发哮喘反应观察
模型组豚鼠在卵白蛋白吸入激发后呼吸明显加深加快，并出现烦燥不安，咳嗽，明显呼气性呼吸困难，甚至跌倒。以吸入后5～10 min最明显。环孢霉素A治疗组在卵白蛋白吸入激发后与模型组比较呼吸困难减轻，但仍有不同程度哮喘症状。
2 T淋巴细胞增殖实验
, http://www.100md.com 正常组、模型组、环孢霉素A组的刺激指数分别为4.09±0.97，8.58±1.5，5.08±1.09。模型组与正常组比较，有极显著差异(P<0.01)。环孢霉素A组与模型组比较，有极显著差异(P<0.01)。
3 支气管肺泡灌洗液中细胞成分分析
见表1。
表1 支气管肺泡灌洗液中细胞成分分析(x±s，n=7)
灌洗液回
收总量(ml)
细胞计数(×106/ml)
Total
AM
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N
L
EOS
正常组
3.39±0.35
3.93±0.67
3.44±0.54
0.15±0.06
0.19±0.14
0.16±0.07
模型组
3.41±0.31
, 百拇医药
8.79±1.5a
5.64±0.72a
0.34±0.18
0.30±0.13
2.45±0.61a
环孢霉素A组
3.44±0.24
5.36±1.68b
4.32±1.51
0.15±0.1
0.14±0.11
, http://www.100md.com
0.75±0.32ab
Total 细胞总数，AM 单核巨噬细胞，N 中性粒细胞，L 淋巴细胞，EOS 嗜酸性粒细胞，a:与正常组比较P<0.01，b:与模型组比较P<0.01
4 组织学检查
光镜下观察模型组支气管、细支气管上皮细胞脱落、管腔可见粘栓间以嗜酸性粒细胞浸润。粘膜及粘膜下层、平滑肌外均可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润。环孢霉素A组偶见上皮细胞脱落，管腔内无粘液栓，管壁仅有少量炎细胞浸润。
5 相关分析
T淋巴细胞增殖刺激指数与灌洗液中嗜酸性粒细胞计数之间作直线相关分析，结果表明相关系数r＝0.7555(t＝3.056，P<0.01)，二者呈显著正相关。直线回归方程为：Y＝-0.9567+0.3518X。
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讨 论
糖皮质激素抵抗型哮喘的治疗是临床上面临的一大难题。初步临床观察表明，小剂量环孢霉素A可以使激素抵抗型哮喘患者肺功能明显改善，激素用量减少[3]，但其确切机制尚不清楚。本实验模型组豚鼠不仅表现典型的速发哮喘反应，而且在卵白蛋白激发后24h表现了迟发哮喘反应的重要病理学特征即气道非特异性炎症。这与Gulbenkian[2]的结果一致。外周血T细胞处于明显活化状态，其增殖刺激指数显著高于正常组。这与Wasterman等[4]的结果一致。
本实验结果表明，环孢霉素A可以抑制哮喘豚鼠T细胞活化，并且因此抑制气道嗜酸性粒细胞炎症。这可能是环孢霉素A治疗迟发哮喘反应有效的机制之一。Arima等[5]报道环孢霉素A可以显著抑制与气道高反应性相关的迟发哮喘反应。有意义的是环孢霉素A可能通过与激素不同的机制抑制T细胞活化及气道炎症，Corrigan等[6]报道环孢霉素A可以抑制激素抵抗型哮喘之T细胞增殖和淋巴因子产生，而激素则不能。故环孢霉素A可能为哮喘尤其是激素抵抗型哮喘及难治哮喘提供新的治疗途径。
, 百拇医药
参考文献
1 Corrigan CJ,Kay AB.T-Cell and eosinophil in the pathogenesis of asthma.Immunol Today,1992,13(2)∶501
2 Gulbenkian AR,Fernander X,Kreutner W,et al.Anaphylactic challenge cause eosinophil accumulation in bronchoalveolar lavage of guinea pigs.Am Rev Respir Dis,1990,142(3)∶680
3 Lock SH,Kay AB,Brarnes NC,et al.Double-blind placebo-controlled study of cyclosporin A as a corticosteroid sparing agent in corticosteroid-dependent asthma.Am J Respir Crit Care Med,1996,153(3)∶509
, 百拇医药
4 Wasterman S,Wu LJ,Ollevenstein R,et al.Association between late allergic bronchoconstriction in the rat and allergen-stimulated lymphocyte proliferation in vitro.Am J Respir Crit Care Med,1995，151(2)∶470
