番荔枝内酯克服肿瘤多药抗药性作用及机制
作者：符立梧 杨安奎 潘启超 梁永钜 林广云1 谢方云
单位：(中山医科大学肿瘤防治中心，广州 510060)
关键词：番荔枝内酯；bullatacin；atemoyacin-A；多药抗药性；细胞凋亡；Fura-2
中国新药杂志990507 摘要 目的：探讨阿蒂莫耶番荔枝总内酯(AA)及其单体bullatacin和atemoyacin-A克服肿瘤多药抗药性(MDR)的作用及其机制。方法：用两对MDR 细胞株及其相应的敏感株进行对比研究。结果：AA及其单体具有极强的细胞毒作用，且对MDR细胞与其相应的敏感株的IC50相近(P>0.05)。加入AA，bullatacin和atemoyacin-A 能使MDR细胞内Fura-2分别增加2.39，3.14和3.24倍，但不能增加敏感细胞Fura-2 的积累量。细胞内阿霉素(ADR)的积累与Fura-2 相似，加入AA，bullatacin和atemoyacin-A均分别增加 MCF-7/ADR 细胞内 ADR 的积累至2.98，4.10和4.24倍，而未见显著增加敏感株内 ADR 的积累。bullatacin和atemoyacin-A均能诱导MCF-7与MCF-7/ADR细胞的凋亡，且相同浓度下，两细胞株的凋亡百分数无显著差异。MDR 细胞株与其相应的敏感株 bcl-2 蛋白表达水平均较低，且无明显差异。加入bullatacin 对MDR 细胞株与其相应的敏感株bcl-2 蛋白表达水平均未见明显影响。结论：AA及其单体对 MDR细胞无抗药性，其机制与增加MDR细胞内抗癌药物积累增加有关。AA诱导细胞凋亡的机制及诱导MDR细胞凋亡在克服肿瘤MDR中的作用有待进一步研究。
, http://www.100md.com
THE CIRCUMVENTION OF TUMOR MULTIDRUG RESISTANCE(MDR)BY
ANNONACEOUS ACETOGENINS AND ITS MECHANISM
Fu Liwu,Yang Ankui,Pan Qichao,et al.
(Center for Prevention and Treatment of Cancer,Sum Yatsen
University of Medical Sciences,Guangzhou 510060)
ABSTRACT OBJECTIVE：Annonaceous acetogenin and its principles including bullatacin and atemoyacin-A were obtained from atemoya plant.The study is aimed at exploration of the MDR circumvention and its mechanism of AA and its principles.METHODS:To compare the MDR cell lines with their parental sensitive cell lines including MCF-7/ADR cells,MCF-7 cells,KBv200 cells and KB cells.RESULTS:AA and bullatacin and atemoyacin-A,had very potent cytotoxicity to MCF-7/ADR,MCF-7,KBv200 and KB cells and the IC50 of MDR was similar to that of the parental sensitive cell lines.The endocellular Fura-2 increased to 2.39，3.14，and 3.24 fold respectively by addition of AA,bullatacin and atemoyacin-A and the accumulation of Dox in MCF-7/ADR cells was similar to that of Fura-2,increased to 2.98,4.10 and 4.24 fold respectively by AA,bullatacin，and atemoyacin-A while no in MCF-7 cells.The apoptosis of MCF-7 and MCF-7/ADR cells can be induced by both bullatacin and atemoyacin-A and no significant difference in apoptosis rate at similar concentrations.Bcl-2 protein expression of both MDR and their parental sensitive cells was low with no significant difference and do not affected by bullatacin.CONCLUSION:AA,bullatacin,and atemoyacin-A have no drug resistance to MDR cells and the mechanism for circumvention of MDR is related to increase of MDR cellular drug accumulation.Apoptotic action in circumvention of MDR will be studied in the future.