5 Arima M,Yukawa T,Terashi Y,et al.Cyclosporin A inhibit allergen-induced late asthmatic response and increase of airway hyperresponsiveness in guinea pigs.Nippon Kyobu Shikkan Gakkai Zasshi,1991,29(8)∶1089
6 Corrigan CJ,Brown&127;PH,Barnes NC,et al.Glucorticoid resistance in chronic asthma:peripherial blood T lymphocgte activation and comparison of the T lymphocgte inhibitory effects of glucocosteroid and cyclosporin A.Am Rev Respir Dis,1991,144(6)∶1026
(收稿：1998-09-29 修回：1999-03-17), 百拇医药
单位：(解放军第371医院呼吸内科，河南新乡 453000)
关键词：环孢霉素A；哮喘；支气管肺泡灌洗；T淋巴细胞增殖反应
中国新药杂志990410 摘要 目的：探讨环孢霉素A对哮喘的治疗作用及机制。方法：21只豚鼠随机分为正常组、模型组及环孢霉素A组。用卵白蛋白制作豚鼠哮喘模型。用环孢霉素A 25 mg/(kg。d)连续腹腔注射3d，检测外周血T淋巴细胞增殖反应，右侧肺脏做支气管肺泡灌洗液中细胞成分分析，左侧肺脏做组织学检查。结果：环孢霉素A组T细胞增殖刺激指数显著低于模型组(P<0.01)；支气管肺泡灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞计数也显著低于模型组(P<0.01)；气道壁炎症反应减轻；且刺激指数与支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞计数之间呈显著正相关。结论：环孢霉素A通过抑制T细胞活化增殖抑制气道炎症，对豚鼠哮喘有效。
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EXPERIMENTAL STUDY OF THE THERAPEUTIC EFFECT OF CYCLOSPORIN A ON ASTHMA
Yao Desheng,Li Boxun,Xu Qiyong
(Department of Respiratory,The PLA 371th Hospital,Xin Xiang 453000)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the therapeutic effect of cyclosporin A on asthma in guinea pigs.METHODS:The model of asthma was established.The T lymphocyte proliferative response was measured,inflammatory response in the airway was assessed by both examination of the cells of bronchoalveolar lavage fluid and the lung histology.RESULTS:The total cell number,the eosinophil number in bronchoalveolar lavage fluid of cyclosporin A-treated group were significantly lower than those of the model group.The stimulation index of T lymphocyte proliferative respose of cyclosporin A-treated group was also significantly lower than that of the model group.The eosinophil infiltration within airway walls was markedly inhibited compared with the model group.The stimulation index was positively correlated with the number of eosinophil in bronchoalveolar lavage fluid.CONCLUSION:Cyclosporin A can inhibit the eosinophil infiltration within airway walls by suppressing T-cell proliferation and activation;cyclosporin A have potential therapeutic effect for asthma.
, 百拇医药
KEY WORDS Cyclosporin A;Asthma;Bronchoalveolar lavage;T-lymphocyte proliferative response
哮喘是一种慢性气道炎症性疾病。多种炎症细胞及其释放的细胞因子参与气道炎症的形成及哮喘的病理生理过程，其中T淋巴细胞及嗜酸性粒细胞之间的相互作用尤其重要[1]。环孢霉素A是一种抗炎免疫抑制药物，抑制一些细胞因子的转录和T细胞活化。本实验探讨环孢霉素A对豚鼠哮喘的疗效及机制。
材料与方法
1 仪器与试剂
CO2培养箱(GCA型，美国Precission公司)，微量多头细胞收集器(QYQ-Ⅲ型，上海医科大学监制)，液闪测定仪(2000CA、Tricarb型，美国Packard公司)，卵白蛋白(德国E。Mark公司)，环孢霉素A(瑞士Sandoz药厂)，PRMI-1640细胞培养液(美国Gibco公司)。
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2 方法
将健康雄性Hartley豚鼠21只(体重300～450g)
随机分为3组：模型组(n＝7)，哮喘模型建立参照Gulbenkian方法[2]，致敏豚鼠，3周后用0.25%卵白蛋白溶液雾化吸入激发哮喘发作；环孢霉素A组(n＝7)，模型建立同模型组，在卵白蛋白激发前2d予环孢霉素A 25 mg/(kg。d)，ip，激发后1 h重复注射1次；正常组(n＝7)，致敏及激发均以生理盐水代替。3组动物均在激发后24 h用戊巴比妥钠麻醉，气管切开插入套管。自中线打开胸腔，由心脏无菌采血5 ml做T淋巴细胞增殖实验。每只动物右侧肺脏做支气管肺泡灌洗，左侧肺脏做组织学检查。
3 检测项目
3.1 激发后速发型哮喘反应观察 在抗原激发后1 h内观察动物哮喘反应及一般情况。
, 百拇医药
3.2 T淋巴细胞增殖实验 用比重为1.090的淋巴细胞分层液常规分离外周血淋巴细胞。用RPMI-1640细胞培养液配制细胞悬液，使其终浓度为1×106个/ml。将细胞悬液加入96孔培养板100 μl/孔，每份细胞悬液分装6个孔，其中3孔为实验孔，每孔加终浓度为50 μg/ml的PHA(植物血凝素)，另外3孔为对照孔不加PHA，总体积用细胞培养液补至200 μl/孔。置37℃、5% CO2培养箱培养72 h，培养结束前18 h每孔加 3 H-TdR 1 uci，用多头细胞收集器收集细胞，用液闪测定仪测定每孔相对放射性(以CPM表示)。结果以刺激指数表示：刺激指数＝实验孔平均CPM值/对照孔CPM值。
3.3 支气管肺泡灌洗液中细胞成分分析 心脏放血处死动物后，结扎左侧支气管，通过气管套管用生理盐水灌洗右侧肺脏1.5 ml/次，共3次。回收支气管肺泡灌洗液，用血细胞计数板进行细胞总数计数。细胞离心涂片，Wright+Giemsa染色，进行细胞分类。
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3.4 组织学检查 用10%福尔马林1.5 ml经左侧支气管灌注固定肺组织，摘除左肺，石蜡包埋切片，HE染色，观察气道病理改变。
4 统计学处理
所有数据均以x±s表示，统计应用计量资料t检验和直线相关分析。总体比较采用方差分析。
结 果
1 激发后速发哮喘反应观察
模型组豚鼠在卵白蛋白吸入激发后呼吸明显加深加快，并出现烦燥不安，咳嗽，明显呼气性呼吸困难，甚至跌倒。以吸入后5～10 min最明显。环孢霉素A治疗组在卵白蛋白吸入激发后与模型组比较呼吸困难减轻，但仍有不同程度哮喘症状。
2 T淋巴细胞增殖实验
, http://www.100md.com 正常组、模型组、环孢霉素A组的刺激指数分别为4.09±0.97，8.58±1.5，5.08±1.09。模型组与正常组比较，有极显著差异(P<0.01)。环孢霉素A组与模型组比较，有极显著差异(P<0.01)。
3 支气管肺泡灌洗液中细胞成分分析
见表1。
表1 支气管肺泡灌洗液中细胞成分分析(x±s，n=7)
灌洗液回
收总量(ml)
细胞计数(×106/ml)
Total
AM
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N
L
EOS
正常组
3.39±0.35
3.93±0.67
3.44±0.54
0.15±0.06
0.19±0.14
0.16±0.07
模型组
3.41±0.31
, 百拇医药
8.79±1.5a
5.64±0.72a
0.34±0.18
0.30±0.13
2.45±0.61a
环孢霉素A组
3.44±0.24
5.36±1.68b
4.32±1.51
0.15±0.1
0.14±0.11
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0.75±0.32ab