, 百拇医药
KEY WORDS Annonaceous acetogenin；Bullatacin；Atemoyacin-A；Multiple drug resistance；Apoptosis；Fura-2
多药抗药性(MDR) 是指肿瘤细胞对一种来源于天然的抗肿瘤药物产生抗药性的同时对结构和作用机制不同的多种天然来源的抗肿瘤药物产生交叉抗药性。已证实P-糖蛋白(P-gp)过度表达将药物外排是产生MDR的主要原因[1]。实际上，P-gp是一种依赖于三磷酸腺苷(ATP)的外排泵，能将抗癌药物从肿瘤细胞内排至细胞外， 从而使肿瘤细胞内的抗癌药物浓度降低，因此产生MDR。MDR是肿瘤化疗失败的主要原因，也是肿瘤化疗领域急需解决的难题。
理论上，克服MDR有二种途径：其一是寻找一些高效、低毒，能用于临床的MDR逆转剂。为了寻找逆转剂，人们已进行了较广泛的研究，发现部分钙通道阻滞剂、钙调素的抑制剂、环孢霉素类以及多种多样的亲脂性化合物在体外均具有部分或完全逆转MDR的作用，但却不能用于体内， 这主要是由于其毒副作用在体内不能达到逆转MDR的有效血药浓度。到目前为止，尚未找到可用于临床的理想逆转剂。其二是寻找一些对MDR细胞无抗药性的新的抗癌药物，目前正处于起步阶段，可能成为克服MDR的新的研究方向。
, 百拇医药
自1982年Jolad等发现第一个番荔枝内酯化合物后，对其研究进展很快,至今已发现这类化合物近200多种，它们具有多种生物学活性， 是目前报道中体内外抗癌活性最强的化合物之一。
番荔枝内酯类化合物的作用靶点为肿瘤细胞的线粒体，其机制为特异性地抑制肿瘤细胞的线粒体NADH的还原酶或氧化酶，从而阻断电子的传递，减少ATP的生成，抑制线粒体的供能功能[2]。
Coley等[3]报道MDR细胞内抗癌药物的积累呈能量依赖性，这提示细胞内ATP的供应量可能将影响P-gp的功能。
P-gp是一种依赖于ATP的抗癌药物外排泵， 而番荔枝内酯的作用是阻断呼吸链的传递，使细胞内ATP迅速减少。那么番荔枝内酯对MDR肿瘤是否有效？与其使 MDR细胞内的ATP迅速降低，从而使P-gp丧失其功能是否有关？本实验就此问题进行探讨。
, 百拇医药
材料与方法
1 材料
阿霉素(ADR)为华明制药厂产品，Fura-2，Fura-2-AM，噻唑兰(MTT)均为Sigma 公司产品。
华南植物研究所陈文森等从阿蒂莫耶植物种子中提取番荔枝总内酯(AA)，含量极为丰富(提取物占种子的4%)，从这种粗提物中分离得到12 种具有很强抗肿瘤活性的单体，其中10种为：bullatacin，asimicin，molvizarin，rollinicin，motrilin，desacetylu-varicin，neoannonin，cherimolin，almunequin，squamo-
cin-K ，2 种为新的AA，即atemoyacin-A和atemoyacin-B。这种粗提物中活性物质含量高，如bullatacin在本植物种子中含量为万分之五(而文献报道最高为十万分之五)[4,5]。
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阿蒂莫耶植物种子中AA可能不仅含有多种抗癌成份,而且活性还相当强。陈文森教授提供了AA及多种单体，以少许二甲基亚砜溶解，加磷酸缓冲液(PBS)配成所需浓度， 二甲基亚砜最终浓度不超过0.2%。
细胞系及细胞培养：MCF-7/ADR，MCF-7细胞株由北京肿瘤研究所赠送(来源于美国国立癌症研究所)，已证实MCF-7/ADR能稳定表达P-gp[6]，具有典型的MDR，对ADR的抗药性是敏感株的66倍。将其培养于DMEM培养液中，内含10%小牛血清，青霉素100 IU/ml和链霉素100 μg/ml，置于37℃含5%CO2的孵箱中培养。
KB细胞和KBv200细胞培养在含10%小牛血清的RPMI1640培养液内，置37℃含5%CO2温箱中培养。
KBv200细胞是用对长春新碱(VCR)敏感的KB细胞为亲本，通过诱变剂甲基磺酸乙酯剌激，然后在培养液中加入浓度递增的VCR诱导而得，在VCR浓度为200 nmol/L时生长良好，较KB细胞对VCR耐药100倍。
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KB细胞及KBv200细胞均为中国医学科学院药物研究所提供。
2 方法
2.1 细胞生长抑制实验 本实验以MTT法进行[7]。分别计算抑制细胞生长达50%时的药物浓度，以IC50值表示。
2.2 P-gp功能测定 Fura-2-AM(荧光试剂)是P-gp的底物，可被P-gp外排，使MDR细胞内的Fura-2 (Fura-2-AM在细胞内酯解为Fura-2和AM)积累减少。若P-gp的功能降低或丧失，MDR 细胞内 Fura-2积累则增加。分别加入5，1×10-2，1×10-2 μg/ml的AA，bullatacin，atemoyacin-A共同培养12h，收集细胞，按Fura-2-AM法进行[8]。
2.3 细胞内ADR积累的测定 分别加入5，1×10-2，1×10-2 μg/ml的AA，bullatacin，atemoyacin-A共同培养12h,收集细胞，以荧光分光光度计法进行测定[9]。
, 百拇医药
2.4 细胞凋亡的测定 分别加入5，1×10-2，1×10-2 μg/ml的AA，bullatacin，atemoyacin-A 共同培养12h，收集细胞，按流式细胞仪法进行测定[10]。
2.5 bcl-2蛋白表达测定 加入1×10-4 μg/ml的bullatacin 作用24h， 按流式细胞仪法测定[11]。
结 果
1 AA及单体对MDR细胞株及相应的敏感株生长的影响
结果表明这种AA及其单体具有较强的体外抗肿瘤作用，同时，以具有MDR的细胞株与敏感细胞株(MCF-7/ADR与MCF-7，KBv200与KB)的IC50进行比较，均无显著性差异(P>0.05)，表明MDR细胞株对AA及单体均无抗药性，见表1。
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表1 AA及单体对MDR细胞株及相应的敏感株细胞毒作用(
±s) 细胞株
IC50(μg/ml)
AA
bullatacin
atemoyacin-A
MCF-7
5.83±1.43
(3.67±1.36)×10-4
(0.99±0.37)×10-4
, 百拇医药
MCF-7
6.10±1.06a
(3.73±1.69)×10-4a
(0.85±0.32)×10-4a
/ADR
KB
3.64±0.79
(2.50±0.56)×10-5
(3.70±1.32)×10-6
KBv200
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3.58±0.81a
(2.43±0.80)×10-5a
(3.67±1.40)×10-6a
a:与相应的敏感株比较P>0.052 AA及单体增加MDR细胞内Fura-2积累的作用
敏感细胞MCF-7细胞内Fura-2的积累是MDR细胞MCF-7/ADR的3.8倍。加入AA，bullatacin，atemoyacin-A能使MDR细胞内Fura-2分别增加2.39，3.14，3.24倍，表明番荔枝内酯是P-gp的底物或影响着P-gp的功能，见表2。
表2 AA及单体增加MDR细胞内Fura-2积累的作用(
±s) 药 物
, 百拇医药
(浓度)/((μg/ml))
Fura-2 积累(nmol/106 cells)
Fura-2积累倍数
MCF-7
MCF-7/ADR
MCF-7
MCF-7/ADR
对照组
1.022±0.029
0.266±0.039
1.00
, 百拇医药
1.00
AA
5
1.009±0.028
0.635±0.166a
0.99
2.39
bullatacin
1×10-2
1.029±0.046
0.834±0.027a
, 百拇医药
1.00
3.14
atemoyacin-A
1×10-2
1.039±0.042
0.862±0.055a
1.02
3.24
a:与对照组比较P<0.013 AA及其单体对细胞内抗癌药物积累的影响
MCF-7细胞内ADR积累是MCF-7/ADR的4.9倍。AA，bullatacin，atemoyacin-A均显著增加MCF-7/ADR细胞内ADR的积累，而未见显著增加敏感株内ADR的积累，见表3。
, 百拇医药
表3 AA及单体对细胞内抗癌药物积累的影响(
±s，nmol/106cells) 药 物
浓度(μg/ml)
MCF-7
MCF-7/ADR
ADR积累倍数
MCF-7
MCF-7/ADR
对照组
2.099±0.094
0.408±0.046
, 百拇医药
1.00
1.00
AA
5
2.069±0.046
1.218±0.009a
0.99
2.98
bullatacin
1×10-2
2.074±0.048
1.671±0.144a
, 百拇医药
0.99
4.10
atemoyacin-A
1×10-2
2.064±0.023
1.732±0.118a
0.98
4.24
a:与对照组比较P<0.01
4 诱导细胞凋亡作用
bullatacin，atemoyacin-A和atemoyacin-B均能诱导MCF-7与MCF-7/ADR细胞的凋亡，MDR细胞株对番荔枝内酯无凋亡抗性，见表4。
, 百拇医药
表4 番荔枝内酯诱导细胞凋亡作用(
±s) 药 物
浓度(μg/ml)
凋亡 (%)
MCF-7
MCF-7/ADR
对照组
5.37±2.54
4.87±2.10
bullatacin
1×10-2
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40.23±5.21
40.17±1.10a
atemoyacin-A
1×10-2
55.73±12.97
52.30±5.56a
a:与相应的敏感株比较P>0.05 5 AA及单体对MDR细胞株及相应敏感株bcl-2蛋白表达的影响
MDR 细胞株与其相应的敏感株bcl-2蛋白表达水平均较低，且无明显差异。加入bullatacin 对MDR 细胞株与其相应的敏感株bcl-2蛋白表达水平均未见明显影响，见表5。
, 百拇医药
表5 AA及单体对MDR细胞株及相应敏感
株bcl-2蛋白表达的影响 acetogenin
浓度(μg/ml)
bcl-2蛋白 (%)
MCF-7
MCF-7/ADR
对照组
7.77±6.12
7.43±5.06
bullatacin
1×10-4
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6.83± 2.84
7.27±1.90a