Total 细胞总数，AM 单核巨噬细胞，N 中性粒细胞，L 淋巴细胞，EOS 嗜酸性粒细胞，a:与正常组比较P<0.01，b:与模型组比较P<0.01
4 组织学检查
光镜下观察模型组支气管、细支气管上皮细胞脱落、管腔可见粘栓间以嗜酸性粒细胞浸润。粘膜及粘膜下层、平滑肌外均可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润。环孢霉素A组偶见上皮细胞脱落，管腔内无粘液栓，管壁仅有少量炎细胞浸润。
5 相关分析
T淋巴细胞增殖刺激指数与灌洗液中嗜酸性粒细胞计数之间作直线相关分析，结果表明相关系数r＝0.7555(t＝3.056，P<0.01)，二者呈显著正相关。直线回归方程为：Y＝-0.9567+0.3518X。
, http://www.100md.com
讨 论
糖皮质激素抵抗型哮喘的治疗是临床上面临的一大难题。初步临床观察表明，小剂量环孢霉素A可以使激素抵抗型哮喘患者肺功能明显改善，激素用量减少[3]，但其确切机制尚不清楚。本实验模型组豚鼠不仅表现典型的速发哮喘反应，而且在卵白蛋白激发后24h表现了迟发哮喘反应的重要病理学特征即气道非特异性炎症。这与Gulbenkian[2]的结果一致。外周血T细胞处于明显活化状态，其增殖刺激指数显著高于正常组。这与Wasterman等[4]的结果一致。
本实验结果表明，环孢霉素A可以抑制哮喘豚鼠T细胞活化，并且因此抑制气道嗜酸性粒细胞炎症。这可能是环孢霉素A治疗迟发哮喘反应有效的机制之一。Arima等[5]报道环孢霉素A可以显著抑制与气道高反应性相关的迟发哮喘反应。有意义的是环孢霉素A可能通过与激素不同的机制抑制T细胞活化及气道炎症，Corrigan等[6]报道环孢霉素A可以抑制激素抵抗型哮喘之T细胞增殖和淋巴因子产生，而激素则不能。故环孢霉素A可能为哮喘尤其是激素抵抗型哮喘及难治哮喘提供新的治疗途径。
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参考文献
1 Corrigan CJ,Kay AB.T-Cell and eosinophil in the pathogenesis of asthma.Immunol Today,1992,13(2)∶501
2 Gulbenkian AR,Fernander X,Kreutner W,et al.Anaphylactic challenge cause eosinophil accumulation in bronchoalveolar lavage of guinea pigs.Am Rev Respir Dis,1990,142(3)∶680
3 Lock SH,Kay AB,Brarnes NC,et al.Double-blind placebo-controlled study of cyclosporin A as a corticosteroid sparing agent in corticosteroid-dependent asthma.Am J Respir Crit Care Med,1996,153(3)∶509
, 百拇医药
4 Wasterman S,Wu LJ,Ollevenstein R,et al.Association between late allergic bronchoconstriction in the rat and allergen-stimulated lymphocyte proliferation in vitro.Am J Respir Crit Care Med,1995，151(2)∶470
5 Arima M,Yukawa T,Terashi Y,et al.Cyclosporin A inhibit allergen-induced late asthmatic response and increase of airway hyperresponsiveness in guinea pigs.Nippon Kyobu Shikkan Gakkai Zasshi,1991,29(8)∶1089
6 Corrigan CJ,Brown&127;PH,Barnes NC,et al.Glucorticoid resistance in chronic asthma:peripherial blood T lymphocgte activation and comparison of the T lymphocgte inhibitory effects of glucocosteroid and cyclosporin A.Am Rev Respir Dis,1991,144(6)∶1026
(收稿：1998-09-29 修回：1999-03-17), 百拇医药