a:与对照组比较P>0.05 讨 论
在体外实验中，不同的番荔枝内酯单体对不同的细胞株的抗肿瘤活性不同。作用时间3d，其IC50介于(1×10-5～1×10-7)μg/ml[12]。我们对AA研究表明，对不同的细胞株的IC50介于2.3～6.6 μg/ml，经腹腔注射的LD50为10.9 mg/kg，小于5.7 mg/kg的剂量，无动物死亡(资料未发表)。若这种化合物在体内不发生降解，完全能达到抗肿瘤浓度。bullatacin，atemoyacin-A均为番荔枝内酯的提取物，体外抗肿瘤活性很强。而番荔枝内酯对正常细胞I18(鼠消化道上皮细胞)无生长抑制作用或较小的细胞毒作用[13]。对正常鼠肝线粒体NADH氧化还原酶无抑制作用[14]，表明其细胞毒作用具有相对的特异性。Mclaughlin 实验表明番荔枝内酯的Ames试验阴性， 表明这种化合物可能不具有致突变作用。因此，这种番荔枝内酯可望开发成为新型抗肿瘤药物。
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我们以两对MDR的细胞株及其相对应的敏感株MCF-7/ADR与MCF-7, KBv200与KB进行研究，结果表明AA及其单体对 MDR 细胞无抗药性。Oberlies等[13]以耐ADR的M17/ADR细胞株及其相应的敏感株进行研究也得出相同的结论，可望将之开发成为治疗MDR肿瘤的新型药物。
由于番荔枝内酯在细胞内积累测定方法尚未建立，本研究发现AA及单体bullatacin和atemoyacin-A均能增加MDR 细胞内抗癌药物ADR的积累，而对敏感细胞内ADR的积累无影响。细胞内Fura-2测定也得出相似的结果，表明番荔枝内酯为P-gp的底物或干扰了P-gp的功能。
在能量缺乏时，MDR细胞对长春花碱及秋水仙碱的初始摄入率分别降低5倍及 4倍；但恢复供能时，秋水仙碱的外排速度大于5倍[15]。Fichtner等[16]指出罗丹明-123(rhodamine 123)在MDR细胞内的积累较相应的敏感株低，且呈能量依赖性，这表明可能存在着这样的一条通路：番荔枝内酯抑制线粒体NADH氧化还原酶，抑制线粒体呼吸链传递，使细胞产生能量迅速减少，而P-gp实际上是依赖于能量的药物排出泵，能量产生障碍影响P-gp的功能，最终导致P-gp功能丧失，由此来克服肿瘤MDR。
, 百拇医药
bullatacin和atemoyacin-A不仅可引起敏感细胞凋亡，而且也可引起MDR细胞凋亡。MCF-7和MCF-7/ADR的凋亡抑制蛋白bcl-2蛋白表达率均较低，且番荔枝内酯对bcl-2蛋白的表达均无影响。番荔枝内酯如何引发凋亡以及凋亡在克服MDR中所起的作用有待进一步研究。
参考文献
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, 百拇医药
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12 Fang XP, Rieser MJ, Gu ZM,et al. Annonaceous acetogenins.Phytochem Anal，1993，4(1)∶27
13 Oberlies NH, Jones JL, Corbett TH,et al.Tumor cell growth inhibition by several annonaceous acetogenins in an in vitro disk diffusion assay.Cancer Lett，1995，96(1)∶55
, 百拇医药
14 Morre DJ, de Cabo R,Farley C, et al. Mode of action of bullatacin, a potent antitumor acetogenin: inhibition of NADH oxidase activity of HeLa and HL-60, but not liver, plasma membranes.Life Sci，1995，56(5)∶343
15 Stein WD, Cardarelli C, Pastan I,et al. Kinetic evidence suggesting that the multidrug transporter differentially handles influx and efflux of its substrates.Mol Pharmacol，1994，45(4)∶763
16 Fichtner I, Stein U, Hoffmann J,et al.Characterization of four drug-resistant P388 sublines: resistance/sensitivity in vivo, resistance-and proliferation-markers, immunogenicity.Anticancer Res，1994，14(5A)∶1995
(收稿：1998-09-11 修回：1999-03-12), 百拇医药(符立梧 杨安奎 潘启超 梁永钜 林广云1 谢方云)
单位：(中山医科大学肿瘤防治中心，广州 510060)
关键词：番荔枝内酯；bullatacin；atemoyacin-A；多药抗药性；细胞凋亡；Fura-2
中国新药杂志990507 摘要 目的：探讨阿蒂莫耶番荔枝总内酯(AA)及其单体bullatacin和atemoyacin-A克服肿瘤多药抗药性(MDR)的作用及其机制。方法：用两对MDR 细胞株及其相应的敏感株进行对比研究。结果：AA及其单体具有极强的细胞毒作用，且对MDR细胞与其相应的敏感株的IC50相近(P>0.05)。加入AA，bullatacin和atemoyacin-A 能使MDR细胞内Fura-2分别增加2.39，3.14和3.24倍，但不能增加敏感细胞Fura-2 的积累量。细胞内阿霉素(ADR)的积累与Fura-2 相似，加入AA，bullatacin和atemoyacin-A均分别增加 MCF-7/ADR 细胞内 ADR 的积累至2.98，4.10和4.24倍，而未见显著增加敏感株内 ADR 的积累。bullatacin和atemoyacin-A均能诱导MCF-7与MCF-7/ADR细胞的凋亡，且相同浓度下，两细胞株的凋亡百分数无显著差异。MDR 细胞株与其相应的敏感株 bcl-2 蛋白表达水平均较低，且无明显差异。加入bullatacin 对MDR 细胞株与其相应的敏感株bcl-2 蛋白表达水平均未见明显影响。结论：AA及其单体对 MDR细胞无抗药性，其机制与增加MDR细胞内抗癌药物积累增加有关。AA诱导细胞凋亡的机制及诱导MDR细胞凋亡在克服肿瘤MDR中的作用有待进一步研究。
, http://www.100md.com
THE CIRCUMVENTION OF TUMOR MULTIDRUG RESISTANCE(MDR)BY
ANNONACEOUS ACETOGENINS AND ITS MECHANISM
Fu Liwu,Yang Ankui,Pan Qichao,et al.
(Center for Prevention and Treatment of Cancer,Sum Yatsen
University of Medical Sciences,Guangzhou 510060)
ABSTRACT OBJECTIVE：Annonaceous acetogenin and its principles including bullatacin and atemoyacin-A were obtained from atemoya plant.The study is aimed at exploration of the MDR circumvention and its mechanism of AA and its principles.METHODS:To compare the MDR cell lines with their parental sensitive cell lines including MCF-7/ADR cells,MCF-7 cells,KBv200 cells and KB cells.RESULTS:AA and bullatacin and atemoyacin-A,had very potent cytotoxicity to MCF-7/ADR,MCF-7,KBv200 and KB cells and the IC50 of MDR was similar to that of the parental sensitive cell lines.The endocellular Fura-2 increased to 2.39，3.14，and 3.24 fold respectively by addition of AA,bullatacin and atemoyacin-A and the accumulation of Dox in MCF-7/ADR cells was similar to that of Fura-2,increased to 2.98,4.10 and 4.24 fold respectively by AA,bullatacin，and atemoyacin-A while no in MCF-7 cells.The apoptosis of MCF-7 and MCF-7/ADR cells can be induced by both bullatacin and atemoyacin-A and no significant difference in apoptosis rate at similar concentrations.Bcl-2 protein expression of both MDR and their parental sensitive cells was low with no significant difference and do not affected by bullatacin.CONCLUSION:AA,bullatacin,and atemoyacin-A have no drug resistance to MDR cells and the mechanism for circumvention of MDR is related to increase of MDR cellular drug accumulation.Apoptotic action in circumvention of MDR will be studied in the future.
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KEY WORDS Annonaceous acetogenin；Bullatacin；Atemoyacin-A；Multiple drug resistance；Apoptosis；Fura-2
多药抗药性(MDR) 是指肿瘤细胞对一种来源于天然的抗肿瘤药物产生抗药性的同时对结构和作用机制不同的多种天然来源的抗肿瘤药物产生交叉抗药性。已证实P-糖蛋白(P-gp)过度表达将药物外排是产生MDR的主要原因[1]。实际上，P-gp是一种依赖于三磷酸腺苷(ATP)的外排泵，能将抗癌药物从肿瘤细胞内排至细胞外， 从而使肿瘤细胞内的抗癌药物浓度降低，因此产生MDR。MDR是肿瘤化疗失败的主要原因，也是肿瘤化疗领域急需解决的难题。
理论上，克服MDR有二种途径：其一是寻找一些高效、低毒，能用于临床的MDR逆转剂。为了寻找逆转剂，人们已进行了较广泛的研究，发现部分钙通道阻滞剂、钙调素的抑制剂、环孢霉素类以及多种多样的亲脂性化合物在体外均具有部分或完全逆转MDR的作用，但却不能用于体内， 这主要是由于其毒副作用在体内不能达到逆转MDR的有效血药浓度。到目前为止，尚未找到可用于临床的理想逆转剂。其二是寻找一些对MDR细胞无抗药性的新的抗癌药物，目前正处于起步阶段，可能成为克服MDR的新的研究方向。
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自1982年Jolad等发现第一个番荔枝内酯化合物后，对其研究进展很快,至今已发现这类化合物近200多种，它们具有多种生物学活性， 是目前报道中体内外抗癌活性最强的化合物之一。
番荔枝内酯类化合物的作用靶点为肿瘤细胞的线粒体，其机制为特异性地抑制肿瘤细胞的线粒体NADH的还原酶或氧化酶，从而阻断电子的传递，减少ATP的生成，抑制线粒体的供能功能[2]。
Coley等[3]报道MDR细胞内抗癌药物的积累呈能量依赖性，这提示细胞内ATP的供应量可能将影响P-gp的功能。
P-gp是一种依赖于ATP的抗癌药物外排泵， 而番荔枝内酯的作用是阻断呼吸链的传递，使细胞内ATP迅速减少。那么番荔枝内酯对MDR肿瘤是否有效？与其使 MDR细胞内的ATP迅速降低，从而使P-gp丧失其功能是否有关？本实验就此问题进行探讨。
, 百拇医药
材料与方法
1 材料
阿霉素(ADR)为华明制药厂产品，Fura-2，Fura-2-AM，噻唑兰(MTT)均为Sigma 公司产品。
华南植物研究所陈文森等从阿蒂莫耶植物种子中提取番荔枝总内酯(AA)，含量极为丰富(提取物占种子的4%)，从这种粗提物中分离得到12 种具有很强抗肿瘤活性的单体，其中10种为：bullatacin，asimicin，molvizarin，rollinicin，motrilin，desacetylu-varicin，neoannonin，cherimolin，almunequin，squamo-
cin-K ，2 种为新的AA，即atemoyacin-A和atemoyacin-B。这种粗提物中活性物质含量高，如bullatacin在本植物种子中含量为万分之五(而文献报道最高为十万分之五)[4,5]。
, http://www.100md.com
阿蒂莫耶植物种子中AA可能不仅含有多种抗癌成份,而且活性还相当强。陈文森教授提供了AA及多种单体，以少许二甲基亚砜溶解，加磷酸缓冲液(PBS)配成所需浓度， 二甲基亚砜最终浓度不超过0.2%。
细胞系及细胞培养：MCF-7/ADR，MCF-7细胞株由北京肿瘤研究所赠送(来源于美国国立癌症研究所)，已证实MCF-7/ADR能稳定表达P-gp[6]，具有典型的MDR，对ADR的抗药性是敏感株的66倍。将其培养于DMEM培养液中，内含10%小牛血清，青霉素100 IU/ml和链霉素100 μg/ml，置于37℃含5%CO2的孵箱中培养。
KB细胞和KBv200细胞培养在含10%小牛血清的RPMI1640培养液内，置37℃含5%CO2温箱中培养。
KBv200细胞是用对长春新碱(VCR)敏感的KB细胞为亲本，通过诱变剂甲基磺酸乙酯剌激，然后在培养液中加入浓度递增的VCR诱导而得，在VCR浓度为200 nmol/L时生长良好，较KB细胞对VCR耐药100倍。
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KB细胞及KBv200细胞均为中国医学科学院药物研究所提供。
2 方法
2.1 细胞生长抑制实验 本实验以MTT法进行[7]。分别计算抑制细胞生长达50%时的药物浓度，以IC50值表示。
2.2 P-gp功能测定 Fura-2-AM(荧光试剂)是P-gp的底物，可被P-gp外排，使MDR细胞内的Fura-2 (Fura-2-AM在细胞内酯解为Fura-2和AM)积累减少。若P-gp的功能降低或丧失，MDR 细胞内 Fura-2积累则增加。分别加入5，1×10-2，1×10-2 μg/ml的AA，bullatacin，atemoyacin-A共同培养12h，收集细胞，按Fura-2-AM法进行[8]。
2.3 细胞内ADR积累的测定 分别加入5，1×10-2，1×10-2 μg/ml的AA，bullatacin，atemoyacin-A共同培养12h,收集细胞，以荧光分光光度计法进行测定[9]。
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2.4 细胞凋亡的测定 分别加入5，1×10-2，1×10-2 μg/ml的AA，bullatacin，atemoyacin-A 共同培养12h，收集细胞，按流式细胞仪法进行测定[10]。
2.5 bcl-2蛋白表达测定 加入1×10-4 μg/ml的bullatacin 作用24h， 按流式细胞仪法测定[11]。
结 果
1 AA及单体对MDR细胞株及相应的敏感株生长的影响
结果表明这种AA及其单体具有较强的体外抗肿瘤作用，同时，以具有MDR的细胞株与敏感细胞株(MCF-7/ADR与MCF-7，KBv200与KB)的IC50进行比较，均无显著性差异(P>0.05)，表明MDR细胞株对AA及单体均无抗药性，见表1。
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表1 AA及单体对MDR细胞株及相应的敏感株细胞毒作用(
±s) 细胞株IC50(μg/ml)
AA
bullatacin
atemoyacin-A
MCF-7
5.83±1.43
(3.67±1.36)×10-4
(0.99±0.37)×10-4
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MCF-7
6.10±1.06a
(3.73±1.69)×10-4a
(0.85±0.32)×10-4a
/ADR
KB
3.64±0.79
(2.50±0.56)×10-5
(3.70±1.32)×10-6
KBv200
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3.58±0.81a
(2.43±0.80)×10-5a
(3.67±1.40)×10-6a
a:与相应的敏感株比较P>0.052 AA及单体增加MDR细胞内Fura-2积累的作用
敏感细胞MCF-7细胞内Fura-2的积累是MDR细胞MCF-7/ADR的3.8倍。加入AA，bullatacin，atemoyacin-A能使MDR细胞内Fura-2分别增加2.39，3.14，3.24倍，表明番荔枝内酯是P-gp的底物或影响着P-gp的功能，见表2。
表2 AA及单体增加MDR细胞内Fura-2积累的作用(
±s) 药 物, 百拇医药
(浓度)/((μg/ml))
Fura-2 积累(nmol/106 cells)
Fura-2积累倍数
MCF-7
MCF-7/ADR
MCF-7
MCF-7/ADR
对照组
1.022±0.029
0.266±0.039
1.00
, 百拇医药
1.00
AA
5
1.009±0.028
0.635±0.166a
0.99
2.39
bullatacin
1×10-2
1.029±0.046
0.834±0.027a
, 百拇医药
1.00
3.14
atemoyacin-A
1×10-2
1.039±0.042
0.862±0.055a
1.02
3.24
a:与对照组比较P<0.013 AA及其单体对细胞内抗癌药物积累的影响
MCF-7细胞内ADR积累是MCF-7/ADR的4.9倍。AA，bullatacin，atemoyacin-A均显著增加MCF-7/ADR细胞内ADR的积累，而未见显著增加敏感株内ADR的积累，见表3。
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表3 AA及单体对细胞内抗癌药物积累的影响(
±s，nmol/106cells) 药 物浓度(μg/ml)
MCF-7
MCF-7/ADR
ADR积累倍数
MCF-7
MCF-7/ADR
对照组
2.099±0.094
0.408±0.046
, 百拇医药
1.00
1.00
AA
5
2.069±0.046
1.218±0.009a
0.99
2.98
bullatacin
1×10-2
2.074±0.048
1.671±0.144a
, 百拇医药
0.99
4.10
atemoyacin-A
1×10-2
2.064±0.023
1.732±0.118a
0.98
4.24
a:与对照组比较P<0.01
4 诱导细胞凋亡作用
bullatacin，atemoyacin-A和atemoyacin-B均能诱导MCF-7与MCF-7/ADR细胞的凋亡，MDR细胞株对番荔枝内酯无凋亡抗性，见表4。
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表4 番荔枝内酯诱导细胞凋亡作用(
±s) 药 物浓度(μg/ml)
凋亡 (%)
MCF-7
MCF-7/ADR
对照组
5.37±2.54
4.87±2.10
bullatacin
1×10-2
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40.23±5.21
40.17±1.10a
atemoyacin-A
1×10-2
55.73±12.97
52.30±5.56a
a:与相应的敏感株比较P>0.05 5 AA及单体对MDR细胞株及相应敏感株bcl-2蛋白表达的影响
MDR 细胞株与其相应的敏感株bcl-2蛋白表达水平均较低，且无明显差异。加入bullatacin 对MDR 细胞株与其相应的敏感株bcl-2蛋白表达水平均未见明显影响，见表5。
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表5 AA及单体对MDR细胞株及相应敏感
株bcl-2蛋白表达的影响 acetogenin
浓度(μg/ml)
bcl-2蛋白 (%)
MCF-7
MCF-7/ADR
对照组
7.77±6.12
7.43±5.06
bullatacin
1×10-4
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6.83± 2.84
7.27±1.90a
a:与对照组比较P>0.05 讨 论
在体外实验中，不同的番荔枝内酯单体对不同的细胞株的抗肿瘤活性不同。作用时间3d，其IC50介于(1×10-5～1×10-7)μg/ml[12]。我们对AA研究表明，对不同的细胞株的IC50介于2.3～6.6 μg/ml，经腹腔注射的LD50为10.9 mg/kg，小于5.7 mg/kg的剂量，无动物死亡(资料未发表)。若这种化合物在体内不发生降解，完全能达到抗肿瘤浓度。bullatacin，atemoyacin-A均为番荔枝内酯的提取物，体外抗肿瘤活性很强。而番荔枝内酯对正常细胞I18(鼠消化道上皮细胞)无生长抑制作用或较小的细胞毒作用[13]。对正常鼠肝线粒体NADH氧化还原酶无抑制作用[14]，表明其细胞毒作用具有相对的特异性。Mclaughlin 实验表明番荔枝内酯的Ames试验阴性， 表明这种化合物可能不具有致突变作用。因此，这种番荔枝内酯可望开发成为新型抗肿瘤药物。
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我们以两对MDR的细胞株及其相对应的敏感株MCF-7/ADR与MCF-7, KBv200与KB进行研究，结果表明AA及其单体对 MDR 细胞无抗药性。Oberlies等[13]以耐ADR的M17/ADR细胞株及其相应的敏感株进行研究也得出相同的结论，可望将之开发成为治疗MDR肿瘤的新型药物。
由于番荔枝内酯在细胞内积累测定方法尚未建立，本研究发现AA及单体bullatacin和atemoyacin-A均能增加MDR 细胞内抗癌药物ADR的积累，而对敏感细胞内ADR的积累无影响。细胞内Fura-2测定也得出相似的结果，表明番荔枝内酯为P-gp的底物或干扰了P-gp的功能。
在能量缺乏时，MDR细胞对长春花碱及秋水仙碱的初始摄入率分别降低5倍及 4倍；但恢复供能时，秋水仙碱的外排速度大于5倍[15]。Fichtner等[16]指出罗丹明-123(rhodamine 123)在MDR细胞内的积累较相应的敏感株低，且呈能量依赖性，这表明可能存在着这样的一条通路：番荔枝内酯抑制线粒体NADH氧化还原酶，抑制线粒体呼吸链传递，使细胞产生能量迅速减少，而P-gp实际上是依赖于能量的药物排出泵，能量产生障碍影响P-gp的功能，最终导致P-gp功能丧失，由此来克服肿瘤MDR。
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bullatacin和atemoyacin-A不仅可引起敏感细胞凋亡，而且也可引起MDR细胞凋亡。MCF-7和MCF-7/ADR的凋亡抑制蛋白bcl-2蛋白表达率均较低，且番荔枝内酯对bcl-2蛋白的表达均无影响。番荔枝内酯如何引发凋亡以及凋亡在克服MDR中所起的作用有待进一步研究。
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(收稿：1998-09-11 修回：1999-03-12), 百拇医药(符立梧 杨安奎 潘启超 梁永钜 林广云1 谢方云)